Summary
Det här protokollet beskriver ett Invivo fagocytos test i vuxen Drosophila melanogaster att kvantifiera fagocytsystemet erkännande och clearance av mikrobiella infektioner.
Abstract
Alla djur ger medfödd immunitet en omedelbar och robust försvar mot ett brett spektrum av patogener. Humorala och cellulära immunsvaret är de viktigaste grenarna av den medfödda immuniteten, och många av de faktorer som reglerar dessa svar är evolutionärt bevarade mellan ryggradslösa djur och däggdjur. Fagocytos, den centrala komponenten i cellulär medfödd immunitet, utförs av specialiserade celler i immunsystemet. Bananflugan, Drosophila melanogaster, har vuxit fram som en kraftfull genetisk modell att undersöka molekylära mekanismer och fysiologiska effekterna av fagocytos i hela djur. Här visar vi en injektion-baserade Invivo fagocytos analysmetod för att kvantifiera partikel upptag och förstörelse av Drosophila blodkroppar, hemocytes. Förfarandet gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera partikel koncentration och DOS, vilket gör det möjligt att få mycket reproducerbara resultat i en kort tid. Experimentet är kvantitativa, lätt att utföra, och kan användas för att skärmen för värd faktorer som påverkan patogen erkännande, upptag och clearance.
Introduction
Medfödda immunförsvar bildar den första försvarslinjen mot patogena mikrober. Dessa svar kan indelas funktionellt i humorala och cellulära medfödd immunitet, som båda medieras av könsceller-kodat mönster erkännande receptorer (PRRs) som känner av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs)1. Många av signalvägar och effektor mekanismer av den medfödda immuniteten bevaras hos däggdjur och ryggradslösa djur, såsom Nematoden, Caenorhabditis elegans, och bananflugan, Drosophila melanogaster2. Bananflugan har vuxit fram som ett kraftfullt system att studera värd försvar mot smittsamma mikroorganismer3. Drosophila är genetiskt eftertraktansvärda, enkelt och billigt uppfödda i laboratorier, och har en kort generationstid. Dessutom uppvisar bananflugan högeffektiva försvar mot en mängd mikrober, aktivera granskningen av värd immunitet mot virala, bakteriella, svamp eller parasiter patogener.
Drosophila Immunologer har historiskt utnyttjas framåt genetiska skärmar, genome-wide RNA-medierad störningar (RNAi) screening av insekt cellinjer, och redan existerande mutanta flyga stammar för att undersöka medfödd immunitet – leder till den identifiering och karakterisering av flera evolutionärt bevarade humorala immunsystemet vägar4,5,6,7,8. Det humorala medfödda immunsvaret är, utan tvekan, bäst kännetecknas immunförsvar hos bananflugor. Efter infektion leder den humorala Svaren till produktion och systemisk frisättning av antimikrobiell peptid (AMP) molekyler i hemolymph, blod motsvarighet i insekter. Ampere är producerad av mycket Toll och Imd signalering vägar. Den avgiftsbelagda vägen är homolog till däggdjur TLR/IL-1R receptor signalering och Imd stigen är homolog till däggdjur tumörnekrosfaktor-alfa signalering. I Drosophila, Toll signalering framkallas av grampositiva bakterier, svampar och Drosophila X virus6,9,10 och Imd signalering framkallas av Gramnegativa bakterier11 ,12.
Cellulär immunitet, består av inkapsling, melanization och fagocytos av invaderande patogener, som utförs av specialiserade blodkroppar som kallas hemocytes13. Det finns tre klasser av hemocytes i bananfluga: crystal celler, lamellocytes och plasmatocytes13. Crystal celler, som utgör 5% av de cirkulerande hemocytes i larver, släpp proPhenoloxidase (föreslagen) enzymer leder till melanization av patogener och värd vävnader på såret platser. Lamellocytes, som normalt inte finns i friska embryon eller larver, är vidhäftande celler som inkapslar främmande föremål. Dessa celler induceras vid pupariation eller när parasitizing geting ägg deponeras i larver. Fagocytos plasmatocytes, som utgör 95% av cirkulerande hemocytes i larver och alla återstående hemocytes hos vuxna, spela en roll i vävnad remodeling under utveckling och, framför allt, fungera som den huvudsakliga effektor cellen i Drosophila cellulär immunitet.
Fagocytos en omedelbara och avgörande rad medfödda immunförsvaret; mikrober som bryter mot den värd epiteliala barriären är snabbt uppslukat och undanröjas genom fagocytos celler (se referens 14för en omfattande översyn av cellbiologi för fagocytos). Denna process initieras när könsceller-kodade mönsterigenkänning receptorer (PRRs) på hemocytes känner igen patogener associerade molekylära mönster (PAMPs) av mikrober. PRRs bindning till sina mål, och initiera signalering kaskader som leder till bildandet av pseudopods genom aktin cytoskelettet remodeling. Pseudopods omger mikrob, som därefter är uppslukade och internaliserad i en begynnande organell, phagosome. Mikrober förstörs då phagosome genomgår processen av phagosome mognad när phagosome är trafikerad mot inre av hemocyte och försurar genom en rad interaktioner med lysosomer. Vitro och cell har biologi studier i däggdjursceller primär varit instrumental i att identifiera och karaktärisera faktorer som reglerar fagocytos, såsom däggdjur Fc-gamma receptor och C3b receptorer15,16. Möjligheten att köra storskaliga skärmar eller in vivo-studier är dock begränsade däggdjur system.
Här presenterar vi i vivo test för fagocytos i vuxen bananflugor, som bygger på ett förfarande som först introducerades av laboratoriet för David Schneider i 200017. Schneider labbet visade att oskaftade hemocytes klustrade längs buken dorsala fartyget lätt phagocytose polystyren pärlor och bakterier. För att visualisera fagocytos, flugor injiceras med fluorescently märkta partiklar (såsom E. coli märkt med fluorescein Isotiocyanat (E. coli -FITC)), inkuberas i 30 minuter så att hemocytes tid att uppsluka partiklarna, och sedan injiceras med trypan blå, som släcker fluorescensen av partiklar inte fagocyteras under inkubationstiden. Flyga dorsala fartyg är sedan avbildas med en inverterad fluorescerande Mikroskop. Detta nyskapande papper, använder ett relativt enkelt experiment, visat att hemocytes phagocytose bakterier och latex pärlor, den bakteriella fagocytos kan hämmas genom att pre injicera flyger med latex pärlor, och som flyger utan både cellulära och humorala immunsvar är känsliga även för E. coli. Analysen presenteras i denna rapport bygger på arbete av Schneider labbet att kvantifiera Invivo fagocytos genom att mäta fluorescensintensiteten hos partiklar uppslukas av dorsala fartyget associerade hemocytes.
Liknar synsättet i däggdjur system, Drosophila genetiker användes ursprungligen genome-wide in vitro-RNAi-skärmar för att identifiera gener som krävs för den cellulära immunsvar18,19,20 ,21,22,23. Men gjort utvecklingen av vuxen Invivo fagocytos analysen uppföljande experiment skall utföras lätt i hela djur, vilket tillåter forskare att verifiera biologiskt betydelsen av faktorer som identifierats i in vitro-studier. Så var fallet med transmembrana receptorn Eater, som först identifierades som en bakteriell receptor i en RNAi skärm använder S2 celler24 och sedan senare visat att medla Escherichia coli (E. coli),, Enterococcus faecalis, och Staphylococcus aureus (S. aureus) fagocytos i vuxna25.
Vårt labb Anställd Invivo fagocytos analysen i framåt genetiska skärmar och genome-wide associationsstudier (med Drosophila genetiska referens Panel (DGRP)) för att identifiera nya gener som reglerar fagocytos i vuxen hemocytes. Dessa studier ledde till att karakterisera receptorerna PGRP-SC1A och PGRP-SA26, den intracellulära vesikler människohandel protein Rab1427, glutamat transportör Polyfemos28och RNA-bindande protein Fox-129.
Vi räknar med att framtida skärmar införliva den i vivo fagocytos kan leda till identifiering av ytterligare gener som är viktiga för cellulära immunsvaret i Drosophila. Skärmar med fullt sekvenserade inavlade linjer, till exempel DGRP eller Drosophila syntetiska befolkningen resurs (DSPR), kan identifiera naturliga varianter påverkar fagocytos eller hemocyte utveckling. Dessutom kan tekniken antogs i andra arter av Drosophila eller användas till skärmen nya gemenskapens medel, såsom insamling av 250 Drosophila arter upprätthålls av de nationella Drosophila arter lager Center (NDSSC ) på Cornell. Dessa experiment kan utföras med hjälp av fluorescently-märkta bakterie- eller svampinfektioner-wall biopartiklar som finns kommersiellt eller kan utföras med valfritt antal bakterie- eller svampinfektioner arter – förutsatt att mikrob uttrycker fluorescerande markörer .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered Fluorescein partiklar för injektion
- Beredes 10 mg av kommersiellt tillgängliga, värmeavdödade bakterier partiklar märkt med fluorescein (se Tabell för material) till lager koncentrationen 10 mg/mL genom att lägga till 990 µL sterilt 1 x PBS och 10 µL 50 mM natriumazid. Vortex att blanda.
- Dela i engångsbruk 8 µL portioner i 0,2 mL rör och förvara i en mörk låda vid 4 ° C att minimera associerade ljuskänslighet.
Obs: Natriumazid konserveringsmedel är valfri och kan utelämnas om 10 mg/mL bestånd görs med 1 mL steril 1 x PBS, aliquoted och lagras vid-20 ° C.
- Dela i engångsbruk 8 µL portioner i 0,2 mL rör och förvara i en mörk låda vid 4 ° C att minimera associerade ljuskänslighet.
- Gör en 10 mL lösning av 5% Livsmedelsfärgämnen i 1 x PBS genom att blanda 500 µL spruta filtreras Grön mat färg och 9,5 mL steril 1 x PBS.
- Tvätta partiklar före injektion för att ta bort natriumazid. Blanda 42 µL sterilt 1 x PBS och 8 µL 10 mg/ml i en 1,7 mL tub. Centrifugera vid max hastighet för 2,5 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 50 μl 1 x PBS och centrifugera vid max hastighet för 2,5 minuter i rumstemperatur.
- Upprepa steg 1.3 och 1.3.1 2 x, för sammanlagt 3 tvättar.
- Efter den sista tvättningen, avlägsna supernatanten och slamma partiklar till 1,6 mg/mL i 50 µL 5% Livsmedelsfärgämnen i 1 x PBS.
- Linda in röret i aluminiumfolie ljuskänsligt. Förvaras vid 4 ° C, kassera efter 1 vecka.
2. Förbered injektion station och flugor
- Förbered injektionsstället pad. För att injicera upp till 4 genotyper av flugor på samma gång, Använd laboratorium tejp att dela upp en rektangulär CO2 fluga pad i 4 sektioner. På bänken nära mikroskopet, utse områden att placera flaskorna när flugor har varit uppradade på pad (en för varje hörn av pad).
- Förbereda injektionsflaskor med åldersmatchade, 4-7 dagar-gammal, flugor för injektion. För varje stam som skall provas, överföra 5 hanar och 5 tikar en fräsch, märkt injektionsflaska med lagad flyga mat och hålla vid 25 ° C.
- Förbereda den pneumatiska injektorn (se Tabell för material) genom att ställa in instrumentet till en 100 ms (korta skurar av gastryck att utvisa vätskan – möjliggör leverans av sub-nliter volymer) TIMED läge.
- Förbereda objektglas. Skär 1,5-tums remsor av eltejp, vika in en slinga med den självhäftande sidan ut och fäst på ett märkt objektglas.
3. Förbered glas kapillär nålar
- Dra glas nålar (tunn vägg glas kapillärer) med hjälp av nålen avdragare.
- Håll nålen under luppen med en mikrometer och bryta spetsen använder #5 fin punkt rostfritt stål pincett. 100 µm tips är tillräckliga för att genomborra flugans nagelband samtidigt minimera såra.
- Mäta volymen av vätska som injiceras i varje fluga. Fyll nålen med steril 5% Livsmedelsfärgämnen i 1 x PBS och utvisa vätskan på en droppe mineral olja på en 0,01 mm objektmikrometern.
Obs: Om flytande droplet-programmet är sfärisk, beräknas volymen i picoliters som (storlek)3/1910. 30 en nål med en 100 µm diameter kommer att mata ut ~ 2 nL i 100 ms.
4. injicera flugor
- Pipettera 10 µL av 1,6 mg/mL partiklar på ett litet torg av parafilm.
- Dra vätskan in nålen och montera injektor munstycke (se Tabell för material).
- Söva flugor med CO2 och rada upp dem i deras utsedda området på flypad, med den ventrala sidan uppåt och huvuden orienterade mot framsidan av pad. Placera injektionsflaskor i motsvarande områden på bänken.
- Injicera flugor i det övre hörnet av buken med 5, 100 ms pumpar av vätska (~ 10 nL totalt).
- Överföra de injicerade flugorna till lämpliga rören, notera tiden på injektionsflaskan. Hålla vid 25 ° C.
- Ladda en ny nål med 0,4% Trypan blå lösning.
- Ange pneumatisk injektorn GATED, som ger en konstant luftström att pressa vätskan ur nålen.
- Söva flugor efter de har vilat i 30 min och injicera med Trypan blå tills magen är full och utspänd.
Obs: När man undersöker phagosome mognad med partiklar märkt med ett pH-känsliga färgämne, tillåta flyger till vila i 1 h och injicera inte med trypan blå innan montering flugor. - Montera flugor på objektglas med eltejp, ventrala sida ner. Tryck vingarna vid sidan av i farten och säkra dem på band. Också, tryck försiktigt huvudet in i bandet att se till att flugan inte kommer att flytta.
- Omedelbart gå vidare till steg 5.
5. imaging flugor
- Bilden flyger, en i taget, 25 x eller 32 x förstoring med hjälp av en inverterad fluorescens Mikroskop kopplat till en digitalkamera och en dator (se Tabell för material). Fokusera på dorsala fartyget av den fluga som använder datorprogram för digitalkamera.
- Registrera exponeringstid och förstoring mellan experiment.
Obs: Att förlora spår av genotyper är en potentiell källa till fel när du fotograferar flera stammar i ett enda sammanträde. För att undvika mislabeling flugor, anteckna antalet bild av första och sista flyga fotografiet för varje genotyp.
6. kvantifiera och normalisera fluorescensen
- Öppna programvaran och öppna en bild i taget.
- Mät fluorescensintensiteten hos dorsala fartyget. Rita en polygon runt dorsal fartyget. Välj mått och registrera fluorescensintensiteten inuti polygonen.
- Fastställa bakgrunden fluorescensintensiteten. Kopiera första polygonen och flytta den till ett område som gränsar till dorsala fartyget av i farten. Välj åtgärd och rekord fluorescensintensiteten hos bakgrundsytan.
- Normalisera den dorsala fartyg fluorescensen av bakgrunden fluorescensen:
Dorsala fartyget ÷ bakgrund. - Beräkna genomsnittligt normaliserade dorsala fartyget fluorescensintensiteten hos alla flugor i en stam.
- Upprepa experimentet 2 gånger.
- Använd en Student är oparade t-test för att jämföra genomsnittliga relativa fluorescens stödnivåerna kontroll flugor och testa flyger från de tre experiment. Beräkna effekt storleken med hjälp av formeln: Cohens d = (M1- M2) ÷ SDpoolade, där M1 är medelvärdet av genotyp 1 och M2 är medelvärdet av genotyp 2 &
SD poolade =
där SD1 är standardavvikelsen för genotyp 1 och SD2 är standardavvikelsen för genotyp 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1Avisar en schematisk Invivo fagocytos analysens med fluorescein-märkt partiklar. Flugor är monterade ventrala sida ner på en bit eltejp och de två första segmenten av buken, där dorsala fartyget ligger, är klart synliga (figur 1B). Viktiga källor till experimentella fel uppstår vid injektionen och imaging steg av förfarandet (figur 1 c). Med samma nålen för att injicera flera flugor kan orsaka att bli igensatta med flyga vävnad eller partiklar (övre vänstra panelen i figur 1 c). Eftersom Drosophila auto-fluorescerar under GFP ljus, kommer flugor injiceras med en igensatt nål fluorescerar svagt men saknar den tydliga, punktuell fluorescensen av partiklar internaliseras av hemocytes. En annan potentiell källa av experimentella fel kan inträffa under Trypan blå injektionerna. Trettio minuter efter den första injektionen med fluorescently-märkt partiklar, få flugor en andra injektion med Trypan blå, som släcker fluorescensen av extracellulära, un-fagocyteras partiklar. Relativa fluorescensintensiteten för varje fluga beräknas genom att dividera fluorescensen av dorsala fartyget av en lika stora angränsande område på buken. Flugor som inte får tillräckligt Trypan blå fluorescerar ljust i hela deras hela buken (nedre vänstra panelen i figur 1 c). Detta ljusa fluorescens kan minska förhållandet mellan dorsala fartyget till bakgrunden fluorescens, vilket minskar sant fluorescens intensitet förhållandet av djuret. Slutligen, flugor bör vara fotograferade medan orörlig med CO2, som aktivt flytta flugor producera suddiga bilder som inte kan kvantifieras (topp och botten, höger paneler av figur 1 c).
Zuker samlingen är en panel av etyl methanesulfonate (EMS) behandlade flyger med autosomala mutationer. 31 ursprungligen etablerades som en gemenskapens resurs 2004, har raderna använts för att utföra framåt och bakåt genetiska skärmar. Vårt labb identifierat en linje från samlingen Zuker som inte kan phagocytose gramnegativa (E. coli k-12 stam) och grampositiva bakterier (S. aureus trä stam utan protein A) (figur 2). Denna mutant, kallas argus, visar nästan ingen dorsal fartyget fluorescens i Invivo fagocytos analysen. Jämfört med Zuker syngena bakgrund stam, cn bw, argus visar betydligt mindre upptag av E. coli (p-värde = 0,019; Cohens d = 1.677) och S. aureus (p-värde = 0.0083; Cohens d = 1.672). Argus bakteriell fagocytos är också betydligt nedsatt, E. coli (p-värde = 0,045; Cohens d = 0.850) och S. aureus (p-värde = 0.0136; Cohens d = 1.422) jämfört med en annan gemensamma laboratoriet kontrollisolatet, Canton-S.
Figur 1: Översikt och representativa bilder av Invivo fagocytos assay. A. Schematisk Invivo fagocytos analysens med fluorescein-märkt partiklar. Två injektioner, 30 minuters mellanrum, används visualiseras partikel erkännande och upptag av dorsala fartyget-associerade blodkroppar. B. vitt ljus bild visar en fluga som monteras på band, med klart synliga främre buken segment. C. exempel i vivo fagocytos bilder. (överst till vänster) En fluga som injiceras med en igensatt nål har ingen partikel fluorescens. (längst ned till vänster) En fluga med höga extracellulära fluorescens på grund av otillräcklig trypan blå. (överst till höger) En orörlig flyga med ingen extracellulära fluorescens – perfekt bild. (längst ned till höger) En fluga flyttar skapar som CO2 anestesi avtar en suddig bild. Skalstapeln, 0,2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Fagocytos av bakterier i mutant och kontroll flugor. A. representativa bilder av fagocytos bakterier märkt med fluorescein färgämne; E. coli (översta paneler) och S. aureus (bottenpaneler). B. fluorescens intensitet förhållandet flyger injicerade med fluorescein -E. coli partiklar. C. fluorescens intensitet förhållandet flyger injicerade med fluorescein -S. aureus partiklar. n = 3 experiment för varje typ av bakterier, med 6-8 flugor per experiment. Felstaplarna, ± SEM. statistisk analys = tvåsidiga t -test. Skalstapeln, 0,2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kommersiellt tillgängliga, fluorescently märkt partiklar används för att bedöma fagocytos i allmänhet (0.2 µm bildas modifierade mikrosfärer) eller fagocytos av mikrober (fluorescently-märkt värme - eller kemiskt dödade bakterier eller jäst). För att bedöma phagosome mognad, kan forskare välja partiklar märkt med ett pH-känsliga färgämne som fluorescerar när pH sjunker från neutral till sura, som i phagolysosome. Alternativt, för att undersöka de första stegen av fagocytos, patogen erkännande och upptag, forskare bör välja partiklar märkta med fluorescerande Taggar som fluorescerar i och utanför cellerna.
Noggrant kontrollerade experimentella förhållanden är nyckeln till att säkerställa Invivo fagocytos analysen utförs på ett reproducerbart sätt. Först, Drosophila genomgår cellulära immunosenescence32, så flugor som används i experimentet bör åldersmatchade, optimalt inom en rad 4-7 dagar gammal. Andra bör perioden mellan injektionerna vara konsekvent. Fagocytos sker snabbt, inom några minuter av värdcellen avkänning mikrob14. Över nästa timme sker phagosome mognad, leder till försurning av phagosome och förstörelsen av internaliserade mikrob. Utse en inställda intervallet vänta mellan injektionerna minskar experimentella variabilitet och tillåter jämförelser göras mellan stammar och experiment som utförs på olika dagar. Rekommenderar vi väntar trettio minuter när med fluorescein partiklar och en timme för Invivo phagosome mognad analysen använder partiklar märkt med pH-känsliga fluorescerande färgämne.
Med samma nålen för att injicera flera stammar säkerställer att alla flugor får samma dos av partiklar och experimentella variabilitet kan uppstå om glas nålar paus eller bli igensatt. Så, konfigurera injektion station och flugor i förväg är nyckeln till att säkerställa att Invivo fagocytos analysen utförs snabbt och effektivt. Innan du börjar experimentet, mäta volymen av vätska fördrivits av flera nålar och behålla en uppsättning nålar av samma storlek. Således, om en nål bryter mellan injektionerna, den kan ersättas omedelbart. Dessutom igensatt nålar kan leda till falskt negativa resultat, vilket gör det svårt att skilja mellan flugor vars hemocytes inte förmår phagocytose mikrober och flugor som inte fick fluorescerande partiklar. Hårfärgningsmedel lösningar med grön karamellfärg, göra det lättare att spåra vilka flugor har injicerats och att identifiera problem med igensatta nålar. Idealiskt, experimentet bör utföras flera gånger, med minst 6-8 flugor per stam i varje experiment och resultaten av experiment jämfört identifiera extremvärden. Slutligen, tillräckligt Trypan blå administreras för att helt släcka fluorescensen av extracellulära partiklar så att bakgrunden fluorescensen är jämförbara mellan flugor (figur 1 c).
När imaging flugor, bör också vara försiktig att få tydliga, konsekventa bilder av dorsala fartyget. Svart eltejp används för att skapa en mörk bakgrund och flugor bör vara monterade ventrala sida ner, med sina vingar och huvuden säkras att den självhäftande sidan av tejpen. Om möjligt, bör flugor förbli immobiliserade enligt CO2 medan bilderna tas. Slutligen, för att begränsa risken för experimentell bias, vi rekommenderar att använda en blindad experiment; där injektionsflaskor och stammar kodas av en forskare och experiment utförs samt kvantifieras av annan forskare.
Invivo fagocytos analysen är ett användbart verktyg för att identifiera globala defekter i fagocytos. Det skiljer dock inte mellan hemocyte fagocytos effektivitet och skillnader i hemocyte nummer eller läge, på grund av åldersrelaterade nedgången eller defekter. 32 dessutom förfarandet ger inte information om skillnader i storlek eller fagocytos kapacitet av enskilda hemocytes. Således, när flugor med reducerad fagocytos har identifierats med Invivo fagocytos analys, forskare bör genomföra uppföljande studier, kanske med alternativa partiklar, för att diskriminera mellan immunrelaterade fagocytos defekter och allmänna fagocytos defekter. Slutligen, att fastställa de molekylära mekanismer som ligger bakom fagocytos defekter i mutant stammar kräver en undersökning av fagocytos i enstaka hemocytes. Detta kan vara fulländad använder, till exempel, konfokalmikroskopi, fluorescens aktiverad cell sortering eller magnetiska pärla isolering av vuxen hemocytes27,28,29,32,33 , 34.
Sammantaget har Drosophila visat sig vara en effektiv modell för att studera medfödd immunitet hos levande djur. Här har vi skapat en översikt över Invivo fagocytos analysen, en metod att studera den globala fagocytos och cellulära immunsvaret i vuxna flugor. Förfarandet kan tillämpas för att skärmen för nya gener som kan vara viktiga för värd försvar, validera gener som identifierats i storskaliga in vitro-RNAi skärmar och ytterligare karakterisera mutanter med defekter i de humorala, tarmen eller antivirala immunsvar. Det är lätt att installera och kan ge en stor mängd tillförlitliga uppgifter om flera stammar av flugor i en kort tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Beth Gonzalez och Dr Aprajita Garg för stöd vid utförandet av experiment som Invivo fagocytos. En NSF UMD ADVANCE utsäde Grant och UMD NIH T32-utbildningsbidrag, Cell och molekylärbiologi (CMB) och värd-patogen interaktioner (HPI), finansierade detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
- De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
- Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
- Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
- Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
- Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
- Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
- Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
- Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
- Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
- Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
- Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
- Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
- Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
- Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
- Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
- Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
- Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
- Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).
