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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, Drosophila melanogasterutilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59543
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

Este protocolo describe un ensayo de fagocitosis in vivo en adultos de Drosophila melanogaster para cuantificar fagocito reconocimiento y liquidación de las infecciones microbianas.

Abstract

En todos los animales, inmunidad innata proporciona una defensa inmediata y robusta contra un amplio espectro de patógenos. Respuesta inmune humoral y celular son las ramas principales de la inmunidad innata, y muchos de los factores de regulación de estas respuestas están conservadas evolutivamente entre los invertebrados y mamíferos. Fagocitosis, el componente central de la inmunidad celular innata, es llevado a cabo por células de sangre especializadas del sistema inmune. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha emergido como un poderoso modelo genético para investigar los mecanismos moleculares y efectos fisiológicos de la fagocitosis en animales enteros. Aquí demostramos un ensayo de fagocitosis in vivo basado en la inyección para cuantificar la absorción de partículas y la destrucción de las células sanguíneas de la Drosophila , hemocitos. El procedimiento permite a los investigadores controlar con precisión la concentración de partículas y la dosis, lo que permite obtener resultados altamente reproducibles en un corto período de tiempo. El experimento es cuantitativo, fácil de realizar y se puede aplicar a la pantalla para los factores del huésped que reconocimiento de patógeno de influencia, la absorción y separación.

Introduction

Defensas inmunes innatas forman la primera línea de defensa contra los microbios patógenos. Estas respuestas pueden dividirse funcionalmente en la inmunidad innata humoral y celular, los cuales son mediados por receptores de reconocimiento de patrón codificado del germline (PRRs) que sensación patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs)1. Muchas de las vías de señalización y mecanismos efectores de la inmunidad innata se conservan en mamíferos e invertebrados, tales como el nematodo Caenorhabditis elegans y la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster2. La mosca de la fruta se ha convertido en un potente sistema de defensa del huésped contra microorganismos infecciosos3de estudio. Drosophila es genéticamente manejable, fácilmente y a bajo costo criados en laboratorios y tiene un tiempo de generación corto. Además, la mosca de la fruta presenta eficientes defensas contra una amplia gama de microbios, lo que permite el examen de la inmunidad del anfitrión contra patógeno viral, bacteriana, micótica o parasitaria.

Inmunólogos de Drosophila han utilizado históricamente adelantadas pantallas genéticas, genoma mediada por RNA de interferencia (ARNi) proyección de líneas celulares de insectos y existían cepas de mosca mutantes para examinar la inmunidad innata – llevando a la identificación y caracterización de varias vías inmune humoral evolutivamente conservado4,5,6,7,8. La respuesta inmune innata humoral es, sin duda, el mejor caracterizado de defensa inmune en moscas de la fruta. Después de la infección, la respuesta humoral conduce a la producción y la liberación sistémica de péptidos antimicrobianos moléculas (AMP) en la hemolinfa, la sangre equivalente en insectos. Amperios se producen por peaje altamente conservado y vías de señalización del Imd. La vía de peaje es homólogo de mamíferos receptores TLR/IL-1R de señalización, y el camino de Imd es homólogo de mamífero Tumor necrosis factor-alpha señalización. En Drosophila, peaje señalización es inducida por bacterias Gram positivas, hongos y Drosophila X virus6,9,10 y señalización del Imd es inducida por bacterias Gram-negativas11 ,12.

Inmunidad celular, compuesto de encapsulado, melanization y fagocitosis de patógenos invasivos, llevado a cabo por células especializadas de sangre llamadas hemocitos13. Hay tres clases de hemocitos en la mosca de la fruta: cristal células, lamellocytes y plasmatocitos13. Las células de cristal, que constituyen el 5% de las circulación hemocitos de larvas, liberan enzimas proPhenoloxidase (proPO) conduce a la melanization de agentes patógenos y tejidos de host en sitios de la herida. Lamellocytes, que no se encuentran normalmente en embriones sanos o las larvas, son células adherentes que encapsulan objetos extraños. Estas células son inducidas a pupariación o parasitando huevos de avispa se depositan en las larvas. Plasmatocitos fagocitarias, que constituyen el 95% de circulación hemocitos de larvas y hemocitos restantes todos en adultos, juegan un papel en la remodelación durante el desarrollo de tejido y, en particular, como la célula efectora principal de la inmunidad celular de Drosophila .

Fagocitosis de una inmediata y crucial línea de defensa inmune innata; microbios que romper la barrera epitelial del huésped son envolvió rápidamente y eliminados por las células fagocíticas de la sangre (para un examen global de biología celular de la fagocitosis ver referencia 14). Este proceso se inicia cuando el reconocimiento de patrones codificados del germline receptores (PRRs) en hemocitos reconocen patógeno asociado patrones moleculares (PMAP) de microbios. Una vez enlazado a sus objetivos, PRRs inician cascadas de señales que conducen a la formación de pseudópodos a través de la remodelación del citoesqueleto de actina. Los pseudópodos rodean el microbio, que posteriormente se hundió e interiorizado en un orgánulo naciente, el fagosoma. Microbios se destruyen como el fagosoma somete el proceso de maduración del fagosoma cuando el fagosoma es traficada hacia el interior de la hemocyte y acidifica a través de una serie de interacciones con lisosomas. En vitro y célula biología estudios en mamíferos células primarias han sido instrumentales en la identificación y caracterización de factores que regulan la fagocitosis, como los mamíferos receptor Fc gamma y receptores de C3b15,16. Sin embargo, se limita la capacidad para ejecutar grandes pantallas o en estudios in vivo en sistemas mamíferos.

Aquí presentamos un ensayo in vivo para la fagocitosis en moscas de la fruta adultas, que se basa en un procedimiento introducido por primera vez por el laboratorio de David Schneider en 200017. El laboratorio de Schneider demostró que los hemocitos sésiles agrupadas a lo largo de la nave dorsal abdominal fácilmente fagocitar bacterias y granos del poliestireno. Para visualizar la fagocitosis, moscas se inyectan con fluorescencia etiquetadas partículas (tales como e. coli marcados con isotiocianato de fluoresceína (e. coli -FITC)), se incubó por 30 minutos para dar tiempo de hemocitos a fagocitar las partículas y luego inyectado con trypan azul, que apaga la fluorescencia de las partículas no fagocitados durante el período de incubación. Los vasos dorsales mosca entonces son reflejados usando un microscopio fluorescente invertido. Este trabajo seminal, usando un experimento relativamente sencillo, demostrado que los hemocitos fagocitar bacterias y gotas de látex, fagocitosis bacteriana pueden ser inhibidas mediante la pre-inyección de vuela con gotas de látex, y que vuela sin celular y humoral las respuestas inmunes son susceptibles a e. coli. El análisis presentado en este informe se basa en el trabajo del laboratorio de Schneider para cuantificar la fagocitosis in vivo mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de las partículas por hemocitos de vaso dorsal asociada.

Similar a los planteamientos en sistemas mamíferos, Drosophila genetistas utilizan inicialmente genoma pantallas de ARNi en vitro para identificar los genes necesarios para la respuesta inmune celular18,19,20 ,21,22,23. Sin embargo, el desarrollo del ensayo de fagocitosis in vivo adultos permitieron experimentos seguimiento fácilmente realizarse en animales enteros, así permitiendo a los investigadores a verificar los biológicos el papel de los factores identificados en los estudios in vitro. Tal fue el caso con el receptor transmembrana Eater, que fue primero identificado como un receptor bacteriano en una pantalla de RNAi usando S2 células24 y entonces más adelante demostrado para mediar la Escherichia coli (e. coli), Enterococcus faecalis, y fagocitosis de Staphylococcus aureus (S. aureus) en adultos25.

Nuestro laboratorio emplea el ensayo de fagocitosis in vivo en adelantados pantallas genéticas y estudios de Asociación de genoma completo (mediante el Panel de referencia genética de Drosophila (DGRP)) para identificar nuevos genes que regulan la fagocitosis en hemocitos de adultos. Estos estudios condujeron a la caracterización de los receptores PGRP-SC1A y PGRP-SA26, la vesícula intracelular trata de proteína Rab1427, el glutamato transportador Polifemo28, proteína de unión a RNA de Fox-129.

Esperamos que futuras pantallas incorporando la fagocitosis in vivo podrían conducir a la identificación de genes adicionales que son importantes para la inmunorespuesta celular en Drosophila. Pantallas con líneas endogámicas secuenciado completamente, como la DGRP o el recurso Drosophila de población sintética (DSPR), pueden identificar variantes naturales que afecta al desarrollo de la fagocitosis o hemocyte. Además, la técnica podría adoptada en otras especies de Drosophila o utiliza recursos de comunidad nueva pantalla, como la colección de 250 especies de Drosophila mantenida por la nacional Drosophila especie Stock Center (NDSSC ) en Cornell. Estos experimentos pueden llevarse a cabo utilizando marcada con fluorescencia bacteriano o fungicida pared biopartículas que están disponibles comercialmente o se pueden realizar usando cualquier número de especies bacterianas o por hongos – siempre que el microbio expresa marcadores fluorescentes .

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Protocol

1. preparar partículas de fluoresceína para la inyección

  1. Reconstituir 10 mg de bacterias disponibles comercialmente, muertos de calor las partículas marcadas con fluoresceína (véase Tabla de materiales) a una concentración stock de 10 mg/mL mediante la adición de 990 μl estériles de 1 x PBS y 10 μl 50 mM de azida sódica. Vortex para mezclar.
    1. Dividir en 8 partes alícuotas μL en tubos de 0.2 mL de un solo uso y guardar en una caja oscura a 4 ° C para minimizar la sensibilidad asociada a la luz.
      Nota: Azida de sodio conservante es opcional y puede omitirse si se realizan acciones de 10 mg/mL con 1 mL estéril de 1 x PBS, alícuotas y almacenado a-20 ° C.
  2. Hacer una solución de 10 mL de colorante de 5% en PBS 1 x mezclando 500 μl jeringa filtran alimento verde para colorear y 9,5 mL estéril de 1 x PBS.
  3. Lavar las partículas antes de la inyección para eliminar la azida de sodio. Μl de la mezcla 42 estéril 1 x PBS y 8 μl de 10 mg/mL en un tubo de 1,7 mL. Centrifugar a velocidad máxima durante 2,5 min a temperatura ambiente.
    1. Eliminar el sobrenadante, agregar 50 μl de 1 x PBS y centrifugar a máxima velocidad durante 2,5 min a temperatura ambiente.
    2. Repita los pasos 1.3 y 1.3.1 x 2, para un total de 3 lavados.
    3. Después del último lavado, eliminar el sobrenadante y resuspender las partículas a 1,6 mg/mL en 50 μl de colorante de 5% en PBS 1 x.
    4. Envuelva el tubo de papel de aluminio para proteger de la luz. Almacenar a 4 ° C, desechar después de 1 semana.

2. preparar la estación de inyección y moscas

  1. Preparar el botón de inyección. Para inyectar hasta 4 genotipos de moscas al mismo tiempo, use cinta de laboratorio para dividir una rectangular CO2 fly cojín en 4 secciones. En el Banco cerca del microscopio, designar áreas para colocar los frascos una vez que las moscas han sido alineadas en el teclado (uno para cada esquina de la almohadilla).
  2. Preparar los frascos de edad comparable, 4-7 días-viejos, moscas para la inyección. Para cada cepa a ensayar, transferir 5 machos y 5 hembras en un frasco fresco, etiquetado de los alimentos preparados de mosca y mantener a 25 ° C.
  3. Preparar el inyector neumático (véase Tabla de materiales) estableciendo el instrumento en un modo de tiempo de 100 ms (ráfagas cortas de presión de gas para expulsar el líquido, lo que permite la entrega de volúmenes sub-nanoliter).
  4. Preparar los portaobjetos de microscopio. Cortar tiras de 1,5 pulgadas de cinta aislante, doblar en forma de bucle con el lado adhesivo hacia fuera y coloque en un portaobjetos de microscopio etiquetado.

3. prepare agujas capilares de vidrio

  1. Tire las agujas de cristal (Capillares de vidrio de paredes delgadas) utilizando un extractor de aguja.
    1. Mantener la aguja bajo el microscopio con un micrómetro y romper la punta con unas pinzas de acero inoxidable de punta fina #5. 100 μm consejos son suficientes para perforar la cutícula de la mosca minimizando hiriendo.
    2. Medir el volumen de líquido que se inyecta en cada vuelo. La aguja de carga con estériles colorante de 5% en PBS 1 x y expulsar el líquido sobre una gota de aceite mineral en un micrómetro de 0,01 mm.
      Nota: Si la gota de líquido es esférica, el volumen en picolitros se calcula como (tamaño)3/1910. 30 una aguja con un diámetro de 100 μm expulsará ~ 2 nL en 100 ms.

4. Inyecte moscas

  1. Pipetear 10 μl de partículas de 1,6 mg/mL en una pequeña plaza de parafilm.
    1. Tire el líquido en la aguja y montar en el inyector (véase Tabla de materiales).
    2. Anestesiar a moscas con CO2 y se alinean en sus áreas designadas en el flypad, con la parte ventral hacia arriba y la cabeza orientada hacia la parte delantera de la almohadilla. Coloque los frascos en las áreas correspondientes en el Banco.
    3. Moscas en la parte superior del abdomen se inyectan con 5, 100 ms bombas de líquido (~ 10 total de nL).
    4. Transferir las moscas inyectadas a los viales adecuados, tenga en cuenta el tiempo en el vial. Mantener a 25 ° C.
  2. Cargar una nueva aguja con 0.4% solución de azul tripán.
  3. Ponga el inyector neumático en recinto cerrado, que permite un flujo constante de aire para empujar el líquido de la aguja.
  4. Anestesiar a moscas después descansaron durante 30 minutos e inyecte con azul de tripán hasta que el abdomen está lleno y dilatado.
    Nota: Al examinar la maduración del fagosoma con partículas con un tinte pH-sensible, permite moscas descansar durante 1 hora y no se inyecte con trypan azul antes de montaje de moscas.
  5. Montaje moscas en portaobjetos con cinta aislante, la parte ventral hacia abajo. Empuje las alas al lado de la mosca y fíjelos a la cinta. También, empuje suavemente la cabeza en la cinta para asegurar que la mosca no se moverá.
  6. Inmediatamente vaya al paso 5.

5. proyección de imagen de moscas

  1. Imagen vuela, a la vez, x 25 o 32 aumentos con un microscopio de fluorescencia invertido conectado a una cámara digital y computadora (véase Tabla de materiales). Se centran en el vaso dorsal de la mosca usando software de computadora para la cámara digital.
  2. Registrar el tiempo de exposición y ampliación entre experimentos.
    Nota: Perder la pista de genotipos es una fuente potencial de error al fotografiar las tensiones múltiples en una sola sesión. Para evitar el etiquetado falso moscas, anote el número de la imagen de la primera y la última fotografía de mosca para cada genotipo.

6. cuantificación y normalización de la fluorescencia

  1. Abra el software y abrir una imagen en un momento.
    1. Medir la intensidad de la fluorescencia del vaso dorsal. Traza un polígono en torno al vaso dorsal. Elige la medida y registrar la intensidad de fluorescencia dentro del polígono.
    2. Determinar la intensidad de la fluorescencia de fondo. Copiar el primer polígono y moverlo a un área adyacente al vaso dorsal de la mosca. Seleccione la medida y la intensidad de fluorescencia de registro de la zona de fondo.
    3. Normalizar la fluorescencia del vaso dorsal por la fluorescencia de fondo:
      Fondo de vaso dorsal ÷.
    4. Calcular que el promedio normalizado intensidad de fluorescencia de vaso dorsal de todas las moscas en una cepa.
    5. Repetir el experimento 2 veces más.
    6. Uso un estudiante de desapareado t-test para comparar las intensidades de fluorescencia relativa promedio de moscas control y prueba de vuela de los tres experimentos. Calcular el tamaño del efecto utilizando la fórmula: d de Cohen = (M1- M2) ÷ SDagrupados, donde M1 es la media de genotipo 1 y M2 es la media de genotipo 2 y
      SD agrupado =Equation
      donde SD1 es la desviación estándar de genotipo 1 y SD2 es la desviación estándar de genotipo 2.

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Representative Results

En figura 1Ase muestra un esquema del ensayo de fagocitosis in vivo usando partículas marcados con fluoresceína. Las moscas son montado lado ventral hacia abajo en un pedazo de cinta aislante y los dos primeros segmentos del abdomen, donde se encuentra el vaso dorsal, es claramente visible (figura 1B). Principales fuentes de error experimental se presentan en la inyección y proyección de imagen pasos del procedimiento (figura 1). Utilizando la misma aguja para inyectar múltiples moscas podría causar que se obstruya con tejido mosca o partículas (panel superior izquierdo de la figura 1). Porque Drosophila auto fluorescencia bajo la luz de la GFP, moscas inyectadas con una aguja obstruida fluorescencia débilmente pero carecen de la fluorescencia claro, punteada de partículas internalizadas por los hemocitos. Otra posible fuente de error experimental puede ocurrir durante la inyección de azul de tripano. Treinta minutos después de la primera inyección con partículas marcada con fluorescencia, moscas recibirán una segunda inyección con azul de tripán, que sacia la fluorescencia de las partículas extracelulares, no fagocitadas. Intensidad de fluorescencia relativa para cada mosca se calcula dividiendo la fluorescencia del vaso dorsal de un área adyacente de igual tamaño en el abdomen. Moscas que no reciben suficiente azul de tripán fluorescencia brillantemente a lo largo de su abdomen entero (panel izquierdo inferior de la figura 1). Esta fluorescencia brillante puede reducir la relación del vaso dorsal a la fluorescencia del fondo, disminuyendo el ratio de intensidad de fluorescencia verdadero del animal. Por último, moscas deben ser fotografiadas mientras inmovilizada por CO2, en activamente en movimiento producen imágenes borrosas que no pueden cuantificarse (superior e inferior, los paneles de la figura 1a la derecha).

La colección de Zuker es un panel de metanosulfonato de etilo (EMS) tratado moscas con mutaciones autosómicas. 31 establecido originalmente como un recurso comunitario en 2004, las líneas se han utilizado para llevar a cabo pantallas genéticas hacia adelantadas y hacia atrás. Nuestro laboratorio identificó una línea de la colección de Zuker que no es capaz de fagocitar bacterias Gram negativas (e. coli cepa de K-12) y bacterias Gram positivas (S. aureus madera cepa sin proteína) (figura 2). Este mutante, llamado argus, no muestra casi ninguna fluorescencia vaso dorsal en el ensayo de fagocitosis in vivo. En comparación con la cepa de fondo isogénicas Zuker, cn bw, argus muestra significativamente menor captación de e. coli (p-valor = 0.019; Cohen d = 1.677) y S. aureus (p-valor = 0.0083; D de Cohen = 1.672). ARGUS fagocitosis bacteriana es también significativamente deteriorada, e. coli (p-valor = 0.045; D de Cohen = 0.850) y S. aureus (p-valor = 0,0136; D de Cohen = 1.422) en comparación con otra común laboratorio control cepa, Cantón S.

Figure 1
Figura 1: Resumen e imágenes representativas de ensayo de la fagocitosis in vivo. A. esquemático del ensayo de fagocitosis in vivo usando partículas marcados con fluoresceína. Dos inyecciones, 30 minutos, se utilizan para visualizar partículas reconocimiento y captación por los glóbulos asociados vaso dorsales. B. blanco luz de imagen mostrando una mosca montada en la cinta, con segmentos abdominales anteriores claramente visibles. C. ejemplo en vivo imágenes de fagocitosis. (superior izquierda) Una mosca que se inyecta con una aguja obstruida no tiene ninguna fluorescencia de partícula. (parte inferior izquierda) Una mosca con alta fluorescencia extracelular debido a insuficiente trypan azul. (parte superior derecha) Una mosca de inmovilizar con ninguna fluorescencia extracelular – imagen ideal. (abajo a la derecha) Una mosca en movimiento como CO2 anestesia usa crea una imagen borrosa. Barra de escala, 0,2 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Fagocitosis de bacterias en mutante y control de moscas. A. imágenes representativas de las bacterias de la fagocitosis con colorante de fluoresceína; E. coli (paneles superiores) y S. aureus (paneles inferiores). B. la relación de intensidad de fluorescencia de moscas inyectado con fluoresceína - partículas dee. coli . C. la relación de intensidad de fluorescencia de moscas inyectado con fluoresceína - partículas deS. aureus . n = 3 experimentos para cada tipo de bacterias, con 6-8 moscas por experimento. Barras de error, ± SEM. estadístico análisis = dos colas t -test. Barra de escala, 0,2 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Comercialmente disponibles, fluorescencia etiquetadas partículas se utilizan para evaluar fagocitosis en general (0,2 μm modificado carboxylate microesferas) o fagocitosis de microbios (marcada con fluorescencia calor o químicamente mató las bacterias o levaduras). Para evaluar la maduración del fagosoma, los investigadores pueden seleccionar partículas con un tinte pH-sensible que fluoresce cuando pH de neutro a ácido, como en el fagolisosoma. Alternativamente, para examinar los pasos iniciales de la fagocitosis, reconocimiento de patógenos y absorción, los investigadores deberían elegir partículas marcadas con etiquetas fluorescentes que fluorescencia dentro y fuera de las células.

Condiciones experimentales cuidadosamente controladas son clave para el ensayo de fagocitosis in vivo se lleva a cabo de manera reproducible. En primer lugar, Drosophila sufre inmunosenescencia celular32, así que deben ser utilizados en el experimento de moscas pareados por edad, óptimamente dentro de un rango de 4-7 días de edad. En segundo lugar, el período entre inyecciones debe ser coherente. La fagocitosis se produce rápidamente, a minutos de la célula huésped el microbio14de detección. Durante la siguiente hora, maduración del fagosoma ocurre, conduce a la acidificación del fagosoma y la destrucción del microbio internalizado. Designar un intervalo a esperar entre inyecciones reduce la variabilidad experimental y permite hacer comparaciones entre las cepas y experimentos llevados a cabo en días diferentes. Recomendamos esperar treinta minutos, cuando usando partículas de fluoresceína y una hora para el ensayo de maduración del fagosoma en vivo usando partículas marcada con colorante fluorescente sensible al pH.

Utilizando la misma aguja para inyectar cepas múltiples asegura que moscas todos reciben la misma dosis de partículas y la variabilidad experimental puede surgir si rotura de agujas de vidrio o se obstruyen. Por lo tanto, establecer antes de la estación de inyección y moscas es clave para asegurar que el ensayo de fagocitosis in vivo se lleva a cabo rápida y eficientemente. Antes de comenzar el experimento, medir el volumen de líquido expulsado por varias agujas y retener un conjunto de agujas del mismo tamaño. Así, si una aguja se rompe entre las inyecciones, puede ser reemplazada inmediatamente. Además, agujas obstruidas pueden conducir a resultados negativos falsos, lo que hace difícil distinguir entre moscas cuyos hemocitos son incapaces de fagocitar microbios y moscas que no recibieron las partículas fluorescentes. Teñir con colorante verde las soluciones, que sea más fácil rastrear qué moscas han inyectado y a identificar los problemas con las agujas obstruidas. Idealmente, el experimento debe realizarse varias veces, con por lo menos 6-8 moscas por cepa en cada experimento, y compararon los resultados de experimentos para identificar a valores atípicos. Finalmente, se debe administrar suficiente azul de tripano para apagar completamente la fluorescencia de las partículas extracelulares para que la fluorescencia de fondo es comparable entre moscas (figura 1).

Cuando vuela la proyección de imagen, debe tener cuidado para obtener imágenes claras y consistentes del vaso dorsal. Cinta aislante negra se utiliza para crear un fondo oscuro y moscas deben ser montado lado ventral hacia abajo, con sus alas y cabezas aseguradas que el lado adhesivo de la cinta. Si es posible, moscas deben permanecer inmovilizadas en el CO2 mientras se toman imágenes. Por último, para limitar la posibilidad de sesgo experimental, se recomienda utilizar una configuración experimental ciega; donde los frascos y las cepas son codificadas por un investigador y el experimento se realiza y cuantifica por otro investigador.

El ensayo de fagocitosis in vivo es una herramienta útil para identificar globales defectos de fagocitosis. Sin embargo, no distingue entre la eficiencia de fagocitosis hemocyte y diferencias hemocyte número o ubicación, debido a la disminución relacionada con la edad o defectos de desarrollo. 32 por otra parte, el procedimiento no proporciona información sobre las diferencias en el tamaño o la capacidad fagocítica de los hemocitos. Así, una vez se han identificado moscas con fagocitosis reducida usando el ensayo de fagocitosis in vivo, los investigadores deben llevar a cabo estudios de seguimiento, tal vez usando partículas alternativas, para discriminar entre defectos de fagocitosis inmune relacionados con y general defectos fagocitarios. En última instancia, determinar los mecanismos moleculares que subyacen defectos fagocitarios en cepas mutantes requiere un examen de la fagocitosis en hemocitos sola. Esto puede ser logrado usando, por ejemplo, microscopía confocal, fluorescencia activada célula clasificación magnética grano aislamiento o de hemocitos adultos27,28,29,32,33 , 34.

En general, la Drosophila ha demostrado para ser un modelo eficaz para el estudio de la inmunidad innata en animales vivos. Aquí hemos incluido un resumen del ensayo de fagocitosis in vivo, un método para estudiar la fagocitosis global y el cellular la respuesta inmune en moscas adultas. El procedimiento puede ser aplicado para detectar nuevos genes que pueden ser importantes para la defensa del huésped, validar los genes identificados en pantallas a gran escala de RNAi en vitro y caracterizar mutantes con defectos en la respuesta inmune humoral, tripa o antiviral. Es fácil y puede producir una gran cantidad de datos confiables sobre varias cepas de moscas en poco tiempo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen el Dr. Beth González y Dr. Aprajita Garg para apoyo en la realización de los experimentos de fagocitosis in vivo. Una subvención de NSF UMD avance semilla y UMD NIH T32 becas de formación, célula y Biología Molecular (CMB) y las interacciones huésped-patógeno (HPI), financiado por este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres Invitrogen F8810 Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen E13231 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen E23370 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen P35361 Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen A10010 Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen S23371 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen S23372 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2851 Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) Zeiss SteREO Discovery.V8 Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Z23373 Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen Z23374 Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen Z2841 Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red Invitrogen Z2843 Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)

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References

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
  3. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
  4. Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
  5. De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
  6. Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
  7. Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
  8. Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
  9. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
  10. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
  11. Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
  12. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
  13. Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
  14. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
  15. Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
  16. Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
  17. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
  18. Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
  19. Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  20. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
  22. Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
  23. Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
  24. Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
  25. Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
  26. Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
  27. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  28. Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
  29. Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
  30. Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
  31. Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
  32. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  33. Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
  34. Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).

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Inmunología e infección número 146 fagocitosis bacterias inmunidad celular Drosophila melanogaster innata inmunidad adulto
Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, <em>Drosophila melanogaster</em>utilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo
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Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P.… More

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay. J. Vis. Exp. (146), e59543, doi:10.3791/59543 (2019).

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