Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering af cellulære immunrespons i frugtflue Drosophila melanogaster, ved hjælp af en i Vivo fagocytose Assay

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59543
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

Denne protokol beskriver en in vivo fagocytose assay i voksen Drosophila melanogaster at kvantificere phagocyt anerkendelse og clearance af mikrobielle infektioner.

Abstract

I alle dyr giver medfødt immunitet en øjeblikkelig og robuste forsvar mod et bredt spektrum af patogener. Humorale og cellulære immunrespons er de vigtigste grene af medfødt immunitet, og mange af de faktorer, der regulerer disse svar er evolutionært bevaret mellem hvirvelløse dyr og pattedyr. Fagocytose, den centrale del af cellulære medfødt immunitet, udføres af specialiserede celler i immunsystemet. Bananfluen Drosophila melanogaster, fremstod som en kraftfuld genetiske model til at undersøge de molekylære mekanismer og fysiologiske virkninger af fagocytose i hele dyr. Her viser vi en injektion-baserede in vivo fagocytose assay for at kvantificere partikel optagelse og ødelæggelse af Drosophila blodlegemer, hemocytes. Proceduren, der giver forskere til netop kontrol partikel koncentration og dosis, hvilket gør det muligt at opnå meget reproducerbare resultater i en kort tid. Eksperimentet er kvantitative, nem at udføre og kan anvendes til at screene for værten faktorer at indflydelse patogen anerkendelse, optagelse og clearance.

Introduction

Medfødte immun forsvaret danne den første linje i forsvaret mod patogene mikrober. Disse svar kan opdeles funktionelt humorale og cellulære medfødt immunitet, som begge er medieret af germline-kodet mønster anerkendelse receptorer (PRRs) at fornemmer patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs)1. Mange af de signaling veje og effektor mekanismer af medfødt immunitet er bevaret i pattedyr og hvirvelløse dyr, såsom fyrretræsnematoden, Caenorhabditis elegans, og bananfluen Drosophila melanogaster2. Frugt fly fremstod som et kraftfuldt system at studere vært forsvar mod smitsomme mikroorganismer3. Drosophila er genetisk tractable, nemt og billigt opdrættet i laboratorier, og har en kort generationstid. Derudover udstiller frugtflue højeffektive forsvar mod en bred vifte af mikrober, gør det muligt for undersøgelse af vært immunitet mod viral, bakterie, svampe eller parasitære patogener.

Drosophila immunologists har historisk udnyttet fremad genetiske skærme, genome-wide RNA-medieret interferens (RNAi) screening af insekt cellelinjer, og præ-eksisterende flyve mutantstammen for at undersøge medfødt immunitet – fører til den identifikation og karakterisering af flere evolutionært bevarede humorale immun veje4,5,6,7,8. Den humorale medfødte immun respons er velsagtens, bedst karakteriseret immunforsvaret i bananfluer. Efter infektion fører den humorale respons til produktion og systemisk frigivelse af antimikrobielle peptid (AMP) molekyler til hemolymph, blodet svarer i insekter. Ampere er produceret af stærkt bevarede vejafgift og Imd signalering veje. Vejafgift vej er homologe til pattedyr TLR/IL-1R receptor signalering, og Imd pathway er homologe til pattedyr Tumor nekrose faktor-alfa signalering. I Drosophila, vejafgift signalering er foranlediget af gram-positive bakterier, svampe og Drosophila X virus6,9,10 og Imd signalering er foranlediget af gram-negative bakterier11 ,12.

Cellulær immunitet, består af indkapsling, melanization og fagocytose af invasive patogener, udført af specialiserede celler kaldes hemocytes13. Der er tre klasser af hemocytes i bananfluen: krystal celler, lamellocytes og plasmatocytes13. Krystal celler, som udgør 5% af de cirkulerende hemocytes i larver, frigive proPhenoloxidase (proPO) enzymer fører til melanization af patogener og værten væv på sår websteder. Lamellocytes, som ikke normalt findes i sund embryoner eller larver, er vedhængende celler, der indkapsler fremmedlegemer. Disse celler er induceret ved pupariation, eller når parasitizing hveps Rognene bliver lagt i larver. Fagocyterende plasmatocytes, som udgør 95% af det cirkulerende hemocytes i larver og alle resterende hemocytes i voksne, spille en rolle i væv remodellering under udvikling, og navnlig, tjene som den vigtigste effektor celle i Drosophila cellulær immunitet.

Fagocytose en umiddelbar og afgørende linje i medfødte immun forsvaret; mikrober, der bryder den vært epitel barriere er hurtigt opslugt og elimineret af fagocyterende celler (For en omfattende gennemgang af cellebiologi af fagocytose Se reference 14). Denne proces sættes i gang når germline-kodet mønstergenkendelse receptorer (PRRs) på hemocytes genkende patogen associeret molekylære mønstre (PAMPs) af mikrober. En gang bundet til deres mål, indlede PRRs signaling cascades, der fører til dannelsen af pseudopods gennem actin cytoskeleton remodellering. Pseudopods surround mikrobe, som efterfølgende er opslugt og internaliseret i en spirende organelle, phagosome. Mikrober er ødelagt som phagosome gennemgår processen med phagosome modning når phagosome er smugles mod hemocyte indre og forsurer gennem en serie af interaktioner med lysosomer. I vitro og celle har biologi undersøgelser i pattedyrceller primære været medvirkende til at identificere og karakterisere faktorer, der regulerer fagocytose, som pattedyr Fc-gamma receptor og C3b receptorer15,16. Ikke desto mindre, evnen til at udføre store skærme eller in vivo-undersøgelser er begrænset i pattedyr systemer.

Her præsenterer vi en in vivo assay for fagocytose i voksen bananfluer, som er baseret på en af David Schneider laboratorium i 200017først indførte procedure. Schneider lab viste, at siddende hemocytes grupperet langs den abdominale dorsale fartøj let phagocytosis polystyren perler og bakterier. For at visualisere fagocytose, fluer er indsprøjtet med fluorescently mærket partikler (såsom E. coli mærket med fluorescein isothiocyanat (E. coli -FITC)), inkuberes i 30 minutter for at tillade hemocytes tid til at opsluge partiklerne, og derefter injiceres med trypan blå, som slukker fluorescens af partikler ikke phagocytosed under inkubationstiden. Flyve dorsale fartøjer er derefter afbildet ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop. Denne skelsættende papir, ved hjælp af et relativt simpelt eksperiment, viste, at hemocytes phagocytosis bakterier og latex perler, at bakteriel fagocytose kan hæmmes ved indblæsning af pre flyver med latex perler, og der flyver uden cellulære og humorale immunrespons er modtagelige selv for E. coli. Analysen i denne rapport bygger på arbejdet i Schneider lab at kvantificere in vivo fagocytose af måling af fluorescens-intensiteten af partikler opslugt af dorsale fartøj forbundet hemocytes.

Svarer til holdningen i pattedyr systemer, Drosophila genetikere starten brugte genome-wide in vitro-RNAi skærme for at identificere gener, der kræves til den cellulære immunrespons18,19,20 ,21,22,23. Men udviklingen af adult in vivo fagocytose assay aktiveret opfølgende forsøg skal udføres let i hele dyr, således at forskere til at kontrollere biologiske rolle i in vitro undersøgelser faktorer. Sådan var tilfældet med den transmembrane receptor Eater, som blev først identificeret som en bakteriel receptor i et RNAi skærmen ved hjælp af S2 celler24 og derefter senere vist at mægle Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, og Staphylococcus aureus (S. aureus) fagocytose i voksne25.

Vores lab ansat in vivo fagocytose assay i fremad genetiske skærme og genome-wide association studier (ved hjælp af Drosophila genetiske Reference Panel (DGRP)) til at identificere nye gener, der regulerer fagocytose i voksen hemocytes. Disse undersøgelser førte til karakterisering PGRP-SC1A-receptorer og PGRP-SA26, den intracellulære vesikel Handel protein Rab1427, glutamat transporter Polyfem28og RNA-bindende protein Fox-129.

Vi forventer, at fremtidige skærme indarbejde den in vivo fagocytose kunne føre til identifikation af yderligere gener, der er vigtig for cellulære immunrespons i Drosophila. Skærme bruger fuldt sekventeret indavlede linjer, som DGRP eller Drosophila syntetiske befolkning ressource (DSPR), kan identificere naturlige varianter påvirker fagocytose eller hemocyte udvikling. Desuden kunne teknikken vedtages i andre arter af Drosophila eller anvendes til skærmen nye fællesskabsmidler såsom indsamling af 250 Drosophila arter vedligeholdes af de nationale Drosophila arter Stock Center (NDSSC ) på Cornell. Disse forsøg kan foretages ved hjælp af fluorescently mærket bakteriel eller svampeinfektion-væg bioparticles der findes i handelen og kan udføres ved hjælp af et vilkårligt antal af bakterie- eller svampeinfektion arter – forudsat at mikrobe udtrykker fluorescerende markører .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered Fluorescein partikler til injektion

  1. Rekonstruere 10 mg af kommercielt tilgængelige, Varme-dræbte bakterier partikler mærket med fluorescein (Se Tabel af materialer) til en stock koncentration på 10 mg/mL ved at tilføje 990 µL sterilt 1 x PBS og 10 µL 50 mM natriumazid. Vortex at blande.
    1. Opdele i engangsbrug 8 µL delprøver i 0,2 mL rør og gemme i en mørk kasse ved 4 ° C at minimere tilknyttede lysfølsomhed.
      Bemærk: Natriumazid konserverende er valgfri og kan udelades, hvis 10 mg/mL bestande er lavet med 1 mL sterilt 1 x PBS, aliquoted, og opbevares ved-20 ° C.
  2. Gøre en 10 mL opløsning af 5% frugtfarve i 1 x PBS ved at blande 500 µL sprøjte filtreret grøn mad farvelægning og 9,5 mL sterilt 1 x PBS.
  3. Vask partikler før injektion til at fjerne natriumazid. Mix 42 µL sterilt 1 x PBS og 8 µL af 10 mg/mL i en 1,7 mL tube. Der centrifugeres ved max hastighed for 2,5 min ved stuetemperatur.
    1. Fjern supernatanten, tilsæt 50 µL 1 x PBS, og der centrifugeres ved max hastighed for 2,5 min ved stuetemperatur.
    2. Gentag trin 1.3 og 1.3.1 2 x, for i alt 3 vasker.
    3. Efter den sidste vask, supernatanten og genopslæmmes partikler til 1,6 mg/mL i 50 µL af 5% frugtfarve i 1 x PBS.
    4. Wrap røret i aluminiumsfolie til at beskytte mod lys. Opbevares ved 4 ° C, slette efter 1 uge.

2. klargør injektion station og fluer

  1. Forberede injektion pad. For at injicere op til 4 genotyper af fluer samtidig brug laboratorium tape til at opdele en rektangulær CO2 flue pad i 4 sektioner. På bænken i nærheden af mikroskopet, udpege områder at placere hætteglassene når fluer har været linet op på puden (en for hvert hjørne af pad).
  2. Forberede hætteglas af alder-matchede, 4-7 dage-gamle, fluer til injektion. For hver stamme at blive testet, overføre 5 hanner og 5 hunner i en frisk, mærket hætteglas af tilberedt flyve mad og holde ved 25 ° C.
  3. Forberede den pneumatiske injektor (Se Tabel af materialer) ved at indstille instrumentet til en 100 ms (korte byger af gas pres for at udvise væske – muliggør levering af sub-nanoliter diskenheder) TIDSINDSTILLET mode.
  4. Forberede objektglas. Skær 1,5-tommer strimler af elektrisk tape, fold ind i en løkke med den klæbende side ud, og sted på en mærket objektglas.

3. Forbered glas kapillær nåle

  1. Trække glas nåle (tynd væg glas kapillærer) ved hjælp af en nål puller.
    1. Hold nålen under mikroskop med et mikrometer og bryde spidsen ved hjælp af #5 fine punkt rustfrit stål pincet. 100 µm tips er tilstrækkelige til at gennembore den flue neglebånd samtidig minimere såret.
    2. Måle volumen af væske, der vil blive injiceret i hvert fly. Indlæse nålen med steril 5% frugtfarve i 1 x PBS og udvise flydende på en dråbe af mineralsk olie på en 0,01 mm objektsmikrometeret.
      Bemærk: Hvis den flydende dråbe er kugleformet, beregnes mængden i picoliters som (størrelse)3/1910. 30 en nål med en 100 µm diameter vil skubbe ~ 2 nL i 100 ms.

4. injicere fluer

  1. Tilsæt 10 µL af 1,6 mg/mL partikler ind på en lille firkant med parafilm.
    1. Trække væsken i nålen og montere injektor dysen (Se Tabel af materialer).
    2. Bedøver fluer med CO2 og line dem op i deres udpegede område på flypad, med den ventrale side opad og hoveder orienteret mod forsiden af puden. Placer hætteglas i tilsvarende områder på bænken.
    3. Injicere fluer i øverste hjørne på maven med 5, 100 ms pumper af væske (~ 10 nL alt).
    4. Overføre de injicerede fluer til de passende hætteglas, Bemærk tidspunktet på hætteglasset. Holde på 25 ° C.
  2. Indlæse en ny kanyle med 0,4% Trypan blå løsning.
  3. Angiv den pneumatiske injektor til GATED, som giver en konstant luftstrøm til at presse væske ud af nålen.
  4. Bedøver fluer, efter de har hvilet i 30 min og injicere med Trypan blå, indtil maven er fuld og udspilet.
    Bemærk: Når du undersøger phagosome modning med partikler mærket med en pH-følsom farvestof, tillade fluer til hvile i 1 time og Injicér ikke med trypan blå før montering fluer.
  5. Mount fluer på objektglas med elektrisk tape, ventrale side ned. Push vinger til siden af flue og sikre dem på båndet. Også, skub forsigtigt hovedet ind i tape til at sikre, at fluen ikke vil flytte.
  6. Straks gå til trin 5.

5. imaging fluer

  1. Billedet flyver, en ad gangen, på 25 x eller 32 x forstørrelse ved hjælp af en omvendt fluorescens mikroskop er knyttet til en digital kamera og computer (Se Tabel af materialer). Fokusere på den dorsale fartøj af fluen ved hjælp af computersoftware til det digitale kamera.
  2. Optage eksponeringstid og forstørrelse mellem eksperimenter.
    Bemærk: At miste overblikket over genotyper er en potentiel kilde til fejl, når man fotograferer flere stammer i et enkelt møde. For at undgå fejlmærkning fluer, skal du notere antal billede af den første og sidste flyve fotografi for hver genotype.

6. kvantificering og normalisering af fluorescens

  1. Åbn softwaren og åbne ét billede ad gangen.
    1. Måle fluorescens-intensiteten af den dorsale fartøj. Tegn en polygon omkring den dorsale fartøj. Vælg målpunkt og optage fluorescens-intensiteten inde i polygonen.
    2. Bestemme baggrunden fluorescens intensitet. Kopier den første polygon og flytte det til et område, der støder op til den dorsale fartøj af fluen. Vælg foranstaltning og optage fluorescens intensiteten af baggrundsområdet.
    3. Normalisere den dorsale fartøj fluorescens af baggrunden fluorescens:
      Dorsale fartøj ÷ baggrund.
    4. Beregne gennemsnittet normaliseret dorsale fartøj fluorescens intensiteten af alle fluer i en stamme.
    5. Gentage forsøget 2 gange.
    6. Brug en studerende er parrede t-testen til at sammenligne de gennemsnitlige relative fluorescens intensiteter af kontrol fluer og teste flyver fra de tre forsøg. Beregne den effekt størrelse ved hjælp af formlen: Cohens d = (M1- M2) ÷ SDpoolede, hvor M1 er middelværdien af genotype 1 og M2 er middelværdien af genotype 2 &
      SD poolede =Equation
      hvor SD1 er standardafvigelsen af genotype 1 og SD2 er standardafvigelsen af genotype 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skematisk af in vivo fagocytose analysen ved hjælp af fluorescein-mærket partikler er vist i figur 1A. Fluer er monteret ventrale side ned på et stykke af elektrisk tape og de første to segmenter af maven, hvor den dorsale fartøj er placeret, er klart synlige (figur 1B). Vigtige kilder til eksperimentel fejl opstår på injektion og imaging trin af proceduren (figur 1 c). Ved hjælp af den samme nål til at injicere flere fluer kan få det til at blive tilstoppet med flyve væv eller partikler (øverste venstre panel i figur 1 c). Fordi Drosophila auto-fluorescerer under normal god landbrugspraksis lys, vil fluer injiceres med en tilstoppet nål fluorescerer svagt men mangler den klare, punktformet fluorescens af partikler internaliseret af hemocytes. En anden potentiel kilde til eksperimentel fejl kan opstå under Trypan blå injektioner. Tredive minutter efter den første injektion med fluorescently mærket partikler, modtager fluer en anden injektion med Trypan blå, som slukker fluorescens af ekstracellulære, un-phagocytosed partikler. Relative fluorescens intensitet for hver flue beregnes ved at dividere fluorescens af den dorsale fartøj med for et lige så mellemstore tilstødende område på maven. Fluer, der ikke får nok Trypan blå fluorescerer lyst i hele deres hele abdomen (nederste venstre panel i figur 1 c). Denne lyse fluorescens kan reducere forholdet mellem den dorsale fartøj til baggrunden fluorescens, dermed faldende sande fluorescens intensitet forholdet af dyret. Endelig fluer skal fotograferes mens immobiliserede af CO2, som aktivt flytte flyver producere slørede billeder, der ikke kan kvantificeres (top og bund, højre paneler af figur 1 c).

Samlingen Zuker er et panel af ethyl methanesulfonate (EMS) behandlet flyver med autosomal mutationer. 31 oprindeligt etableret som en ressource, Fællesskabet i 2004, er linjerne blevet brugt til at foretage forward og reverse genetiske skærme. Vores lab identificeres en linje fra samlingen Zuker, der ikke er i stand til at phagocytosis gram-negative (E. coli K-12 stamme) og gram-positive bakterier (S. aureus træ stamme uden protein A) (figur 2). Denne mutant, kaldet argus, viser næsten ingen dorsale fartøj fluorescens i in vivo fagocytose assay. I forhold til Zuker isogene baggrund stamme, KN bw, argus viser betydeligt mindre udbredelse af E. coli (p-værdi = 0.019; Cohens d = 1.677) og S. aureus (p-værdi = 0.0083; Cohens d = 1.672). Argus bakteriel fagocytose er også væsentligt forringet, E. coli (p-værdi = 0,045; Cohens d = 0.850) og S. aureus (p-værdi = 0.0136; Cohens d = 1.422) i forhold til en anden fælles laboratorium kontrol stamme, Canton-S.

Figure 1
Figur 1: Overblik og repræsentative billeder af in vivo fagocytose assay. A. skematisk af in vivo fagocytose analysen ved hjælp af fluorescein-mærket partikler. To injektioner, 30 minutter fra hinanden, der bruges til visualiseret partikel anerkendelse og optagelse af dorsale fartøj-associerede blodlegemer. B. hvidt lys billede viser en flue monteret på bånd, med klart synlige forreste abdominal segmenter. C. eksempel i vivo fagocytose billeder. (øverst til venstre) En flue injiceres med en tilstoppet nålen har ingen partikel fluorescens. (nederst til venstre) En flue med høj ekstracellulære fluorescens på grund af utilstrækkelig trypan blue. (øverst til højre) En immobilisere flyve med ingen ekstracellulære fluorescens-ideelle billede. (nederst til højre) En flyve flytter skaber som CO2 anæstesi aftager et sløret billede. Skalalinjen, 0,2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Fagocytose af bakterier i mutant og kontrol fluer. A. repræsentative billeder af fagocytose bakterier mærket med fluorescein farvestof; E. coli (top paneler) og S. aureus (bunden paneler). B. fluorescens intensitet forholdet mellem flyver injiceres med fluorescein -E. coli partikler. C. fluorescens intensitet forholdet mellem flyver injiceres med fluorescein -S. aureus partikler. n = 3 forsøg for hver type af bakterier, med 6-8 fluer per eksperiment. Fejllinjer, ± SEM. statistisk analyse = tosidet t -test. Skalalinjen, 0,2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kommercielt tilgængelige, fluorescently mærket partikler bruges til at vurdere fagocytose i almindelighed (0,2 µm carboxylat modificerede mikrokugler) eller fagocytose af mikrober (fluorescently mærket varme - eller kemisk dræbte bakterier eller gær). For at vurdere phagosome modning, kan forskere vælge partikler mærket med en pH-følsom farvestof, der fluorescerer når pH falder fra neutral til Sure, som i phagolysosome. Alternativt, for at undersøge de indledende trin i fagocytose, patogen anerkendelse og optagelse, forskere bør vælge partikler mærket med fluorescerende tags, der fluorescerer i og uden for cellerne.

Omhyggeligt kontrolleret forsøgsbetingelser er nøglen til at sikre in vivo fagocytose analysen udføres på en reproducerbar måde. Først, Drosophila gennemgår cellulære immunosenescence32, så fluerne bruges i eksperimentet skal alder-matchede, optimalt inden for en række 4-7 dage gamle. Andet, perioden mellem injektioner bør være konsekvent. Fagocytose opstår hurtigt, inden for få minutter af cellen vært sensing mikrobe14. Over den næste time finder phagosome modning sted, fører til forsuringen af phagosome og ødelæggelse af den internaliseret mikrobe. Udpege et sæt interval til at vente mellem injektioner reducerer eksperimentel variation og giver mulighed for sammenligninger mellem stammer og eksperimenter udført på forskellige dage. Vi anbefaler venter på tredive minutter når ved hjælp af fluorescein partikler og en time for in vivo phagosome modning analysen ved hjælp af partikler mærket med pH-følsom fluorescerende farvestof.

Ved hjælp af den samme nål til at injicere flere stammer sikrer, at alle fluer modtager den samme dosis af partikler og eksperimentel variation kan opstå hvis glas nåle pause eller bliver fyldt op. Så er oprettelsen af injektion station og fluer på forhånd nøglen til at sikre, at in vivo fagocytose analysen udføres hurtigt og effektivt. Før du starter eksperimentet, måle mængden af væske udvist af flere nåle og bevare et sæt af nåle af samme størrelse. Således, hvis en nål pauser mellem injektioner, det kan erstattes umiddelbart. Desuden tilstoppede nåle kan føre til falsk negative resultater, hvilket gør det vanskeligt at skelne mellem fluer hvis hemocytes ikke er i stand til at phagocytosis mikrober og fluer, som ikke modtog fluorescerende partikler. Farvestof løsninger lavet med grøn frugtfarve, gøre det lettere at spore, hvilke fluer har været injiceres og til at identificere problemer med tilstoppede nåle. Ideelt, eksperimentet skal udføres flere gange, med mindst 6-8 fluer per stamme i hvert forsøg, og resultaterne af forsøg i forhold til at identificere outliers. Endelig bør nok Trypan blå administreres for at fuldt slukke fluorescens af ekstracellulære partikler, således at baggrunden Fluorescens er sammenlignelige imellem fluer (figur 1 c).

Når imaging fluer, skal også sørges at opnå klare og ensartede billeder af den dorsale fartøj. Sort elektrisk tape bruges til at oprette en mørk baggrund og fluer skal være monteret ventrale side ned, med deres vinger og hoved fastgjort til den selvklæbende side af båndet. Hvis det er muligt, bør fluer forblive immobiliseret under CO2 , mens billeder er taget. Endelig, for at begrænse muligheden for eksperimenterende bias, vi anbefaler at bruge en blindet eksperimentel opsætning; hvor hætteglas og stammer, der er kodet af en forsker og eksperimentet udføres og kvantificeres ved en anden forsker.

In vivo fagocytose analyse er et nyttigt værktøj til at identificere globale defekter i fagocytose. Det skelner dog ikke mellem hemocyte fagocytose effektivitet og forskelle i hemocyte nummer eller placering, på grund af aldersbetingede nedgang eller udviklingsmæssige defekter. 32 endvidere proceduren indeholder ikke oplysninger om forskelle i størrelse eller fagocyterende kapacitet af individuelle hemocytes. Således, når fluer med reduceret fagocytose er blevet identificeret ved hjælp af in vivo fagocytose assay, forskere bør foretage opfølgende undersøgelser, måske ved hjælp af alternative partikler, for at forskelsbehandle immun-relaterede fagocytose defekter og generelle fagocyterende defekter. I sidste instans, bestemmelse af de molekylære mekanismer, der ligger bag fagocyterende defekter i mutantstammen kræver en undersøgelse af fagocytose i enkelt hemocytes. Dette kan være dygtig brug, for eksempel, Konfokal mikroskopi, fluorescens aktiveret celle sortering eller magnetisk bead isolation af voksen hemocytes27,28,29,32,33 , 34.

Samlet set Drosophila har vist sig for at være en effektiv model til at studere medfødt immunitet med levende dyr. Her har vi givet en oversigt over in vivo fagocytose assay, en metode til at studere den globale fagocytose og cellulære immunrespons i voksne fluer. Proceduren kan anvendes til at screene for nye gener, der kan være vigtige for værten forsvar, validere gener identificeret i storstilet in vitro-RNAi skærme og yderligere karakterisere mutanter med defekter i de humorale, gut eller antivirale immunrespons. Det er nemt at sætte op og kan give en stor mængde af pålidelige data om flere stammer af fluer i en kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Beth Gonzalez og Dr. Aprajita Garg for støtte i udførelsen af in vivo fagocytose eksperimenter. En NSF UMD ADVANCE frø Grant og UMD NIH T32 stipendier, celle og molekylærbiologi (CMB) og vært-patogen interaktioner (HPI), finansieret dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres Invitrogen F8810 Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen E13231 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen E23370 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen P35361 Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen A10010 Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen S23371 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen S23372 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2851 Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) Zeiss SteREO Discovery.V8 Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Z23373 Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen Z23374 Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen Z2841 Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red Invitrogen Z2843 Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
  3. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
  4. Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
  5. De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
  6. Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
  7. Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
  8. Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
  9. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
  10. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
  11. Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
  12. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
  13. Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
  14. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
  15. Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
  16. Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
  17. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
  18. Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
  19. Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  20. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
  22. Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
  23. Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
  24. Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
  25. Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
  26. Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
  27. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  28. Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
  29. Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
  30. Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
  31. Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
  32. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  33. Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
  34. Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 146 fagocytose bakterier cellulær immunitet Drosophila melanogaster medfødt immunitet voksen
Vurdering af cellulære immunrespons i frugtflue <em>Drosophila melanogaster</em>, ved hjælp af en i Vivo fagocytose Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P.… More

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay. J. Vis. Exp. (146), e59543, doi:10.3791/59543 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter