Summary
이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.
Abstract
모든 동물에서 타고 난 면제는 광범위 한 병원 균에 대 한 즉각적이 고 강력한 방어를 제공합니다. 체액과 세포 면역 응답은 타고 난 면제의 주요 지점 그리고 이러한 응답을 조절 하는 요인의 많은 무척 추 동물과 포유류 사이 보존 진화론은. 식 균 작용, 세포 타고 난 면제의 중심 구성 요소 특수 혈액 세포의 면역 시스템에 의해 수행 됩니다. 과일 파리, 초파리 melanogaster, 분자 메커니즘 먹어서 전체 동물에서의 생리 적 영향을 조사 하는 강력한 유전자 모델로 떠오르고 있다. 여기 우리 초파리 혈액 세포, hemocytes에 의해 입자 통풍 관 그리고 파괴를 계량을 vivo에서 먹어서 주입 기반 분석 결과를 보여 줍니다. 절차 수 연구원은 정확 하 게 제어할 입자 농도 복용량, 시간의 짧은 시간에 높은 재현성 결과 얻을 수 있습니다. 실험은 양적, 수행, 쉽게 그 영향 병원 체 인식, 이해, 및 허가 호스트 요소에 대 한 화면에 적용할 수 있습니다.
Introduction
타고 난 면역 방어는 병원 성 미생물에 대 한 방어의 첫 번째 줄을 형성 한다. 이러한 응답 기능 둘 다 생식 인코딩 패턴 인식 수용 체 (호흡기) 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)1감각에 의해 중재는 체액과 세포 타고 난 면역으로 나눌 수 있습니다. 신호 통로의 많은 및 타고 난 면제의 effector 메커니즘 포유류에는 선 충 류, 꼬마 선 충, 과일 파리, 초파리 melanogaster2같은 무척 추 동물 보존 됩니다. 과일 파리 감염 미생물3에 대 한 호스트 방어를 공부 하는 강력한 시스템으로 떠오르고 있다. 초파리 유전자 온순한 쉽고 저렴 하 게 실험실에 reared 이며 짧은 생성 시간을 보내고 있다. 또한, 과일 파리는 다양 한 세균, 바이러스, 세균, 곰 팡이, 또는 기생 하는 병원 체에 대 한 호스트의 시험 사용에 대 한 매우 효율적인 방어를 전시 한다.
초파리 immunologists 앞으로 유전 스크린, 게놈 넓은 중재 하는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 세포 라인의 검사 및 검사에 지도 하는 타고 난 면제-돌연변이 비행 긴장 기존 활용 역사적으로 식별 및 여러 진화론 보존된 체액 면역 경로4,5,6,,78의 특성 체액의 타고 난 면역 반응, 틀림 없이, 최고의 특징 과일 파리에 면역성이 있는 방위. 감염, 다음 체액 반응 리드 생산 및 항균 펩타이드의 조직 릴리스 (AMP) 분자 hemolymph, 곤충에 해당 혈액으로. 앰프는 매우 보존된 수신자와 Imd 신호 통로 의해 생산 됩니다. 수신자 통로 포유 동물에 동종 TLR/IL-1R 수용 체 신호 전달, 그리고 Imd 통로 포유류 종양 괴 사 인자-알파 신호 동종. 초파리, 통행세에 있는 그람 양성 박테리아, 곰 팡이, 그리고 초파리 X 루의6,,910 에 의해 유도 된다 신호 및 그램 음성 박테리아11에 의해 유도 된다 Imd 신호 ,12.
캡슐화, melanization, 및 침략 병원 균의 식 균 작용의 구성 세포 면역, hemocytes13라는 특수 혈액 세포에 의해 수행. 과일 파리에서 hemocytes의 3 개의 종류가 있다: 크리스탈 셀, lamellocytes, 및 plasmatocytes13. 크리스탈 셀, 애벌레에서 순환 hemocytes의 5%를 구성 하는 병원 체와 상처 사이트에 호스트 조직의 melanization에 지도 하는 proPhenoloxidase (proPO) 효소를 놓습니다. 일반적으로에 없는 건강 한 태아 또는 애벌레, Lamellocytes는 외국 개체를 캡슐화 하는 부착 세포 이다. 이러한 셀 pupariation 또는 parasitizing 말 벌 계란은 애벌레에 예금 될 때 유발 됩니다. Phagocytic plasmatocytes, 애벌레에서 hemocytes 및 모든 나머지 hemocytes 성인 순환의 95%를 구성 하는 조직 개발 중 개장에 역할 그리고, 특히, 초파리 세포 면역의 주요 효과 기 세포로 될.
먹어서 타고 난 면역성이 있는 방위;의 즉각적이 고 중요 한 선 호스트 상피 방 벽을 위반 하는 미생물에 휩 싸이 빠르고 phagocytic 혈액 세포에 의해 제거 (식 균 작용의 세포 생물학의 종합적인 검토에 대 한 참조 14참조). 이 프로세스는 생식 인코딩 패턴 인식 수용 체 (호흡기) hemocytes 인식 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) 미생물의 때 시작 됩니다. 한 번 그들의 목표에 바인딩된, 호흡기 말라 골격 개장을 통해 pseudopods의 형성으로 이어질 신호 폭포를 시작 합니다. pseudopods 잠겼습니다 이후 이며 초기 세포 기관이, 있는 phagosome로 내 면 미생물을 둘러싸고 있습니다. 미생물은 phagosome는 hemocyte의 내부로 매매 하 고 일련 리소좀과 상호 작용의 산성화는 phagosome phagosome 성숙의 과정을 겪 습으로 파괴 된다. 시험관에 세포 생물학 연구 포유류 1 차 셀에 식별 및 포유류 Fc 감마 수용 체 등 C3b 수용 체15,16먹어서 조절 요인에 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 대형 스크린 또는 vivo에서 학문을 실행 하는 능력은 포유류 시스템에서 제한 된다.
여기 우리는 200017에 데이비드 슈나이더의 연구소에 의해 처음 도입 절차를 기반으로 성인 초파리에 있는 식 균 작용에 대 한 vivo에서 분석 결과 제시. 슈나이더 연구소 무 hemocytes 쉽게 복 부 등 혈관을 따라 클러스터링 phagocytose 폴리스 티 렌 구슬 및 박테리아를 보여주었다. 먹어서 시각화, 파리 붙일 레이블된 입자 (와 같은 E. 콜라이 fluorescein isothiocyanate (대장균-FITC)으로 표시), 주사는 hemocytes 시간을 입자를 삼 켜 수 있도록 30 분 동안 incubated 그리고 인큐베이션 기간 동안 하지 phagocytosed 입자의 형광 냉각 trypan 파랑, 함께 주입. 비행 등 혈관은 다음 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데. 이 정액 종이, 라텍스 구슬, 파리 hemocytes phagocytose 박테리아 하 고 라텍스 구슬, 그 세균 먹어서 미리 주입 하 여 저해 수 있는 상대적으로 간단한 실험을 사용 하 고는 세포와 체액 없이 면역 응답도 대장균을 따르게 됩니다. Vivo에서 먹어서 등 선박 관련 된 hemocytes에 의해 잠겼습니다 하는 입자의 형광 강도 측정 하 여 계량 슈나이더 연구소의 작품을 바탕으로이 보고서에서 제시 하는 분석 결과.
포유류 시스템에 접근 방식과 마찬가지로, 초파리 유전학 처음 사용 게놈 넓은 생체 외에서 RNAi 스크린 휴대 면역 응답18,19,20에 필요한 유전자를 식별 하 ,21,,2223. 그러나, 성인 vivo에서 먹어서 분석 결과의 개발 활성화 후속 실험 체 외 연구에서 식별 된 요소의 역할 연구원 생물 학적 확인 되므로 전체 동물에 쉽게 실시 하. 막 횡단 수용 체 공룡, s 2를 사용 하는 RNAi 스크린에 세균성 수용 체 세포가24 로 처음 확인 되었고 나중 대장균 (대장균), Enterococcus 중재에 표시 된 경우 있 었 어 요 faecalis, 및 성인25에 황색 포도상구균 (S. 구 균) 먹어서.
우리의 실험실 성인 hemocytes에 식 균 작용을 조절 하는 새로운 유전자를 식별 하기 위해 앞으로 유전 스크린 및 게놈 넓은 협회 연구 ( 초파리 유전자 참조 패널 (DGRP)를 사용 하 여)에서 vivo에서 먹어서 분석 결과 고용. 이러한 연구 수용 체 PGRP-SC1A 및 PGRP SA26, 단백질 Rab1427, 글루타민 산 염 운송업 자 Polyphemus28와 RNA 의무적인 단백질 폭스-129밀매 세포내 소포 특성에 지도 했다.
우리는 미래의 화면 통합 vivo에서 먹어서 추가 유전자 초파리의 세포 면역 반응에 대 한 중요 한 식별 이어질 수 예상. 화면 완전히 시퀀싱 타고 난된, 등 라인은 DGRP 또는 초파리 합성 인구 자원 (DSPR)를 사용 하 여 식 균 작용 또는 hemocyte 개발에 영향을 미치는 자연 변종 식별할 수 있습니다. 기술은 수 초파리 의 다른 종에 채택 또는 유지로 국가 초파리 종 사진 센터 (NDSSC 250 초파리 종 컬렉션이 화면 새로운 커뮤니티 리소스를 하는 데 사용 하는 또한, ) 코넬에서. 이러한 실험 실시 될 수 있습니다. 붙일 표시 된 세균 이나 곰 팡이 벽 bioparticles 상업적으로 사용할 수 있는 사용 하 여 또는 어떤 수 종의 세균 이나 곰 팡이-는 미생물 형광 마커 표현 제공를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. .
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Protocol
1. 주입 Fluorescein 입자 준비
- 상용, 열 살해 박테리아의 10 밀리 그램을 다시 구성 입자 fluorescein 표시 ( 재료의 표참조) 추가 하 여 990 µ L 살 균 1 x PBS 그리고 10 µ L 50 m m 나트륨 아 지 드 10 mg/mL의 농도 재고를. 소용돌이를 섞어입니다.
- 단일 사용 8 µ L aliquots 0.2 mL 튜브에로 분할 하 고 빛이 관련 된 감도 최소화 하기 위해 4 ° C에서 어두운 상자에서 저장.
참고: 나트륨 아 지 드 방부 제는 선택 사항이 며 10 mg/mL 주식 1 mL 균 1 x PBS, 만들어진 경우 생략할 수 있습니다 aliquoted, 및-20 ° c.에 저장
- 단일 사용 8 µ L aliquots 0.2 mL 튜브에로 분할 하 고 빛이 관련 된 감도 최소화 하기 위해 4 ° C에서 어두운 상자에서 저장.
- 5% 식품 500 µ L 주사기 필터링 녹색 식품 색소와 9.5 mL 살 균 1 x PBS를 혼합 하 여 1 x PBS에 색소의 10 mL 솔루션을 확인 합니다.
- 나트륨 아 지 드를 제거 하는 주사 하기 전에 입자를 씻어. PBS와 1.7 mL 튜브에 10 mg/mL의 8 µ L x 믹스 42 µ L 살 균 1. 실 온에서 2.5 분에 대 한 최대 속도로 원심.
- 제거는 상쾌한, 실 온에서 2.5 분에 대 한 최대 속도 50 µ L 1 x PBS, 및 원심 분리기를 추가 합니다.
- 1.3, 1.3.1 단계를 반복 하 여 총 3 세척 2 x.
- 최종 세척 후는 상쾌한 삭제 하 고 다시 5% 식용 1 x PBS에 색소의 50 µ L에서 1.6 mg/mL에 입자를 일시 중단 합니다.
- 튜브 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서. 4 ° C에서 저장, 1 주 후 삭제.
2. 주입 역 및 파리 준비
- 사출 패드를 준비 합니다. 최대 삽입 직사각형 CO2 비행을 분할 사용 실험실 테이프 동시에 파리의 4 genotypes 4 섹션으로 패드. 현미경 근처 벤치에서 파리는 패드 (패드의 각 모서리에 대 한 하나)에 줄지어 되었습니다 일단 튜브를 배치 하는 영역을 지정 합니다.
- 튜브 나이 일치 하는, 4-7 일 준비-주입에 대 한 오래 된, 파리. 테스트를 각 스트레인에 대 한 5 남성과 5 여성 준비 비행 식품의 신선 하 고 레이블이 유리병으로 전송과 25 ° c.에 계속
- 공기 주입기를 준비 ( 재료의 표참조) 악기는 100 밀리초 (sub nanoliter 볼륨의 배달을 허용-액체를 추방 하기 위해 가스 압력의 짧은 파열) TIMED 모드로 설정 하 여.
- 현미경 슬라이드를 준비 합니다. 전기 테이프의 1.5 인치 스트립, 루프, 접착 면으로 접어 잘라내어 레이블이 현미경 슬라이드에 배치.
3. 유리 모 세관 바늘 준비
- 당겨 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여 유리 바늘 (얇은 벽 유리 모 세관).
- 마이크로미터와 현미경 바늘을 잡고 고 #5 좋은 포인트 스테인리스 핀셋을 사용 하 여 팁. 100 µ m 팁 부상 최소화 하면서 파리의 표 피를 관통 하기 위하여 충분 하다.
- 각 비행에 투입 될 것입니다 액체의 양을 측정 합니다. 1 x PBS에 색칠 하는 살 균 5% 음식 바늘을 로드 하 고 0.01 m m 단계 마이크로미터에 미네랄 오일 한 방울에 액체를 추방.
참고: 액체 작은 물방울 구형 이면 picoliters에서 볼륨 (크기)3/1910으로 계산 됩니다. 30 100 µ m 직경 바늘 ~ 2 꺼내지지 100 ms에 nL.
4. 주사 파리
- 1.6 mg/mL 입자 parafilm의 작은 광장에 10 µ L 플라스틱
- 바늘에 액체를 당겨 하 고 인젝터 노즐에서 탑재 ( 재료의 표참조).
- CO2 파리 anesthetize 하 고 flypad, 패드의 앞으로 동쪽으로 향하게 하는 머리와 복 부 쪽에 그들의 지정 된 지역에서 줄을. 벤치에 해당 지역에 튜브를 배치 합니다.
- 액체 (~ 10 nL 총)의 5, 100 ms 펌프와 복 부의 상단에 파리를 주사.
- 적절 한 튜브에 주입 된 파리를 전송, 유리병에 시간 참고. 25 ° c.에 계속
- 새로운 바늘 0.4%와 함께 로드 Trypan 블루 솔루션.
- 공 압 인젝터 제어, 바늘에서 액체를 밀어 공기의 지속적인 흐름을 수 있는 설정 합니다.
- 그들은 30 분 동안 휴식을 후 파리를 anesthetize 하 고 때까지 복 부 가득 부풀어 Trypan 파랑 주사.
참고: 때 입자는 pH에 민감한 염료와 표시 phagosome 성숙 검사, 파리 1 시간 동안 휴식을 허용 하 고 trypan 블루 장착 파리 전에 주입 하지 마십시오. - 전기 테이프, 아래로 복 부 측으로 현미경 슬라이드에 파리를 탑재 합니다. 테이프에 그들을 보호 하 고 비행의 측에 날개를 밀어. 또한, 부드럽게 즉시 이동 하지 것입니다 수 있도록 테이프에 머리를 밀어.
- 즉시 5 단계로 이동 합니다.
5. 영상 파리
- 이미지 하나, 25 x 또는 32 x 배율 ( 재료의 표참조)는 디지털 카메라와 컴퓨터에 연결 된 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 한 번에 이동 합니다. 디지털 카메라에 대 한 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여 비행의 등 쪽 혈관에 초점.
- 실험 사이 확대 및 노출 시간을 기록 합니다.
참고: genotypes의 추적을 잃고 단일 앉아에 여러 종자를 촬영의 오류 때. 파리를 mislabeling를 방지 하려면 각 유전자 형에 대 한 첫 번째 및 마지막 비행 사진 이미지 수의 기록을 합니다.
6. 측정 하 고 형광을 정상화
- 소프트웨어를 열고 한 번에 하나의 이미지를 엽니다.
- 등의 형광 강도 측정 합니다. 등 선박 주위에 다각형을 그립니다. 측정값 을 선택 하 고 다각형 안에 형광 강도 기록.
- 배경 형광 강도 결정 합니다. 첫 번째 다각형을 복사 하 고 비행의 등 쪽 혈관에 인접 한 지역으로 이동. 측정 및 기록 형광 강도의 배경 영역을 선택 합니다.
- 표준화 배경 형광에 의해 지 배 형광:
등 선박 ÷ 배경입니다. - 평균 정규화 등 선박 긴장에서 모든 파리의 형광 강도 계산 합니다.
- 실험 2 번 더 반복 합니다.
- 사용 학생의 짝이 없는 t-3 실험에서 파리 제어 파리의 평균 상대 형광 강도 비교 하 고 테스트 하는 시험. 계산 하는 수식을 사용 하 여 효과 크기: 코헨의 d (M1-M2) ÷ SD풀링된, M1 은 유전자 1 형의 의미와 M2 는 유전자 2 형의 평균 = &
SD 풀링된 =
어디 SD1 유전자 1 형의 표준 편차 이며 SD2 유전자 2 형의 표준 편차입니다.
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Representative Results
Vivo에서 먹어서 분석 결과 fluorescein 표시 된 입자를 사용 하 여의 회로도 그림 1A에 표시 됩니다. 파리 탑재 된 복 부 측 아래로 전기 테이프의 조각에 있으며 등 쪽 혈관이 있는 곳, 복 부의 첫번째 2 개의 세그먼트는 명확 하 게 보이는 (그림 1B). 실험적인 과실의 주요 소스는 주입 및 이미징 절차 (그림 1C)의 단계에서 발생 한다. 비행 조직 또는 입자 막힌 될 수 발생할 수 있습니다 같은 바늘을 사용 하 여 여러 파리를 삽입 ( 그림 1C에서 상단 왼쪽된 패널). Drosophila 자동-fluoresces GFP 빛 아래에서 때문에 막힌된 바늘으로 주입 하는 파리 희미하게 형광 하지만 분명, punctate 형광 입자 hemocytes에 의해 내 면의 부족 것입니다. 실험적인 과실의 또 다른 잠재적인 소스 Trypan 블루 주사 하는 동안 발생할 수 있습니다. 붙일 표시 된 입자와 첫 번째 주사 후 30 분 파리 extracellular, 유엔 phagocytosed 입자의 형광 냉각 Trypan 파랑 두 번째 주입을 받습니다. 각 비행에 대 한 상대 형광 강도 등 선박의 형광의 복 부에는 동등 하 게 크기의 인접 한 지역으로 나누어 계산 됩니다. 충분히 Trypan 파랑에는 영향을 받지 않는 파리 그들의 전체 복 부 ( 그림 1C의 하단 왼쪽된 패널)에 걸쳐 밝은 형광. 이 밝은 형광 배경 형광, 따라서 동물의 진정한 형광 강렬 비율 감소 하 등 그릇의 비율을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 파리 해야 촬영 동안 CO2, 의해 움직일 수로 측정할 수 없는 생산 모호한 이미지를 파리 적극적으로 이동 (위쪽 및 아래쪽, 오른쪽 그림 1C의 패널).
Zuker 컬렉션은 에틸 methanesulfonate (EMS) 취급의 패널 상 염색체 돌연변이와 파리. 31 은 원래 2004 년에 지역 사회 자원으로 설립, 라인 앞으로 역 유전자 화면 수행 하 사용 되었습니다. 우리 실험실은 그람 음성 phagocytose 수 없습니다 Zuker 컬렉션에서 선 식별 (대장균 K-12 스트레인) 및 그람 양성 박테리아 (S. 구 균 나무 변형 단백질 A 없이) (그림 2). 이 돌연변이, 아르고스, 라는 vivo에서 먹어서 분석 결과에 거의 없는 등 선박 형광을 보여줍니다. Zuker isogenic 배경 긴장에 비교 될 때 cn bw, 아르고스 보여줍니다 대장균 의 훨씬 적은 글귀 (p-값 = 0.019; 코헨의 d = 1.677) 및 S. 구 균 (p-값 = 0.0083; 코헨의 d 1.672 =). 아르고스 세균성 식 균 작용은 또한 크게 손상, 대장균 (p-값 = 0.045; 코헨의 d = 0.850) 및 S. 구 균 (p-값 = 0.0136; 코헨의 d = 1.422) 다른 일반적인 실험실 제어 스트레인, 구획 미에 비해
그림 1: 개요 및 vivo에서 먹어서 분석 결과의 대표 이미지. A. fluorescein 표시 된 입자를 사용 하 여 생체 조건 먹어서 분석 결과의 개요. 2 주사, 30 분 간격, 등 선박 관련 혈 시각화 된 입자 인식과 이해에 사용 됩니다. B. 화이트 빛 테이프, 명확 하 게 보이는 앞쪽 복 부 세그먼트에 비행을 보여주는 이미지. C. vivo 먹어서 이미지에서 예입니다. (왼쪽 상단) 막힌된 바늘으로 주입 하는 플라이 아무 입자 형광. (하단 왼쪽) 부족 한 trypan 블루. 때문에 높은 세포 외 형광과 비행 (오른쪽 상단) 없는 세포 외 형광-이상적인 이미지와 immobilize 비행. (오른쪽 하단) 비행 이동으로 CO2 마 취 모호한 이미지를 만듭니다. 눈금 막대, 0.2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 돌연변이 및 제어에 박테리아의 먹어서 파리. A. 먹어서 박테리아 fluorescein 염료;와 분류의 대표 이미지 대장균 (상단 패널) 및 S. 구 균 (하단 패널) B. 형광 강렬 비율의 파리 fluorescein-대장균 입자와 주입. C. 형광 강렬 비율의 파리 fluorescein-S. 구 균 입자와 주입. n 3 실험 실험 당 6-8 파리와 박테리아의 각 유형에 대 한 =. 오류 막대, ± SEM. 통계 분석 = 두 꼬리 t-테스트. 눈금 막대, 0.2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
상용, 붙일 레이블 입자는 일반 (0.2 µ m 카복실산 수정 스피어)에 식 균 작용 또는 미생물 (붙일 레이블 열-화학적 살해 박테리아 또는 효 모)의 식 균 작용을 평가 하는 데 사용 됩니다. Phagosome 성숙 평가, 연구원은 입자는 phagolysosome에서 산 성 하에서 중립 pH 감소 때 fluoresces pH에 민감한 염료와 함께 표시를 선택할 수 있습니다. 또는, 먹어서, 병원 체 인식 및 이해의 초기 단계를 검사 하 연구원은 입자 내부와 세포 외부 형광 형광 태그로 표시를 선택 해야 합니다.
신중 하 게 통제 실험 조건 vivo에서 먹어서 분석 결과 재현할 수 있는 방식으로 수행 됩니다 있도록 열쇠입니다. 첫째, 초파리 실험에 사용 하는 파리 4-7 일의 범위 내에서 최적의 나이 일치 해야 하므로 세포 immunosenescence32, 겪 습. 둘째, 주사 사이 기간 일관 되어야 합니다. 식 균 작용 미생물14감지 호스트 세포의 분 이내 빠르게 발생 합니다. 다음 시간 동안 phagosome 성숙, 일어난다는 phagosome의 산성화와 내 면된 미생물의 파괴에 지도. 주사 사이 대기 하는 간격을 지정 실험 가변성을 감소 하 고 비교 하는 긴장 및 다른 일에 실시 한 실험 사이 만들 수 있습니다. 때 pH에 민감한 형광 염료와 표시 fluorescein 입자와 1 시간을 사용 하 여 입자를 사용 하 여 생체 조건 phagosome 성숙 분석 결과 대 일 분을 기다리는 것이 좋습니다.
여러 종자를 삽입 같은 바늘을 사용 하면 모든 파리 입자의 동일한 복용량을 받을 실험적인 변화 유리 바늘 휴식 하는 경우 발생할 수 있습니다 막힌 될 또는. 그래서, 주입 역 및 파리를 미리 설정을 vivo에서 먹어서 분석 결과 수행 신속 하 고 효율적으로 보장 하는 열쇠입니다. 실험을 시작 하기 전에 몇 가지 바늘에 의해 추방 하는 액체의 부피를 측정 하 고 같은 크기의 바늘의 세트를 유지 합니다. 따라서, 만약 하나의 바늘 주사 사이 휴식, 그것은 교체할 수 있습니다 즉시. 또한, 막힌된 바늘 파리의 hemocytes는 phagocytose 미생물 수와 형광 입자에 영향을 받지 않은 파리 사이 구별 하 고 어려운 틀린 부정적인 결과 발생할 수 있습니다. 녹색 식용 색소로 만든 솔루션을 염색, 쉽게 어떤 파리 주입 되어 추적 하 고 막힌 바늘 문제를 식별 합니다. 이상적으로, 실험 각 실험에 스트레인 당 최소 6-8 파리와 여러 번 수행 해야 하 고 실험 결과 outliers 식별에 비해. 마지막으로, 충분 한 Trypan 파랑 배경 형광은 파리 (그림 1C) 사이 비교 extracellular 입자의 형광을 완전히 해소 관리 되어야 한다.
파리, 이미징 등 선박의 명확 하 고 일관 된 이미지를 얻기 위해 또한 배려를가지고 한다. 검은 전기 테이프 어두운 배경을 만드는 데 사용 되 고 파리 탑재 된 복 부 측 아래로, 그들의 날개와 머리는 테이프의 접착 면을 확보 해야 합니다. 만약에 가능 하다 면, 파리 이미지는 촬영 하는 동안 CO2 고정 유지 됩니다. 마지막으로, 실험적인 바이어스의 가능성을 제한 하려면 사용 하 여 좋습니다 멀게 실험 설치; 튜브 및 긴장 한 연구와 실험에 의해 코딩 됩니다 실행 하 고 다른 연구원에 의해 정량 이다.
Vivo에서 먹어서 분석 결과 먹어서 글로벌 결함 식별에 유용한 도구입니다. 그러나, hemocyte 먹어서 효율성과 hemocyte 수 또는 위치, 나이 관련 쇠퇴 또는 발달 결함 때문에 차이 사이의 구분 하지 않습니다. 32 또한, 절차는 제공 하지 않습니다 정보 크기 또는 개별 hemocytes의 phagocytic 용량 차이에. 따라서, 감소 먹어서와 파리 확인 한 후 vivo에서 먹어서 분석 결과 사용 하 여, 연구 수행 해야 후속 연구, 아마도 다른 입자를 사용 하 여 식 균 작용 면역 관련 결함 사이 차별 그리고 일반 phagocytic 결함입니다. 궁극적으로, 단일 hemocytes에서 식 균 작용의 검사가 필요 phagocytic 결함 돌연변이 체 긴장에 기초 하는 분자 메커니즘을 결정 합니다. 이 성취를 사용 하 여, 예를 들어, confocal 현미경 검사 법, 형광 활성화 셀 정렬 또는 자석 구슬 격리 성인 hemocytes27,,2829,,3233 의 수 있습니다. , 34.
전반적으로, 초파리 는 살아있는 동물의 타고 난 면제를 공부 하는 효과적인 모델을 입증 했다. 여기 우리 vivo에서 먹어서 분석 결과, 글로벌 식 균 작용 및 성인 파리에서 세포 면역 반응을 연구 하는 방법에 대 한 개요를 제공. 절차를 적용할 수 있습니다 호스트 방어에 대 한 중요 한 될 수 있는 새로운 유전자에 대 한 화면에 대규모 생체 외에서 RNAi 스크린에서 확인 된 유전자를 확인 하 고 추가 체액, 본질적인 또는 항 바이러스 면역 반응에 결함을 가진 돌연변이 특성. 쉽게 설정 하 고 짧은 시간 금액에 파리의 여러 변종에 대 한 신뢰할 수 있는 데이터의 큰 금액을 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 vivo에서 먹어서 실험 수행 지원을 위한 닥터 베스 곤잘레스와 박사 Aprajita Garg을 감사 합니다. NSF UMD 사전 시드 부여 및 UMD NIH T32 훈련 보조금, 셀 및 분자 생물학 (CMB)과 호스트 병원 체 상호 작용 (HPI),이 작품을 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
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