Summary
这里介绍的是一个协议,用于测量增殖CD4+ T细胞,以响应抗原蛋白或肽使用染料稀释。这种测定对稀有抗原特异性T细胞特别敏感,可以进行改性,以利于抗原特异性细胞的克隆。
Abstract
所述是一种简单的体外染料稀释方法,用于测量人类外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CD4+T细胞增殖。稳定、无毒的荧光染料(如卡博基氟辛苏奇尼酰基酯(CFSE)的开发,通过减少荧光染色(通过流式细胞测定)来区分稀有的抗原特异性T细胞。与替代方法不同,此方法具有以下优点:(i) 对低频 T 细胞非常敏感,(ii) 不需要抗原或表位的知识,(iii) 可以分析响应细胞的表型,以及 (iv) 可行、有反应的细胞可以排序,并用于进一步分析,如T细胞克隆。
Introduction
检测和研究抗原特异性T细胞的能力在细胞介导免疫研究中非常重要。然而,这样做对于自身抗原特异性CD4和T细胞反应尤其具有挑战性,后者非常弱,难以检测。用于检测抗原特异性淋巴细胞增殖的常用方法是[3H]-胸腺素,这是一种放射性标记的核苷酸,并结合在增殖细胞的DNA中。虽然[3H]-胸腺酰胺测定可以检测DNA合成,但这种方法是细胞分裂的间接测量,因为DNA合成可以独立于线粒体分裂(即,在基因复制和凋亡1期间)启动。由于细胞抗原特异性增殖可导致大量细胞凋亡,导致抗原特异性增殖的潜在高估,使这一问题更加复杂。此外,[3H]-胸腺素法不为扩散淋巴细胞提供花样信息,如CD4+或CD8+在受抗原肽刺激的PBMC中系生增殖。
2003年,我们发布了第一个使用CFSE的染料稀释测定,称为CFSE增殖测定3,4。CFSE 是一种荧光染料,通过与细胞内溶酶残留物形成共价键,与细胞内蛋白质形成稳稳结合。由于CFSE标记的蛋白质在子细胞3之间平均分配,分裂细胞可以通过流动细胞测定来区分未分割的细胞,这也允许淋巴细胞群的定量型型。事实上,细胞从CFSE染色时开始经历的分裂数量可以测量到一定程度5。最近,许多类似的染料,如细胞跟踪紫罗兰增殖染料(VPD)和细胞跟踪染料已经开发出来,它们的工作方式相似6。该协议侧重于 CFSE,但这些原则同样适用于其他相关染料。
肽-MHC四聚体染色是检测和克隆抗原特异性CD8+T细胞的广泛使用的方法。这是一个公认的方法7,8,9,10;然而,基于四元体的克隆需要现有的表位/MHC限制知识,每个表位都需要自己的四元体11,这限制了发现和克隆新型表位特异性T细胞的范围。基于CFSE的增殖可用于肽、蛋白质或细胞裂物。本文所述的协议既简单又坚固,响应CD4+T细胞可分类,用于下游功能和生化表征测定12,13。
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Protocol
所有受试者在采集外周血之前都给予知情同意。圣文森特霍斯普蒂亚尔(HREC-A 135/08和HREC-A 161/15)对使用PBMC的实验给予伦理批准。
1. 试剂制备
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人类T细胞培养基
- 准备RP-5培养PBMC,包括RPMI 1640、1x非必需氨基酸、L-丙烯-谷肽(2 mM)、青霉素(100 U/mL)/链霉素(0.1毫克/mL)和5%的人类血清(PHS)。
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CFSE 库存解决方案
- 通过在+9 mL DMSO中溶解25毫克CFSE,制备主库存,以达到浓度为5 mM的最终库存溶液。
- 通过稀释 PBS 中的主库存来准备工作库存,以实现 10 μM 的工作浓度。
2. 全血制备人体多溴联苯细胞
- 人外周血一般在0.5~1.5×106 PBMC/mL之间。因此,所需血液量取决于所需数量的PBMC。用PBS至少稀释人外周血1:2。通过在 50 mL 管中加入 15 mL 的密度梯度介质,然后覆盖 35 mL 稀释的全血,分离 PBMC。
- 在室温 (RT) 下,在 850 x g下离心 15 分钟,不减速。这将导致三个清晰的层:包含红血球颗粒的底层,中间层的密度梯度介质与白血球衬里其顶部界面,和顶部血浆层14。
- 拆下大约 20 mL 的顶层等离子层。收集白血球层,小心避免红细胞颗粒。用PBS洗涤3x,在血细胞计上使用锥形蓝色排除计数活细胞。在 PBS 中稀释至 1 x 106 PBMC/mL。
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非CFSE染色细胞
- 这些细胞用作流动细胞学的补偿控制,包括未染色和CD4+单染色细胞。将每个控制样品的300 μL PBMC悬浮液加入10 mL管中,顶部加PBS,在550 x g下在RT下5分钟离心。
- 在 RP-5 介质中重新悬浮 1 x 106个单元/mL。用CFSE标记的细胞在37°C/5%CO2培养箱中孵育这些未标记的细胞7天(步骤2.6.1)。
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CFSE 染色细胞
- 将细胞从步骤 2.3 转移到 50 mL 管中。将 1.0 μL 的 CFSE 工作库存溶液 (10 μM) 每 1 mL 的电池悬浮液添加到管侧。通过多次反转管快速混合。CFSE的最终浓度为10 nM。
- 在37°C/5%CO2培养箱中孵育5分钟。为了停止染色,加入5 mL的RP-5介质,在550 x g下通过离心5分钟颗粒细胞。在 RP-5 介质中以 1 x 106/mL 重新悬浮 PBMC。
- 将1.0 mL的细胞悬浮液添加到10 mL管中。对要测试的每个抗原使用一根管子。
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人类PBMC和细胞培养的抗原刺激
- 在37°C/5%CO2培养箱中培养带有抗原的含有抗原的PBMC。 在含有稀释抗原的RP-5介质的100μL/孔的96孔板中培养1 x 105细胞/孔(100μL)。
注:使用的抗原,包括工作浓度,在表1中概述。
- 在37°C/5%CO2培养箱中培养带有抗原的含有抗原的PBMC。 在含有稀释抗原的RP-5介质的100μL/孔的96孔板中培养1 x 105细胞/孔(100μL)。
3. 用于 FACS 分析的抗 CD4 染色
- 将培养细胞的移液200μL放入FACS管中,在含有0.1%FCS的PBS中洗涤细胞1x,在550 x g下离心5分钟。
- 在 100 μL 的 PBS/0.1% FCS 中染色,带抗人 CD4 Alexa Fluor 647 (0.25 mg/mL)。留出一个CFSE标记细胞的样本,未与任何其他荧光道染色,用于设置FACS CFSE补偿。在4°C下孵育细胞,防止光线照射20分钟。
- 通过加入1 mL的PBS/0.1%FCS清洗细胞,在550 x g下在RT下离心5分钟,并在100μL的PBS/0.1%FCS中重新悬浮。在FACS分析之前,在所有管中加入1μL的碘化钠(PI,0.1 mg/mL),以便通过流动细胞学排除死细胞。
4. 流式细胞测量配置和浇注策略
注:图 1显示了 FACS 配置,包括补偿控制和门控策略。
- 门正向散射 (FSC) 与侧散射 (SSC) (图 1A) 总体,以包括所有淋巴细胞。
- 将FSC与PI(图1B)总体在PI负细胞上,以排除凋亡细胞。
- 使用未染色的细胞为非荧光细胞设置电压基线。设置 CD4-A647 和 CFSE 的电压,使每个荧光信号低于 1,000(图1C)。使用单色控制 CFSE (图 1D) 和 CD4-A647 (图 1E) 使用未染色电池的电压来确认每种颜色的正荧光信号 (+10,000)。
- CFSE 和 PI 有一些光谱重叠;调整补偿以从CFSE荧光中减去PI荧光,直到仅CFSE样品在PI通道中产生信号。
注:这些门适用于本文分析的所有样品。
5. 计算细胞分裂指数,以枚举抗原特异性CD4+ T细胞增殖
注:细胞分裂指数 (CDI) 是指每 5,000 个未分割细胞 (CD4+/ CFSE明亮) 的分裂细胞数 (CD4+/CFSE暗数)。当未分割 CD4+细胞的数量不完全为 5,000 时,将更正分割的细胞数以表示每 5,000 个未分割细胞的分裂细胞数。例如,使用破伤风类毒素特异性增殖(图2D),有4,930个未分割细胞(CFSE明亮)和3,268个分裂细胞(CFSE暗);因此,被修正的分裂细胞数为(5,000/4,930) x 3,268 = 3,304.3。
- 计算CDI(表1),方法是将抗原刺激组中的分裂细胞数/5,000个未分割细胞数除以未培养的未抗原细胞的平均分裂细胞数(每5,000个未分割细胞)。
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Representative Results
用破伤风类毒素蛋白对人PBMC进行体外刺激:在破伤风类毒素存在的情况下,PBMC被染色,并在破伤风类毒素下被刺激7天。几乎所有的捐赠者都表现出强烈的T细胞对破伤风类毒素的反应,因为他们已经接种了疫苗,这使得破伤风类毒素是一种有用的阳性控制抗原。图2在三联中显示,CD4+ T细胞从未刺激的PBMC中增殖最小(±12 CFSE暗细胞;图 2A,B,C ,同时CD4+T细胞在响应破伤风类毒素(>3,000 CFSE暗细胞)时有明显增殖;图 2D,E,F)。
用抗原肽对人PBMC进行体外刺激:PBMC在人胰岛素C-肽存在的情况下被染色,并在存在的情况下被刺激7天。图3显示了在1型糖尿病患者的外周血中检测了蛋白酶C-肽特异性CD4+T细胞。健康捐赠者的PBMC未观察到扩散(未显示数据)。在图4中,受甲型流感病毒(H1N1 PR8)基质蛋白刺激的PBMC显示增殖;然而,对该捐赠者的破伤风特异性反应相对较弱,捐助者之间的反应一般是可变的。
综合起来,这些结果表明,可以使用全长蛋白质和短合成肽进行测定。
图1:基于CFSE的CD4+T细胞增殖的补偿控制和浇注策略。在体外细胞培养7天后,未刺激的PBMC。淋巴细胞 (A) 被染色碘化钠, 和碘化物阴性细胞被封闭以排除死细胞 (B).FACS补偿控制包括未染色的细胞(C),单独沾染CFSE的细胞(D),以及仅沾有CD4(E)的细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:CFSE染色破伤风特异性CD4+T细胞增殖。PBMC在存在145纳克/mL(166 lfU/mL)破伤风类毒素的情况下,对CFSE进行染色和培养7天。细胞被CD4染色。CFSE稀释显示没有抗原(A-C) 和响应破伤风类毒素蛋白 (D-F).请点击此处查看此图的较大版本。
图3:CFSE染色人类CD4+T细胞在反应蛋白酶C-肽时增殖。在存在10μM蛋白酶酸蛋白酶酸酶的P-肽下培养了7天。细胞被CD4染色。CFSE稀释显示使用PBMC从1型糖尿病的捐赠者。CFSE稀释在未刺激的PBMC (A),破伤风类毒素蛋白刺激(B)和人亲胰岛素C-肽刺激PBMC (C )。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:CFSE染色人类CD4+T细胞增殖,以响应甲型流感病毒(H1N1 PR8)基质蛋白1。PBMC在存在0.08微克/mL流感病毒基质蛋白1的情况下,对CFSE进行染色和培养7天。细胞被CD4染色。CFSE稀释显示未刺激细胞(A)、破伤风类毒素刺激细胞(B)和甲型流感病毒基质蛋白刺激细胞(C)。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 抗原 | 工作浓度 |
| 破伤风类毒素蛋白 | 145 纳克/升 |
| 甲型H1N1流感(PR8)基质蛋白1 | 0.08±10 μg/mL |
| 蛋白酶C-肽PI33-63 | 10 nM |
表1:破伤风特异性CD4+增殖的枚举。CDI计算使用5,000个记录的流细胞学事件来自未刺激和破伤风刺激的人类PBMC。
| 样品 | 未分割细胞 CD4=CFSE明亮 | 分裂细胞 CD4=CFSE变暗 | 分细胞数量 CFSE暗淡/5,000 CFSE明亮 | 平均分裂细胞 CFSE暗淡/5,000 CFSE明亮 | |
| 无 1 | 5,004 | 11 | 11 | 12.3 | |
| 无 2 | 4,995 | 14 | 14 | ||
| 无 3 | 5,006 | 12 | 12 | ||
| 样品 | 未分割细胞 CD4=CFSE明亮 | 分裂细胞 CD4=CFSE变暗 | 分细胞数量 CFSE暗淡/ 5000 CFSE明亮 | CDI 分裂细胞数 (破伤风) 平均分裂细胞 (无) | 平均 CDI |
| 破伤风 1 | 4,930 | 3,258 | 3,304.3 | 268 | 263.7 |
| 破伤风 2 | 4,928 | 3,205 | 3,251.8 | 263.7 | |
| 破伤风 3 | 4,910 | 3,142 | 3,199.6 | 259.5 |
表2:用于模拟CD4+增殖的抗原。
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Discussion
基于CFSE的增殖是检测和枚举抗原特异性人类CD4+T细胞的简单而可靠的方法。此前已经证明,使用CFSE的最佳浓度对于最佳结果4至关重要。过多的CFSE会废除增殖,而太少不允许分离和未分割的细胞被区分。相比之下,相对较高的CFSE浓度(5.0μM)用于标记纯化的鼠T细胞3。由于批次之间的变异性,建议对每批进行定位,以确定最佳浓度。我们使用当前批次的浓度(10 nM)远低于原始出版物(200 nM)4。
该方法的另一个重要方面是优化抗原剂量。已经证实,培养抗原较少的T细胞可以更敏感,并表现出增强的功能。这最初是在HIV肽15的背景下证明的。该协议中使用的破伤风类毒素的量以前也经过优化,以引起高度敏感和增殖的CD4+ T细胞。有趣的是,它之前已经表明,过量的抗原减少抗原特异性增殖15。因此,在外周血中检测和枚举稀有T细胞群,优化抗原和CFSE浓度至关重要。
自从我们发表了第一个基于人类染料稀释的测定法4以来,已经开发出许多类似的染料。我们发现,当使用PKH-26(一种亲脂染料)与CFSE(未发布)相比时,CD4和T细胞增殖检测效果较差。我们没有系统地测试市场上的其他染料,因此没有评论它们的相对优势。然而,量化T细胞增殖的规程同样适用于所有染料稀释增殖测定。
将增殖表示为细胞分裂指数(CDI),将背景扩散纳入响应量的计算中。在我们手中,背景通常较低(例如,<15 事件/5,000 CD4= CFSE明亮)。背景扩散确实因个体和实验而异。使用比率(在本例中为 CDI)来表达扩散强度在一定程度上减少了其对结果的影响。对介质中蛋白质的背景反应可能会有问题。建议使用含有人类血清的组织培养培养物,而不是牛血清,因为牛蛋白可以刺激弱背景反应,降低测定的敏感性。在轻度感染者中发现高背景扩散,大概是由于在体内因感染而繁殖所致。在这种情况下,一旦捐赠者清除了感染,就需要重复测定。
基于CFSE的增殖测定可以修改,直接从PBMC12中有效克隆人类抗原特异性CD4+T细胞。 例如,这种方法已经用于克隆CD4+T细胞,具体用于胰岛素12。最近,对蛋白酶C-肽特异性CD4和T细胞的克隆和功能分析为T1D的发病机制提供了非凡的见解,特别是在最近发病的T1D13患者中。
总之,基于CFSE的增殖测定既敏感又可靠。它快速和技术简单,可以使用新鲜或冷冻的PBMC执行。将CFSE纳入多色FACS分析的能力提供了来自PBMC的增殖T细胞的免疫表型的定量测量,这种细节在利用DNA结合的测定中是不可能的如[3H]-硫酰胺。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了:青少年糖尿病研究基金会的支持[JDRF 5-CDA-2014-210-A-N](S.M.)。国家健康和医学研究委员会(NHMRC GNT123586)(S.M.),糖尿病澳大利亚研究信托千年奖(Y17M1-MANS)(S.M.),维多利亚州政府运营基础设施支助计划(S.M.,A.D.,E.T.,M.S.)和NHMRC研究生奖学金APP1094337和JDRF博士补发奖学金(硕士)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
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