Summary
Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.
Abstract
In tutti gli animali, l'immunità innata fornisce un immediato e robusta difesa contro un ampio spettro di agenti patogeni. Le risposte immunitarie umorali e cellulari sono i rami principali dell'immunità innata, e molti dei fattori che regolano queste risposte sono evolutivamente conservate tra gli invertebrati e mammiferi. Fagocitosi, il componente centrale di immunità innata cellulare, viene effettuata da cellule di sangue specializzate del sistema immunitario. Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come un potente modello genetico per studiare i meccanismi molecolari e fisiologici degli impatti della fagocitosi in animali interi. Qui dimostriamo un test di fagocitosi in vivo basati su iniezione per quantificare l'assorbimento delle particelle e la distruzione di cellule del sangue di Drosophila , emociti. La procedura permette ai ricercatori di controllare con precisione la concentrazione di particelle e la dose, che permette di ottenere risultati altamente riproducibili in un breve lasso di tempo. L'esperimento è quantitativa, facile da eseguire e può essere applicato per schermo per fattori ospite che influenza patogeno riconoscimento, assorbimento e liquidazione.
Introduction
Difese immunitarie innate formano la prima linea di difesa contro i microbi patogeni. Queste risposte possono essere diviso funzionalmente in immunità innata umorale e cellulare, entrambi i quali sono mediati da recettori di riconoscimento modello germinale-codificato (PRRs) che senso pathogen-associated molecular pattern (PAMP)1. Molte delle vie di segnalazione e meccanismi effettori dell'immunità innata sono conservati nei mammiferi e invertebrati, come il nematode, elegans di Caenorhabditis e la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster2. Moscerino della frutta è emerso come un potente sistema di difesa dell'ospite contro microrganismi infettivi3di studiare. Drosophila è geneticamente trattabile, facilmente ed a buon mercato allevati nei laboratori e ha un tempo di generazione breve. Inoltre, la Mosca della frutta esibisce altamente efficienti difese contro una matrice di microbi, che consente l'esame dell'immunità ospite contro gli agenti patogeni virali, batterici, fungini o parassitari.
Drosophila immunologi hanno storicamente utilizzato avanti schermi genetici, genoma mediata da RNA interferenza (RNAi) proiezione di linee cellulari di insetto e pre-esistente ceppi mutanti volare per esaminare l'immunità innata – che conduce la identificazione e caratterizzazione di diverse vie immuni umorali evolutivamente conservati4,5,6,7,8. La risposta immunitaria innata umorale è, senza dubbio, il migliore caratterizzata difesa immunitaria nei moscerini della frutta. A seguito di infezione, la risposta umorale conduce alla produzione e rilascio sistemico di peptide antimicrobico molecole (AMP) nell'emolinfa, il sangue equivalente negli insetti. Amplificatori sono prodotte da pedaggio altamente conservata e Imd vie di segnalazione. La via di pedaggio è omologo al mammifero segnalazione del ricevitore TLR/IL-1R e pathway Imd è omologo alla segnalazione di fattore di necrosi tumorale-alfa dei mammiferi. In Drosophila, pedaggio segnalazione è indotto da batteri Gram-positivi e funghi Drosophila X virus6,9,10 e Imd segnalazione è indotta da batteri gram-negativi11 ,12.
Immunità cellulare, composto di incapsulamento, melanizzazione e fagocitosi dei patogeni invasivi, eseguiti da cellule specializzate del sangue chiamate emociti13. Ci sono tre classi di emociti nel moscerino della frutta: cristallo celle, lamellocytes e plasmatocytes13. Crystal cellule, che costituiscono il 5% degli emociti circolanti nelle larve, rilasciano enzimi proPhenoloxidase (proPO) che conduce la melanizzazione degli agenti patogeni e tessuti dell'ospite presso siti ferita. Lamellocytes, che non si trovano in embrioni sani o larve, sono cellule aderenti che incapsulano oggetti estranei. Queste cellule sono indotte su pupariation o quando parassitanti Vespa uova sono depositate nelle larve. Plasmatocytes fagocitaria, che compongono il 95% del circolante emociti nelle larve e tutti i rimanenti emociti negli adulti, gioca un ruolo nel rimodellamento durante lo sviluppo del tessuto e, in particolare, servire come cellula effettore principale della drosofila l'immunità cellulare.
Fagocitosi un'immediato e fondamentale linea di difesa immunitaria innata; i microbi che violano la barriera epiteliale di host sono rapidamente inghiottiti ed eliminati dalle cellule fagocitiche del sangue (per una rassegna completa di biologia delle cellule della fagocitosi vedere riferimento 14). Questo processo è iniziato quando il riconoscimento di pattern con codifica germline recettori (PRRs) su emociti riconoscono patogeni associati pattern molecolari (PAMPs) di microbi. Una volta legato ai loro target, PRRs avviare cascate di segnalazione che portano alla formazione di pseudopodi attraverso actina citoscheletrica rimodellamento. Pseudopodi circondano il microbo, che successivamente viene inghiottito e interiorizzato in un organello nascente phagosome. I microbi sono distrutti come phagosome subisce il processo di maturazione del fagosoma quando phagosome è trafficata verso l'interno degli emociti e acidifica attraverso una serie di interazioni con i lisosomi. In vitro e cella studi di biologia in cellule di mammifero primario sono stati strumentali nell'identificazione e caratterizzazione di fattori che regolano la fagocitosi, come il ricevitore di Fc-gamma dei mammiferi e C3b recettori15,16. Tuttavia, la possibilità di eseguire grandi schermi o studi in vivo sono limitati nei sistemi mammiferi.
Qui presentiamo un test in vivo per la fagocitosi in adulti mosche della frutta, che si basa su una procedura introdotta dal laboratorio di David Schneider nel 200017. Il laboratorio di Schneider ha mostrato che sessile emociti cluster lungo il vaso dorsale addominale prontamente fagocitare batteri e perle di polistirolo. Per visualizzare la fagocitosi, mosche sono iniettati con fluorescente contrassegnate particelle (come e. coli etichettati con isotiocianato di fluorescina (e. coli -FITC)), incubate per 30 minuti permettere emociti di fagocitare le particelle e poi iniettato con trypan blu, che disseta la fluorescenza delle particelle non phagocytosed durante il periodo di incubazione. Volare navi dorsale sono quindi Imaging utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza. Questa carta seminale, utilizzando un esperimento relativamente semplice, ha dimostrato che emociti fagocitare batteri e granuli di lattice, che fagocitosi batterica possono essere inibite iniettando pre-Vola con granuli di lattice, e che vola senza sia cellulare ed umorale le risposte immunitarie sono suscettibili anche di e. coli. L'analisi presentata in questo rapporto si basa sul lavoro del laboratorio Schneider per quantificare in vivo fagocitosi misurando l'intensità della fluorescenza delle particelle inghiottito da emociti vaso dorsale associato.
Simile all'approccio adottato nei sistemi mammiferi, Drosophila genetisti inizialmente utilizzato genoma schermi RNAi in vitro per identificare i geni richiesti per la risposta immunitaria cellulare18,19,20 ,21,22,23. Tuttavia, lo sviluppo del dosaggio adulto fagocitosi in vivo attivato follow-up esperimenti per essere prontamente effettuati in animali interi, consentendo ai ricercatori di verificare il biologico il ruolo dei fattori individuati negli studi in vitro. Tale era il caso con il recettore transmembrana Eater, che è stato prima identificato come un recettore batterico in un schermo di RNAi utilizzando S2 cellule24 e poi più tardi mostrato a mediare Escherichia coli (Escherichia coli),, Enterococcus faecalis, e fagocitosi di Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) in adulti25.
Il nostro laboratorio impiegato il test di fagocitosi in vivo in avanti schermi genetici e studi di associazione genome-wide (usando il pannello di riferimento genetico drosofila (DGRP)) per identificare nuovi geni che regolano la fagocitosi in adulti emociti. Questi studi hanno portato alla caratterizzazione i recettori PGRP-SC1A e PGRP-SA26, la vescicola intracellulare traffico proteina Rab1427, il trasportatore del glutammato Polifemo28e RNA-proteina Fox-129.
Anticipiamo che futuri schermi che incorporano la fagocitosi in vivo potrebbero portare all'identificazione di ulteriori geni che sono importanti per la risposta immunitaria cellulare in drosofila. Schermate mediante linee inbred completamente sequenziato, ad esempio la DGRP o la drosofila sintetico popolazione risorsa (DSPR), possono identificare varianti naturali che influenzano lo sviluppo di fagocitosi o emociti. Inoltre, la tecnica potrebbe essere adottata in altre specie di Drosophila o utilizzata per nuove risorse comunitarie di schermo, ad esempio la raccolta di 250 specie di Drosophila mantenuto dal National Drosophila specie Stock Center (NDSSC ) alla Cornell. Questi esperimenti possono essere effettuati utilizzando fluorescente etichettati batteriche o fungine-parete bioparticelle che sono commercialmente disponibili o possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi numero di specie batteriche o fungine – fornito che il microbo esprime marcatori fluorescenti .
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Protocol
1. preparare le particelle della fluorescina per iniezione
- Ricostituire 10mg di commercialmente disponibili, calore-uccisi batteri particelle etichettate con fluoresceina (Vedi Tabella materiali) ad una concentrazione stock di 10 mg/mL aggiungendo 990 µ l sterile 1X PBS e 10 µ l 50 mM sodio azide. Vortice di mescolare.
- Dividere in aliquote di µ l 8 monouso in provette da 0,2 mL e conservare in una scatola scura a 4 ° C per ridurre al minimo la sensibilità alla luce associata.
Nota: Conservante sodio azide è facoltativa e può essere omesso se gli stock di 10 mg/mL sono realizzati con 1 mL di PBS 1X sterile, aliquotati e conservati a-20 ° C.
- Dividere in aliquote di µ l 8 monouso in provette da 0,2 mL e conservare in una scatola scura a 4 ° C per ridurre al minimo la sensibilità alla luce associata.
- Fare un 10 mL di soluzione di 5% colorante alimentare in PBS 1X mescolando 500 µ l siringa filtrata cibo verde colorazione e 9,5 mL sterile 1X PBS.
- Lavare le particelle prima dell'iniezione per rimuovere sodio azide. Sterile 1 µ l di mix 42 x PBS e 8 µ l di 10 mg/mL in una provetta da 1,7 mL. Centrifugare a massima velocità per 2,5 min a temperatura ambiente.
- Eliminare il surnatante, aggiungere 50 µ l 1 x PBS e centrifuga a velocità max per 2,5 min a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi da 1.3 e 1.3.1 x 2, per un totale di 3 lavaggi.
- Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere le particelle a 1,6 mg/mL in 50 µ l di 5% colorante alimentare in PBS 1X.
- Avvolgere il tubo in alluminio per proteggerlo dalla luce. Conservare a 4 ° C, gettare dopo 1 settimana.
2. preparare la stazione di iniezione e mosche
- Preparare il tampone di iniezione. Per iniettare fino a 4 genotipi di mosche allo stesso tempo, uso laboratorio nastro per dividere una rettangolare CO2 Mosca pad in 4 sezioni. Sulla panchina vicino al microscopio, designare le zone per posizionare le fiale una volta mosche sono stati allineati sul pad (uno per ogni angolo del pad).
- Preparare i flaconcini di pari età, 4-7 giorni-vecchie, mosche per iniezione. Per ogni sforzo essere testato, trasferire 5 maschi e 5 femmine in una fiala di fresca, con etichetta di cibo preparato Vola e mantenere a 25 ° C.
- Preparare l'iniettore pneumatico (Vedi Tabella materiali) impostando lo strumento su una modalità temporizzata di 100 ms (brevi raffiche di pressione del gas per espellere il liquido – che consentono la fornitura di sub-nanolitro volumi).
- Preparare i vetrini di microscopio. Tagliare le strisce di 1,5 pollici di nastro isolante, piegare in un ciclo con il lato adesivo fuori e posto su un vetrino da microscopio con etichetta.
3. preparare gli aghi capillare di vetro
- Tirare gli aghi di vetro (tubi capillari in vetro parete sottile) utilizzando un estrattore di ago.
- Tenere l'ago sotto il microscopio con un micrometro e rompere la punta con una pinzetta #5 punta fine in acciaio inox. 100 µm suggerimenti sono sufficienti per perforare la cuticola della Mosca mentre minimizza il ferimento.
- Misurare il volume di liquido che sarà iniettato in ogni volo. Caricare l'ago con colorante in 1X PBS sterile 5% alimentare ed espellere il liquido su una goccia di olio minerale su un micrometro di 0,01 mm.
Nota: Se la goccia di liquido è sferica, il volume in picolitri è calcolato come (dimensione)3/1910. 30 un ago con un diametro di 100 µm espellerà ~ 2 nL a 100 ms.
4. iniettare mosche
- Pipettare 10 µ l di particelle di 1,6 mg/mL su una piccola piazza di parafilm.
- Tirare il liquido nell'ago e montare l'ugello iniettore (Vedi Tabella materiali).
- Anestetizzare mosche con CO2 e metterli in fila nella loro area designata su flypad, con il lato ventrale verso l'alto e le teste orientate verso la parte anteriore del pad. Posizionare fiale nelle aree corrispondenti in panchina.
- Iniettare mosche nell'angolo superiore dell'addome con 5, ms 100 pompe di liquido (totale di ~ 10 nL).
- Trasferire le mosche iniettate alle fiale appropriate, il tempo di notare sul flacone. Conservare a 25 ° C.
- Caricare un nuovo ago con 0,4% soluzione di blu di Trypan.
- Impostare l'iniettore pneumatico GATED, che permette un flusso costante di aria per spingere il liquido fuori l'ago.
- Anestetizzare mosche dopo che essi hanno riposato per 30 min e iniettare con Trypan Blue, fino a quando l'addome è completo e dilatato.
Nota: Quando si esamina la maturazione del fagosoma con particelle marcate con un colorante sensibile al pH, consente mosche a riposare per 1 h e non iniettare con trypan blu prima di montaggio mosche. - Montare mosche su vetrini da microscopio con del nastro isolante, lato ventrale verso il basso. Spingere le ali al lato della Mosca e fissarli al nastro. Inoltre, spingere delicatamente la testa nel nastro per garantire che non si muoverà al volo.
- Passare immediatamente alla fase 5.
5. imaging mosche
- Immagine Vola, uno alla volta, a x 25 o 32 x ingrandimento, utilizzando un microscopio di fluorescenza invertito collegato a una fotocamera digitale e computer (Vedi Tabella materiali). Concentrarsi sul vaso dorsale della Mosca utilizzando software per computer per la fotocamera digitale.
- Registrare il tempo di esposizione e l'ingrandimento tra esperimenti.
Nota: Perdere traccia dei genotipi è una potenziale fonte di errore quando si fotografano ceppi multipli in una sola seduta. Per evitare un'etichettatura erronea mosche, annotare il numero dell'immagine della prima e l'ultima fotografia Vola per ciascun genotipo.
6. quantificare e normalizzare la fluorescenza
- Aprire il software e aprire una sola immagine alla volta.
- Misurare l'intensità di fluorescenza del vaso dorsale. Disegnare un poligono attorno al vaso dorsale. Selezionare misura e registra l'intensità della fluorescenza all'interno del poligono.
- Determinare l'intensità di fluorescenza di fondo. Copiare il primo poligono e spostarlo in un'area adiacente al vaso dorsale della Mosca. Selezionare la misura e l'intensità di fluorescenza record della zona di sfondo.
- Normalizzare la fluorescenza del vaso dorsale di fluorescenza di fondo:
Priorità bassa di ÷ vaso dorsale. - Calcolare la che media normalizzati intensità di fluorescenza del vaso dorsale di tutte le mosche in un ceppo.
- Ripetere l'esperimento 2 volte.
- Uso uno studente di spaiati t-test per confrontare le intensità media di fluorescenza relativa di controllo mosche e testare Vola da tre esperimenti. Calcolare la dimensione dell'effetto utilizzando la formula: Cohen d = (M1- M2) ÷ SDpool, dove M1 è la media di genotipo 1 e M2 è la media del genotipo 2 &
SD in pool =
dove SD1 è la deviazione standard di genotipo 1 e SD2 è la deviazione standard di genotipo 2.
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Representative Results
Un disegno schematico del dosaggio fagocitosi in vivo utilizzando particelle della fluorescina-labeled è mostrato in Figura 1A. Le mosche sono montati sul lato ventrale verso il basso su un pezzo di nastro isolante e i primi due segmenti dell'addome, dove il vaso dorsale si trova, è chiaramente visibile (Figura 1B). Principali fonti di errore sperimentale derivano alle fasi della procedura (Figura 1) di formazione immagine e l'iniezione. Usando lo stesso ago per iniettare più mosche può indurrla ad occludersi con tessuto volo o particelle (pannello superiore sinistro nella Figura 1). Perché Drosophila auto-reagisce sotto la luce GFP, mosche iniettati con un ago intasato saranno reagiscono debolmente ma manca la fluorescenza chiara, punctata delle particelle interiorizzate di emociti. Un'altra potenziale fonte di errore sperimentale può verificarsi durante le iniezioni di Trypan Blue. Trenta minuti dopo la prima iniezione con particelle con etichetta fluorescente, mosche ricevano una seconda iniezione con Trypan Blue, che disseta la fluorescenza delle particelle extracellulari, ONU-fagocitate. L'intensità di fluorescenza relativa per ogni volo è calcolato dividendo la fluorescenza del vaso dorsale per quella di un'area adiacente di uguali dimensione sull'addome. Mosche che non ricevono abbastanza Trypan Blue reagiscono in brillantemente nel corso del loro intero addome (pannello sinistro inferiore della Figura 1). Questa fluorescenza brillante può ridurre il rapporto del vaso dorsale alla fluorescenza di fondo, diminuendo così il rapporto di intensità di fluorescenza vero dell'animale. Infine, mosche dovrebbero essere fotografati mentre immobilizzato di CO2, come muoversi attivamente Vola produrre immagini sfocate che non possono essere quantificate (superiore e inferiore, pannelli di Figura 1a destra).
La collezione di Zuker è un pannello di methanesulfonate etilico (SME) trattati Vola con mutazioni autosomiche. 31 , originariamente creato come una risorsa della Comunità nel 2004, le linee sono state utilizzate per realizzare schermi genetici inverso e diretta. Il nostro laboratorio ha identificato una linea dalla raccolta Zuker che è in grado di fagocitare gram-negativi (Escherichia coli ceppo K-12) e batteri Gram-positivi (Staphylococcus aureus legno ceppo senza proteina A) (Figura 2). Questo mutante, chiamato argus, non mostra quasi nessuna fluorescenza del vaso dorsale nel test di fagocitosi in vivo. Rispetto al ceppo isogeniche sfondo Zuker, cn bw, argus Mostra significativamente meno l'assorbimento di e. coli (p-valore = 0,019; Di Cohen d = 1.677) e S. aureus (p-valore = 0,0083; Cohen d = 1.672). Argus fagocitosi batterica sono anche significativamente alterata, e. coli (p-valore = 0,045; Cohen d = 0.850) e S. aureus (p-valore = 0.0136; Cohen d = 1.422) rispetto ad un altro comune sforzo di controllo di laboratorio, Canton-S.
Figura 1: Descrizione e immagini rappresentative di test di fagocitosi in vivo. R. schematica del test di fagocitosi in vivo utilizzando particelle della fluorescina-etichettati. Due iniezioni, 30 minuti a parte, vengono utilizzati per riconoscimento delle particelle visualizzato in quel momento e l'assorbimento dai globuli dorsale associate. B. luce bianca immagine mostrando una Mosca montata su nastro, con segmenti addominali anteriori chiaramente visibile. C. esempio nelle immagini di fagocitosi vivo. (in alto a sinistra) Una Mosca iniettata con un ago intasato non ha alcuna fluorescenza delle particelle. (inbasso a sinistra) Una Mosca con alta fluorescenza extracellulare a causa di insufficiente trypan blu. (inalto a destra) Una Mosca di immobilizzare senza fluorescenza extracellulare – immagine ideale. (inbasso a destra) Volare in un movimento come svanisce il CO2 anestesia crea un'immagine sfocata. Barra della scala, 0,2 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Mosche fagocitosi dei batteri in mutanti e di controllo. R. immagini rappresentative dei batteri fagocitosi etichettati con fluoresceina; Escherichia coli (pannello superiore) e S. aureus (pannello inferiore). B. il rapporto di intensità di fluorescenza di mosche iniettato con fluorescina - particelle die. coli . C. il rapporto di intensità di fluorescenza di mosche iniettato con fluorescina - particelle diS. aureus . n = 3 esperimenti per ogni tipo di batteri, con 6-8 mosche ogni esperimento. Barre di errore, ± SEM. Statistical analysis = due code t -test. Barra della scala, 0,2 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Commercialmente disponibile, fluorescente contrassegnate particelle sono utilizzate per valutare la fagocitosi in generale (0,2 µm per volta carbossilato microsfere) o fagocitosi dei microbi (calore - fluorescente etichettati o chimicamente uccisi batteri o lieviti). Per valutare la maturazione del fagosoma, i ricercatori possono selezionare particelle marcate con un colorante di pH-sensibile che reagisce in quando il pH si abbassa da neutro ad acido, come il phagolysosome. In alternativa, per esaminare i passi iniziali di fagocitosi, riconoscimento di agente patogeno e l'assorbimento, i ricercatori dovrebbero scegliere le particelle etichettate con tag fluorescente che reagiscono in dentro e fuori le cellule.
Condizioni sperimentali attentamente controllate sono fondamentali affinché che il test di fagocitosi in vivo è effettuato in maniera riproducibile. In primo luogo, Drosophila subisce immunosenescenza cellulare32, così mosche utilizzati nell'esperimento dovrebbero essere di pari età, in modo ottimale all'interno di una gamma di 4-7 giorni di età. In secondo luogo, il periodo tra le iniezioni deve essere coerenza. Fagocitosi avviene rapidamente, pochi minuti della cellula ospite percepisce il microbo14. Nell'ora successiva, maturazione del fagosoma si svolge, che conduce l'acidificazione di phagosome e distruzione del microbo interiorizzato. Designazione di un intervallo di attesa tra iniezioni riduce la variabilità sperimentale e permette confronti tra ceppi e gli esperimenti condotti in giorni diversi. Si consiglia di attendere trenta minuti quando usando particelle della fluorescina e un'ora per il dosaggio di maturazione del fagosoma in vivo utilizzando particelle marcato con colorante fluorescente pH sensibili.
Usando lo stesso ago per iniettare più ceppi assicura che tutte le mosche ricevano la stessa dose di particelle e variabilità sperimentale può sorgere se vetro aghi rottura o intasarsi. Così, impostazione della stazione di iniezione e mosche in anticipo è fondamentale per garantire che i test di fagocitosi in vivo è effettuato rapidamente e in modo efficiente. Prima di iniziare l'esperimento, misurare il volume di liquido espulso dagli aghi diversi e mantenere un set di aghi della stessa dimensione. Così, se un ago si rompe tra le iniezioni, può essere sostituito immediatamente. Inoltre, gli aghi intasati possono portare a risultati falsi negativi, rendendo difficile distinguere tra cui emociti sono in grado di fagocitare microbi mosche e mosche che non hanno ricevuto particelle fluorescenti. Tinture per soluzioni su misura con colorante alimentare verde, rendono più facile per tenere traccia di quali mosche sono state iniettate e identificare i problemi con aghi ostruiti. Idealmente, l'esperimento deve essere eseguito più volte, con almeno 6-8 mosche al ceppo in ogni esperimento, e i risultati degli esperimenti rispetto ad per identificare outlier. Infine, abbastanza tripan blu deve essere somministrato per placare completamente la fluorescenza delle particelle extracellulari affinché la fluorescenza di fondo è paragonabile tra mosche (Figura 1).
Quando imaging mosche, dovrebbe anche prestare attenzione per ottenere immagini chiare e coerenti del vaso dorsale. Nastro isolante nero viene utilizzato per creare uno sfondo scuro e mosche dovrebbero essere montato dal lato ventrale verso il basso, con le loro ali e teste fissate al lato adesivo del nastro. Se possibile, mosche dovrebbero rimanere immobilizzati sotto CO2 , mentre le immagini sono prese. Infine, per limitare la possibilità di polarizzazione sperimentale, si consiglia di utilizzare un setup sperimentale accecato; dove fiale e ceppi sono codificati da un ricercatore e l'esperimento è effettuato e quantificato da un altro ricercatore.
Il test di fagocitosi in vivo è un utile strumento per identificare i difetti globali nella fagocitosi. Tuttavia, non viene fatta distinzione tra efficienza di fagocitosi di emociti e differenze nel numero di emociti o posizione, a causa del declino relativo all'età o difetti dello sviluppo. 32 peraltro, la procedura non fornisce informazioni sulle differenze nella dimensione o capacità fagocitica di emociti individuali. Così, una volta che vola con ridotta fagocitosi è stati identificati usando i test di fagocitosi in vivo, i ricercatori dovrebbero svolgere studi di follow-up, forse usando particelle alternative, al fine di discriminare tra difetti di fagocitosi immuno-correlati e difetti fagocitici generali. In definitiva, determinare i meccanismi molecolari che sottendono difetti fagocitici di ceppi mutanti richiede un esame di fagocitosi in singoli emociti. Ciò può essere compiuta usando, per esempio, microscopia confocale, isolamento di perlina attivate la fluorescenza delle cellule ordinamento o magnetico di emociti adulto27,28,29,32,33 , 34.
Nel complesso, Drosophila ha dimostrato di essere un modello efficace per studiare immunità innata in animali vivi. Qui abbiamo fornito una panoramica del test in vivo di fagocitosi, un metodo per studiare la fagocitosi globale e la risposta immunitaria cellulare in mosche adulte. La procedura può essere applicata per schermare per nuovi geni che potrebbero essere importanti per la difesa ospite, convalidare i geni identificati nelle schermate di RNAi in vitro su larga scala e più ulteriormente caratterizzare mutanti con i difetti in risposte immunitarie umorali, intestino o antivirale. È facile da installare e può produrre una grande quantità di dati affidabili su più ceppi di mosche in un breve lasso di tempo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Beth Gonzalez e Dr. Aprajita Garg per supporto nello svolgimento degli esperimenti in vivo fagocitosi. Una sovvenzione di seme di NSF UMD ADVANCE e UMD NIH T32 borse per la formazione, cellula e biologia molecolare (CMB) e le interazioni ospite-patogeno (HPI), finanziato quest'opera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
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