Summary
Præsenteret her er en protokol til måling af prolifererende CD4+ T- celler som reaktion på antigene proteiner eller peptider ved hjælp af Dye fortynding. Denne analyse er særligt følsom over for sjældne antigen-specifikke T-celler og kan modificeres for at lette kloning af antigen-specifikke celler.
Abstract
Beskrevet er en simpel, in vitro, farve fortyndingsbaseret metode til måling af antigen-specifik CD4+ T- celle proliferation i humant perifert blod mononukleære celler (PBMCs). Udviklingen af stabile, ikke-giftige, fluorescerende farvestoffer såsom carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) gør det muligt at skelne sjældne, antigen specifikke T-celler fra tilskuere ved formindskelse i fluorescerende farvning, som detekteres af flowcytometri. Denne metode har følgende fordele i forhold til alternative tilgange: (i) det er meget følsomt over for lavfrekvente T-celler, (II) ingen viden om antigen eller epitop er påkrævet, (III) Fænotypen af de responderende celler kan analyseres, og (IV) levedygtige, reagerer celler kan sorteres og bruges til yderligere analyse, såsom T-celle kloning.
Introduction
Evnen til at detektere og studere antigen specifikke T-celler er vigtig i undersøgelser af cellemedieret immunitet. Det er dog særligt udfordrende for auto antigen-specifikke CD4+ T-celle-respons, som er meget svage og svære at detektere. En fælles metode til påvisning af antigen-specifik lymfocyt proliferation er [3H]-thymidin, som er en radioaktivt mærket nukleotid indarbejdet i DNA af prolifererende celler. Selv om [3H]-thymidinanalysen kan detektere DNA-syntese, er denne metode en indirekte måling af celledeling, fordi DNA-syntesen kan initiere uafhængigt af mitose (dvs. under genduplikering og apoptose1). Dette problem forværres af, at antigen specifik spredning af celler kan resultere i betydelig apoptose2, hvilket fører til potentiel overvurdering af antigen specifik spredning. Desuden giver [3H]-thymidinmetoden ikke fænotypiske oplysninger til prolifererende lymfocytter, såsom CD4+ eller CD8+ Lineage proliferation i pbmcs stimuleret med antigene peptider.
I 2003 udgav vi den første farve fortyndingsanalyse ved hjælp af cfse, kaldet cfse-baseret proliferation assay3,4. CFSE er et fluorescerende farvestof, der binder stabilt til intracellulære proteiner ved at danne en kovalent binding til intracellulære lysin rester. Da CFSE-mærkede proteiner er fordelt ligeligt blandt datter celler3, kan celler, der har delt, skelnes fra ikke-opdelte celler ved flow cytometri, hvilket også giver mulighed for kvantitativ fænotype af lymfocyt populationer. Faktisk kan antallet af divisioner, en celle har gennemgået fra tidspunktet for CFSE-farvning, måles til en vis grad5. For nylig, mange lignende farvestoffer såsom CellTrace violet spredning farvestof (VPD) og CytoTrack farvestof er blevet udviklet, som arbejder på en lignende måde6. Denne protokol fokuserer på CFSE, men principperne gælder også for andre relaterede farvestoffer.
Peptid-MHC transthyretin farvning er en almindeligt anvendt metode til påvisning og kloning antigen-specifikke CD8+ T-celler. Dette er en veletableret metode7,8,9,10; imidlertid kræver transthyretin-baseret kloning eksisterende viden om epitop/MHC-begrænsningen, og hver epitop kræver sin egen transthyretin11, hvilket begrænser omfanget af opdagelsen og kloning af nye epitop-specifikke T-celler. Den CFSE-baserede spredning kan anvendes med peptider, proteiner eller celle lysates. Den protokol, der er beskrevet heri, er både enkel og robust, og de responderende CD4+ T- celler kan sorteres til brug i downstream funktionelle og biokemiske karakterisering assays12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgspersoner gav informeret samtykke forud for indsamlingen af perifert blod. Etisk godkendelse af forsøg med PBMC blev givet af St. Vincents Hosptial (HREC-A 135/08 og HREC-A 161/15).
1. klargøring af reagens
-
Menneskelige T-celle medier
- Forbered RP-5 medier til dyrkning PBMC, som består af RPMI 1640, 1x ikke-essentielle aminosyrer, L-alanyl-L-glutamin dipeptid (2 mM), penicillin (100 U/mL)/streptomycin (0,1 mg/mL), og 5% poolede humane serum (PHS).
-
CFSE Stock-løsninger
- Forbered en Master bestand ved at opløse 25 mg CFSE i ~ 9 mL DMSO for at opnå en endelig stamopløsning med en koncentration på 5 mM.
- Forbered en arbejds bestand ved at fortynde Master bestanden i PBS for at opnå en arbejds koncentration på 10 μM.
2. klargøring af humane Pbmc'er fra fuldblod
- Der er generelt mellem 0,5-1.5 x 106 pbmcs/ml humant perifert blod. Derfor afhænger mængden af blod, der kræves, af det ønskede antal Pbm'er. fortyndet humant perifert blod med PBS mindst 1:2. Du skal adskille Pbmc'erne ved at tilsætte 15 mL tætheds gradient medium til et 50 mL rør og derefter overlejre 35 mL fortyndet fuldblod.
- Centrifugeres ved 850 x g i 15 minutter uden deceleration ved stuetemperatur (RT). Dette vil resultere i tre klare lag: det nederste lag, der indeholder den røde blodlegemer pellet, mellemlag af tæthed gradient medium med hvide blodlegemer foring sin øverste grænseflade, og top plasma lag14.
- Fjern ca. 20 mL af det øverste plasma lag. Indsamle det hvide blodlegemer lag, at være omhyggelig med at undgå den røde blodlegemer pellet. Vask 3x med PBS og Tæl levedygtige celler ved hjælp af trypan og et blå udelukkelse på et hemocytometer. Fortyndes til 1 x 106 pbmcs/ml i PBS.
-
Ikke-CFSE-farvede celler
- Disse celler anvendes som kompensations kontrol for flowcytometri, bestående af ufarvede og CD4+ enkeltfarvede celler. Der tilsættes 300 μL af hver kontrolprøve PBMC suspension til et 10 mL rør, top med PBS, og centrifugeres ved 550 x g i 5 min ved rt.
- Resuspension 1 x 106 celler/ml i RP-5 medier. Disse ikke-mærkede celler inkubates i 7 dage i en 37 °C/5% CO2 -inkubator med de cfse-mærkede celler (trin 2.6.1).
-
CFSE-farvede celler
- Overfør cellerne fra trin 2,3 til et 50 mL rør. Tilsæt 1,0 μL CFSE-arbejds stamopløsning (10 μM) pr. 1 mL cellesuspension til siden af røret. Bland hurtigt ved at invertere røret flere gange. Den endelige koncentration af CFSE er 10 nM.
- Inkubér i 5 minutter i en 37 °C/5% CO2 -inkubator. For at stoppe farvning tilsættes 5 mL RP-5-medier, pellet cellerne ved at centrifuger i 5 min ved 550 x g. Opsæt Pbmc'erne igen ved 1 x 106/ml i RP-5-medier.
- Tilsæt 1,0 mL cellesuspension til et 10 mL rør. Brug et rør til hvert antigen, der skal testes.
-
Antigene stimulering af humane PBMCs og cellekultur
- Kultur Human CFSE-mærkede Pbmc'er med antigener i RP-5-medier i 7 dage i en 37 °C/5% CO2 -inkubator. Kultur 1 x 105 celler/brønd (100 μl) i en 96 brønd plade med 100 μl/BRØND af RP-5-medier indeholdende fortyndet antigen.
Bemærk: de anvendte antigener, herunder arbejds koncentrationer, er opsummeret i tabel 1.
- Kultur Human CFSE-mærkede Pbmc'er med antigener i RP-5-medier i 7 dage i en 37 °C/5% CO2 -inkubator. Kultur 1 x 105 celler/brønd (100 μl) i en 96 brønd plade med 100 μl/BRØND af RP-5-medier indeholdende fortyndet antigen.
3. anti-CD4-farvning til FACS-analyse
- Pipetten 200 μL af de dyrkede celler i FACS-rør, vask cellerne 1x i 1,0 mL PBS indeholdende 0,1% FCS, og centrifuge i 5 min ved 550 x g.
- Pletten med anti-humant CD4 Alexa fluor 647 (0,25 mg/mL) i 100 μL PBS/0,1% FCS. Hold en prøve af CFSE-mærkede celler, der ikke er plettet med andre fluorophorer, til at bruge til at fastsætte FACS CFSE-kompensationen. Cellerne inkubates ved 4 °C beskyttet mod lys i 20 minutter.
- Cellerne vaskes ved at tilføje 1 mL PBS/0,1% FCS, centrifugeres ved 550 x g i 5 minutter ved RT og resuspenderes i 100 μl PBS/0,1% FCS. Umiddelbart før FACS-analysen tilsættes 1 μl propidium kaliumiodid (PI, 0,1 mg/ml) til alle rør for at gøre det muligt at udelukke de døde celler ved flow cytometri.
4. flow Cytometrisk konfiguration og gating strategi
Bemærk: Figur 1 viser FACS-konfigurationen, herunder kompensations kontrol og gating-strategi.
- Gate Forward scatter (FSC) vs. side scatter (SSC) (figur 1a) population til at omfatte alle lymfocytter.
- Gate FSC vs. PI (figur 1b) populationen på pi negative celler for at udelukke apoptotiske celler.
- Brug ufarvede celler til at indstille en spændings baseline for ikke-fluorescerende celler. Indstil spændingerne for CD4-A647 og CFSE, således at fluorescens signalet er under 1.000 for hver (figur 1c). Brug den enkelte farve kontrol CFSE (figur 1d) og CD4-A647 (figur 1E) til at bekræfte positive fluorescerende signaler (~ 10.000) for hver farve ved hjælp af de spændinger, der er sat med ufarvede celler.
- CFSE og PI har nogle spektral overlap; Juster kompensationen for at trække PI fluoresence fra CFSE-fluoresence, indtil prøven CFSE-only ikke giver et signal i PI-kanalen.
Bemærk: Disse porte blev anvendt på alle prøver analyseret heri.
5. beregning af celle divisions indekset for at optælle antigen specifik CD4+ T- celle spredning
Bemærk: Celledivisions indeks (CDI) refererer til antallet af opdelte celler (CD4+/cfseDim) pr. 5.000 ikke-opdelte celler (CD4+/cfseBright). Når antallet af ikke-opdelte CD4+- celler ikke er nøjagtigt 5.000, korrigeres antallet af opdelte celler for at udtrykke antallet af opdelte celler pr. 5.000 ikke-opdelte celler. For eksempel, ved hjælp af stivkrampe toxoid-specifik spredning (figur 2D), der var 4.930 ikke-opdelte celler (cfseBright) og 3.268 opdelte celler (cfseDim); Derfor er det korrigerede antal opdelte celler (5000/4930) x 3.268 = 3.304,3.
- CDI (tabel 1) beregnes ved at dividere antallet af opdelte celler/5000 ikke-opdelte celler fra den antigen stimulerede gruppe med det gennemsnitlige antal opdelte celler (pr. 5.000 ikke-opdelte celler) fra de celler, som dyrkes uden antigen (tabel 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro stimulation af humane pbmcs med stivkrampe tetanustoksoid protein: pbmcs blev plettet med cfse og stimuleret i 7 dage i nærværelse af stivkrampe tetanustoksoid. Næsten alle donorer viste en stærk T celle respons på stivkrampe tetanustoksoid, fordi de var blevet vaccineret, hvilket gør stivkrampe tetanustoksoid en nyttig positiv kontrol antigen. Figur 2 viser i tre eksemplarer, at cfse-SPREDNINGEN af CD4+ T- celler fra Ustimulerede pbm'er var minimal (~ 12 cfse-Dim -celler; Figur 2a , B, C), mens der var en markant spredning af CD4+ T- celler som respons på stivkrampe tetanustoksoid (> 3000 cfseDim celler; Figur 2D , E, F).
In vitro-stimulering af humane Pbmc'er med antigene peptider: PBMCs blev plettet med CFSE og stimuleret i 7 dage i nærværelse af humant proinsulin C-peptid. Figur 3 viser påvisning af proinsulin C-peptid-specifikke CD4+ T-celler i det perifere blod hos en enkelt person med type 1-diabetes. Spredning blev ikke observeret i den raske donors PBMC (data ikke vist). I figur 4, pbmcs stimuleret med influenza A virus (H1N1 PR8) Matrix protein påvist spredning; det tetanus-specifikke respons for denne donor var imidlertid relativt svagt, og svarene er generelt variable mellem donorer.
Tilsammen viser disse resultater, at analysen kan udføres ved hjælp af fuld længde proteiner og korte syntetiske peptider.
Figur 1: kompensations kontrol og gating-strategi for CFSE-baseret spredning af CD4+ T-celler. Ustimulerede Pbm'er efter 7 dages in vitro-cellekultur. Lymfocytter (A) blev plettet med propidium iodide, og propidium iodide-negative celler blev gated for at udelukke døde celler (B). FACS-kompensations kontrol inkluderede celler med unstained (C), celler, der er plettet med cfse alene (D), og celler, der er plettet med CD4 alene (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: spredning af CFSE-farvede tetanus-specifikke CD4+ T-celler. Pbmcs var cfse-farvede og dyrkede i 7 dage i nærværelse af 145 ng/ml (166 LFU/ml) stivkrampe toxoid. Celler blev plettet med CD4. Cfse-fortynding vises uden antigen (A-C) og som reaktion på stivkrampe tetanustoksoid protein (D-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: spredning af CFSE-farvede humane CD4+ T-celler som respons på proinsulin C-peptid. Cfse-farvede Pbm'er blev dyrket i 7 dage i nærværelse af 10 μM proinsulin C-peptid. Celler blev plettet med CD4. CFSE-fortynding vises ved hjælp af PBMC fra en donor med type 1-diabetes. Cfse fortynding i ustimuleret pbmcs (A), stivkrampe tetanustoksoid protein stimuleret (B), og humant proinsulin c-peptid stimuleret pbmcs (c). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: spredning af CFSE-farvede humane CD4 + T-celler som reaktion på influenza A-virus (H1N1 PR8) Matrix protein 1. Pbmc'er var CFSE-farvede og dyrkede i 7 dage ved tilstedeværelse af 0,08 μg/mL influenza A-virus matrix protein 1. Celler blev plettet med CD4. Cfse fortynding er vist for ustimulerede celler (A), stivkrampe tetanustoksoid-stimulerede celler (B) og influenza A-virus matrix protein-stimuleret celler (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Antigen | Arbejds koncentration |
| Tetanus toxoid protein | 145 ng/mL |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | 0,08 – 10 μg/mL |
| Proinsulin C-peptid PI33-63 | 10 nM |
Tabel 1: opregning af tetanus-specifik CD4+ -proliferation. CDI beregninger ved hjælp af 5.000 registrerede flow cytometri hændelser fra ustimuleret og tetanus-stimuleret humant PBMC.
| Prøve | Ikke-opdelte celler CD4+cfseBright | Opdelte celler CD4+cfseDim | Antal opdelte celler CFSEDim/5.000 cfseBright | Gennemsnitlige opdelte celler CFSEDim/5.000 cfseBright | |
| Nil 1 | 5.004 | 11 | 11 | 12,3 | |
| Nil 2 | 4.995 | 14 | 14 | ||
| Nil 3 | 5.006 | 12 | 12 | ||
| Prøve | Ikke-opdelte celler CD4+cfseBright | Opdelte celler CD4+cfseDim | Antal opdelte celler CFSEDim/5000 cfseBright | CDI antal opdelte celler (stivkrampe) gennemsnitlige opdelte celler (nul) | Mean CDI |
| Stivkrampe 1 | 4.930 | 3.258 | 3.304,3 | 268 | 263,7 |
| Stivkrampe 2 | 4.928 | 3.205 | 3.251,8 | 263,7 | |
| Stivkrampe 3 | 4.910 | 3.142 | 3.199,6 | 259,5 |
Tabel 2: antigener, der bruges til at simulere CD4+- proliferation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CFSE-baseret spredning er en enkel og robust metode til påvisning og optælling af antigen-specifikke humane CD4+ T-celler. Det er tidligere blevet påvist, at anvendelse af den optimale koncentration af CFSE er afgørende for optimale resultater4. For meget CFSE ophæver spredningen, hvorimod alt for lidt ikke giver mulighed for at skelne mellem opdelte og uddelte celler. I modsætning hertil anvendes relativt høje koncentrationer (5,0 μM) af CFSE til mærkning af renset murine T-celler3. På grund af variabiliteten mellem batcher anbefales det, at hvert parti titreres for at bestemme den optimale koncentration. Vi bruger vores nuværende batch på en meget lavere koncentration (10 nM) end i den oprindelige publikation (200 nM)4.
Et andet vigtigt aspekt af denne metode er optimering af antigen dosis. Det er blevet veletableret, at T-celler, der dyrkes med mindre antigen, kan være mere følsomme og udviser forbedret funktion. Dette blev oprindeligt demonstreret i forbindelse med HIV peptider15. Mængden af stivkrampe tetanustoksoid, der anvendes i denne protokol er også blevet optimeret tidligere4 at fremkalde meget følsomme og proliferativ CD4+ T- celler. Det er interessant, at det tidligere har vist sig, at overskydende antigen reducerer antigen-specifik spredning15. For at detektere og optælle sjældne T-cellepopulationer i perifert blod er det derfor yderst vigtigt at optimere både antigen-og CFSE-koncentrationen.
Da vi offentliggjorde den første Human Dye fortynding-baseret assay4, mange lignende farvestoffer er blevet udviklet. Vi konstaterede, at CD4+ T-celle proliferation blev påvist mindre effektivt, når PKH-26, et lipofile farvestof, blev anvendt sammenlignet med cfse (ikke offentliggjort). Vi har ikke systematisk testet andre farvestoffer på markedet, så der er ingen kommentarer til deres relative styrker. Protokollen om kvantificering af T-celle spredning finder dog ligeledes anvendelse på alle sprednings analyser af farvestof fortynding.
Udtrykker spredning som en celle division Index (CDI) inkorporerer baggrunden spredning til beregning af omfanget af svarene. I vores hænder er baggrunden normalt lav (f. eks. < 15 hændelser/5000 CD4+ cfseBright). Baggrund spredning varierer mellem individer og eksperimenter. Ved hjælp af et forhold (i dette tilfælde, CDI) til at udtrykke styrken af spredning er noget effektivt til at reducere dens indvirkning på resultaterne. Baggrunds reaktioner på proteiner i medierne kan være problematiske. Det anbefales at bruge vævskultur medier, der indeholder humant serum, ikke bovin serum, da kvæg proteiner kan stimulere en svag baggrunds respons, der mindsker følsomheden af analysen. En høj baggrund spredning er blevet fundet i mennesker, der har en mild infektion, formentlig på grund af spredning, der er primet in vivo som reaktion på infektion. I sådanne tilfælde skal analysen gentages, når donoren har ryddet infektionen.
Den CFSE-baserede sprednings analyse kan modificeres til effektivt at klone humane antigen-specifikke CD4+ T-celler direkte fra PBMCs12. For eksempel er denne fremgangsmåde blevet brugt til at klone CD4+ T- celler specifikt for insulin12. For nylig har kloning og funktionelle analyser af proinsulin C-peptid-specifikke CD4+ T-celler givet bemærkelsesværdigt indblik i patogenesen af T1D, især hos patienter med nylig debut T1D13.
Som konklusion er den CFSE-baserede sprednings analyse både følsom og robust. Det er hurtigt og teknisk enkelt og kan udføres ved hjælp af frisk eller kryopræserverede PBMC. Evnen til at indarbejde CFSE i flerfarvet FACS analyse giver en kvantitativ måling af den immunophenotype af prolifererende T-celler fra PBMC indeholder mange celletyper, og denne grad af detaljer er ikke muligt med assays udnytte DNA inkorporering f. eks. [3H]-thymidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af: juvenil diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Det nationale sundheds-og medicinsk Forskningsråd (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), operationel infrastruktur støtte program for den victorianske regering (S. M., A. D., E. T., M. S.), og NHMRC Postgraduate Scholarship APP1094337 og JDRF PhD top-up Scholarship (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
