Summary
É apresentado aqui um protocolo para medir proliferating pilhas de T CD4+ em resposta às proteínas antigénicas ou aos peptídeos usando a diluição da tintura. Este ensaio é particular sensível às pilhas de T antígeno-específicas raras e pode ser modificada para facilitar a clonagem de pilhas antígeno-específicas.
Abstract
Descrito é um método simples, in vitro, baseado na diluição da tintura para medir a proliferação antígeno-específica da pilha de T CD4+ em pilhas mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). O desenvolvimento de tinturas estáveis, não-tóxicas, fluorescentes tais como o éster do grufo do usando (CFSE) permite que as pilhas de T raras, antígeno-específicas sejam distinguidas dos transeunte pela diminuição na mancha fluorescente, como detectado pelo fluxo cytometry. Este método tem as seguintes vantagens sobre abordagens alternativas: (i) é muito sensível a células T de baixa frequência, (II) nenhum conhecimento do antígeno ou epítopo é necessária, (III) o fenótipo das células que respondem pode ser analisado, e (IV) viável, respondendo células podem ser classificadas e usadas para análise posterior, como a clonagem de células T.
Introduction
A capacidade de detectar e estudar células T antígeno-específicas é importante em estudos de imunidade mediada por células. No entanto, isso é particularmente desafiador para as respostas de células T CD4+ específicas do autoantígeno, que são muito fracas e difíceis de detectar. Um método comum usado para a deteção da proliferação antígeno-específica do linfócito é [3H]-thymidine, que é um nucleotide radiolabeled incorporado no ADN de pilhas proliferating. Embora o ensaio de [3h]-thymidine possa detectar a síntese do ADN, este método é uma medida indireta da divisão da pilha, porque a síntese do ADN pode iniciar independentemente da mitose (isto é, durante a duplicação do gene e o apoptose1). Esta edição é agravada pelo fato de que a proliferação antígeno-específica das pilhas pode conduzir ao apoptose considerável2, conduzindo ao overestimato potencial da proliferação antígeno-específica. Além disso, o método de [3H]-timidina não fornece informações fenotípicas para linfócitos proliferantes, como a proliferação de linhagem CD4+ ou CD8+ em PBMCs estimulados com peptídeos antigênicos.
Em 2003, publicamos o primeiro ensaio de diluição de corante utilizando o CFSE, denominado ensaio de proliferação baseado em CFSE3,4. O CFSE é um corante fluorescente que se liga de forma estável a proteínas intracelulares, formando uma ligação covalente aos resíduos de lisina intracelular. Desde que as proteínas CFSE-etiquetadas são divididas ingualmente entre as pilhas3da filha, as pilhas que dividiram podem ser distinguidas das pilhas undivididas pelo fluxo cytometry, que igualmente permite o fenotipagem quantitativo de populações do linfócito. Na verdade, o número de divisões que uma célula sofreu a partir do momento da coloração CFSE pode ser medido em algum grau5. Mais recentemente, muitas tinturas similares tais como a tintura violeta da proliferação de CellTrace (VPD) e a tintura de CytoTrack foram desenvolvidas, que trabalham em uma maneira similar6. Este protocolo centra-se no CFSE, mas os princípios aplicam-se ingualmente a outros corantes relacionados.
A coloração do tetrâmero de peptide-MHC é um método amplamente utilizado para detectar e clonar pilhas CD8+ T antígeno-específicas. Este é um método bem estabelecido7,8,9,10; Entretanto, a clonagem tetrâmero-baseada exige o conhecimento existente da limitação de epítopo mapeado/MHC e cada epítopo exige seu próprio tetrâmero11, que limita o espaço da descoberta e da clonagem de pilhas de T epítopo mapeado-específicas novas. A proliferação baseada em CFSE pode ser usada com peptídeos, proteínas ou lisados celulares. O protocolo aqui descrito é simples e robusto, e as células T CD4+ de resposta podem ser classificadas para uso em ensaios de caracterização funcional e bioquímica a jusante12,13.
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Protocol
Todos os sujeitos deram consentimento informado antes da coleta de sangue periférico. A aprovação ética para experimentos usando PBMC foi dada por St. Vincent ' s hosptial (HREC-A 135/08, e HREC-A 161/15).
1. preparação do reagente
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Meios humanos da pilha de T
- Prepare a mídia RP-5 para cultivar PBMC, que consiste em RPMI 1640, 1x aminoácidos não essenciais, dipeptídeo L-alanyl-L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (0,1 mg/mL) e 5% de soro humano agrupado (PHS).
-
Soluções de ações CFSE
- Prepare um estoque mestre dissolvendo 25 mgs de CFSE em ~ 9 mL de DMSO para conseguir uma solução de estoque final com uma concentração de 5 mM.
- Prepare um estoque de trabalho diluindo o estoque mestre em PBS para alcançar uma concentração de trabalho de 10 μM.
2. preparação de PBMCs humanos de sangue total
- Existem geralmente entre 0,5 – 1,5 x 106 PBMCs/ml de sangue periférico humano. Portanto, a quantidade de sangue necessária depende do número desejado de PBMCs. diluir o sangue periférico humano com PBS, pelo menos, 1:2. Separe os PBMCs adicionando 15 mL de meio de gradiente de densidade a um tubo de 50 mL e, em seguida, sobreponha 35 mL de sangue total diluído.
- Centrifugador a 850 x g durante 15 min sem desaceleração à temperatura ambiente (RT). Isso resultará em três camadas claras: a camada inferior que contém o pellet de células vermelhas do sangue, camada média de meio de gradiente de densidade com células brancas do sangue que revestem sua interface superior e camada de plasma superior14.
- Remova aproximadamente 20 mL da camada de plasma superior. Colete a camada de glóbulos brancos, sendo cuidadoso para evitar o pellet de glóbulos vermelhos. Lave 3x com PBS e contagem de células viáveis usando Tripan exclusão azul em um Hemocytometer. Diluir para 1 x 106 PBMCs/ml em PBS.
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Células não-CFSE-manchadas
- Essas células são usadas como controles de compensação para citometria de fluxo, compreendendo células não manchadas e CD4+ de coloração única. Adicionar 300 μL de cada amostra de controlo PBMC suspensão a um tubo de 10 mL, superior com PBS, e centrifugar a 550 x g durante 5 min em RT.
- Ressuscite 1 x 106 células/ml na mídia RP-5. Incubar estas pilhas sem rótulo por 7 dias em uma incubadora de 37 ° c/5% co2 com as pilhas CFSE-etiquetadas (etapa 2.6.1).
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Células coradas por CFSE
- Transfira as células da etapa 2,3 para um tubo de 50 mL. Adicionar 1,0 μL de solução de trabalho CFSE (10 μM) por 1 mL de suspensão celular ao lado do tubo. Misture rapidamente invertendo o tubo várias vezes. A concentração final de CFSE é de 10 nM.
- Incubar por 5 min em uma incubadora de 37 ° c/5% CO2 . Para parar a coloração, adicionar 5 mL de RP-5 mídia, pellet as células por centrifugação por 5 min em 550 x g. Ressuscite o PBMCs em 1 x 106/ml na mídia RP-5.
- Adicionar 1,0 mL de suspensão celular a um tubo de 10 mL. Use um tubo para cada antígeno a ser testado.
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Estimulação antigênica de PBMCs humanos e cultura celular
- Cultura de CFSE humano-rotulado PBMCs com antígenos em RP-5 mídia por 7 dias em um 37 ° c/5% CO2 incubadora. Cultura 1 x 105 células/poço (100 μL) em uma placa de poço 96 com 100 μl/poço de meios RP-5 contendo antígeno diluído.
Nota: os antígenos utilizados, incluindo as concentrações de trabalho, estão resumidos na tabela 1.
- Cultura de CFSE humano-rotulado PBMCs com antígenos em RP-5 mídia por 7 dias em um 37 ° c/5% CO2 incubadora. Cultura 1 x 105 células/poço (100 μL) em uma placa de poço 96 com 100 μl/poço de meios RP-5 contendo antígeno diluído.
3. anti-CD4 coloração para FACS análise
- Pipetam 200 μL das células cultivadas em tubos FACS, células de lavagem 1X em 1,0 mL de PBS contendo 0,1% de FCS e centrifugador por 5 min a 550 x g.
- Mancha com anti-humano CD4 Alexa fluor 647 (0,25 mg/mL) em 100 μL de PBS/0,1% FCS. Mantenha de lado uma amostra de células rotuladas por CFSE, não manchada com outros fluoróforos, para usar para definir a compensação de CFSE FACS. Incubar as células a 4 ° c protegidas da luz durante 20 min.
- Lave as células adicionando 1 mL de PBS/0,1% FCS, centrifugue a 550 x g durante 5 min em RT e ressuscitem em 100 ΜL de PBS/0,1% FCS. Imediatamente antes da análise de FACS, adicione 1 μL do iodeto do propidium (PI, 0,1 mg/mL) a todos os tubos para permitir que as pilhas inoperantes sejam excluídas pelo fluxo cytometry.
4. configuração Citométrica de fluxo e estratégia de gating
Nota: A Figura 1 mostra a configuração do FACS, incluindo controles de remuneração e estratégia de gating.
- Porta o scatter dianteiro (FSC) vs. dispersão lateral (SSC) (Figura 1a) população para incluir todos os linfócitos.
- Porta a população de FSC vs. PI (Figura 1b) em células PI negativas para excluir células apoptóticas.
- Use células não manchadas para definir uma linha de base de tensão para células não-fluorescentes. Ajuste as tensões para CD4-A647 e CFSE de modo que o sinal da fluorescência esteja abaixo de 1.000 para cada um (Figura 1C). Use os controles de cor única CFSE (Figura 1D) e CD4-A647 (Figura 1e) para confirmar sinais fluorescentes positivos (~ 10.000) para cada cor, usando as tensões ajustadas com células não manchadas.
- CFSE e PI têm alguma sobreposição espectral; ajuste a compensação para subtrair a fluoresence do PI da fluoresence de CFSE até que a amostra do CFSE-somente não rende um sinal no canal PI.
Nota: Estas comportas foram aplicadas a todas as amostras analisadas neste documento.
5. cálculo do índice de divisão celular para enumerar a proliferação de células T CD4+ específica do antígeno
Nota: O índice de divisão celular (CDI) refere-se ao número de células divididas (CD4+/CFSEdim) por 5.000 células não divididas (CD4+/CFSEBright). Quando o número de células CD4+ não divididas não é exatamente 5.000, o número de células divididas é corrigido para expressar o número de células divididas por 5.000 células não divididas. Por exemplo, usando a proliferação específica do toxóide tetânico (Figura 2D), havia 4.930 células não divididas (CFSEbright) e 3.268 células divididas (CFSEDim); Portanto, o número corrigido de células divididas é (5000/4930) x 3.268 = 3304,3.
- Calcule o CDI (tabela 1) dividindo o número de células divididas/5000 células não divididas do grupo estimulado pelo antígeno pelo número médio de células divididas (por 5.000 células não divididas) das células cultivadas sem antígeno (tabela 2).
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Representative Results
Estimulação in vitro de PBMCs humanos com proteína toxóide do tétano: PBMCs foram corados com CFSE e estimulados por 7 dias na presença de toxóide tetânico. Quase todos os doadores mostraram uma resposta forte da pilha de T ao toxóide do tétano porque tinham sido vacinados, que faz o toxóide do tétano um antígeno positivo útil do controle. A Figura 2 demonstra, em triplicado, que a proliferação CFSE de células T CD4+ de PBMCs não estimulados foi mínima (~ 12 células do CFSEDim ; Figura 2a , B, C), quando havia uma proliferação marcada de pilhas de T de CD4+ em resposta ao toxóide do tétano (> 3000 pilhas deDim de CFSE; Figura 2D , E, F).
Estimulação in vitro de PBMCs humanos com peptídeos antigênicos: PBMCs foram corados com CFSE e estimulados por 7 dias na presença de proinsulina C-peptídeo humano. A Figura 3 demonstra a detecção de células T CD4+ específicas de proinsulina C-peptídeo no sangue periférico de um indivíduo com diabetes tipo 1. A proliferação não foi observada no PBMC do doador saudável (dados não mostrados). Na Figura 4, os PBMCs estimulados com A proteína da matriz do vírus influenza A (H1N1 PR8) demonstraram proliferação; Entretanto, a resposta tétano-específica para este doador era relativamente fraca, e as respostas são geralmente variáveis entre doadores.
Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que o ensaio pode ser realizado utilizando proteínas de comprimento total e peptídeos sintéticos curtos.
Figura 1: controles de remuneração e estratégia de gating para a proliferação baseada em CFSE de células T CD4+ . PBMCs não estimulados após 7 dias de cultura celular in vitro. Os linfócitos (A) foram corados com iodeto do propidium, e as pilhas iodeto-negativas do propidium foram bloqueadas para excluir pilhas inoperantes (B). Os controles da compensação de FACS incluíram pilhas não manchadas (C), pilhas manchadas com o CFSE sozinho (D), e as pilhas manchadas com o CD4 sozinho (e). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: proliferação de células T CD4+ específicas do tétano, coradas por CFSE. Os PBMCs foram corados por CFSE e cultivados por 7 dias na presença de 145 ng/ml (166 LfU/ml) de toxóide tetânico. As células foram coradas com CD4. A diluição do CFSE é mostrada sem antígeno (a-C) e em resposta à proteína do toxóide do tétano (D-F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: proliferação de células T CD4+ humanas coradas por CFSE em resposta a proinsulina C-peptídeo. Os PBMCs corados por CFSE foram cultivados por 7 dias na presença de 10 μm de proinsulina C-peptídeo. As células foram coradas com CD4. A diluição do CFSE é mostrada usando PBMC de um doador com diabetes tipo 1. A diluição do CFSE em PBMCs não estimulados (A), proteína toxóide tetânica estimulada (B) e proinsulina c-peptídeo humano estimulou PBMCs (c). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: proliferação de células T CD4 + humanas coradas por CFSE em resposta à proteína de matriz 1 do vírus influenza a (H1N1 PR8). Os PBMCs foram corados por CFSE e cultivados por 7 dias na presença de 0, 8 μg/mL de proteína de matriz de vírus influenza A 1. As células foram coradas com CD4. A diluição do CFSE é mostrada para células não estimuladas (A), células estimuladas por toxóides do tétano (B) e células de proteínas de matriz de vírus influenza A (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Antígeno | Concentração de trabalho |
| Proteína toxóide tetânica | 145 ng/mL |
| Influenza A H1N1 (PR8) matriz de proteínas 1 | 0,08 – 10 μg/mL |
| Proinsulina C-peptídeo PI33-63 | 10 nanômetro |
Tabela 1: enumeração da proliferação CD4+ específica do tétano. Os cálculos do CDI usando 5.000 registraram eventos citométricos de fluxo de PBMC humano não estimulados e Tetanus-estimulados.
| Amostra | Células não divididas CD4+CFSEBright | Células divididas CD4+CFSEDim | Número de células divididas CFSEDim/5.000 CFSEbrilhante | Média de células divididas CFSEDim/5.000 CFSEbrilhante | |
| Nil 1 | 5.004 | 11 | 11 | 12,3 | |
| Nil 2 | 4.995 | 14 | 14 | ||
| Nil 3 | 5.006 | 12 | 12 | ||
| Amostra | Células não divididas CD4+CFSEBright | Células divididas CD4+CFSEDim | Número de células divididas CFSEDim/5000 CFSEbrilhante | CDI número de células divididas (tétano) médias células divididas (Nil) | CDI médio |
| Tétano 1 | 4.930 | 3.258 | 3304,3 | 268 | 263,7 |
| Tétano 2 | 4.928 | 3.205 | 3251,8 | 263,7 | |
| Tétano 3 | 4.910 | 3.142 | 3199,6 | 259,5 |
Tabela 2: antígenos utilizados para simular a proliferação de CD4+ .
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Discussion
A proliferação CFSE-baseada é um método simples e robusto para detectar e enumerar pilhas humanas antígeno-específicas de CD4+ T. Tem sido demonstrado previamente que a utilização da concentração óptima de CFSE é essencial para resultados óptimos4. Demasiada proliferação dos AB roga de CFSE, visto que demasiado pouco não permite que as pilhas divididas e undivide sejam distinguidas. Por outro lado, concentrações relativamente elevadas (5,0 μM) de CFSE são usadas para rotular células T murinas purificadas3. Devido à variabilidade entre lotes, recomenda-se que cada lote seja titulado para determinar a concentração óptima. Nós usamos nosso lote atual em uma concentração muito mais baixa (10 nanômetro) do que na publicação original (200 nanômetro)4.
Outro aspecto importante deste método é a otimização da dose de antígeno. Tem sido bem estabelecido que as células T cultivadas com menos antígeno pode ser mais sensível e exibem função reforçada. Isso foi originalmente demonstrado no contexto dos peptídeos do HIV15. A quantidade de toxóide do tétano usada neste protocolo foi aperfeiçoada igualmente previamente4 para eliciar pilhas altamente sensíveis e proliferative de T CD4+ . Curiosamente, tem sido demonstrado anteriormente que o excesso de antígeno reduz a proliferação antígeno-específica15. Conseqüentemente, para detectar e enumerar populações raras da pilha de T no sangue periférico, otimizando a concentração do antígeno e do CFSE é da importância máxima.
Desde que nós publicamos o primeiro ensaio diluição-baseado humano da tintura4, muitas tinturas similares foram desenvolvidas. Nós encontramos que a proliferação da pilha de CD4+ T foi detectada menos eficazmente quando PKH-26, um corante lipofílico, foi usado comparado ao CFSE (Unpublished). Nós não testamos sistematicamente outros corantes no mercado, então não há nenhum comentário sobre suas forças relativas. No entanto, o protocolo para quantificar a proliferação de células T é igualmente aplicável a todos os ensaios de proliferação de diluição de corante.
Expressar a proliferação como índice de divisão celular (CDI) incorpora a proliferação de fundo no cálculo da magnitude das respostas. Em nossas mãos, o fundo é geralmente baixo (por exemplo, < 15 eventos/5000 CD4+ CFSEBright). A proliferação de antecedentes varia entre indivíduos e experimentos. Usar uma relação (neste caso, o CDI) para expressar a força da proliferação é um tanto eficaz em reduzir seu impacto nos resultados. As respostas de fundo às proteínas na mídia podem ser problemáticas. Recomenda-se o uso de meios de cultura de tecidos que contenham soro humano, não soro bovino, como proteínas bovina podem estimular uma fraca resposta de fundo que diminui a sensibilidade do ensaio. Uma proliferação elevada do fundo foi encontrada nas pessoas que têm uma infecção suave, presumivelmente devido à proliferação que é aprontado in vivo em resposta à infecção. Em tais casos, o ensaio deve ser repetido uma vez que o doador limpou a infecção.
O ensaio de proliferação baseado em CFSE pode ser modificado para clonar eficientemente células T CD4+ específicas do antígeno humano diretamente do PBMCs12. Por exemplo, essa abordagem foi usada para clonar células T CD4+ específicas para insulina12. Mais recentemente, a clonagem e as análises funcionais de células T CD4+ específicas de proinsulina C-peptídeo forneceram uma visão notável da patogênese da T1D, particularmente em pacientes com início recente T1D13.
Em conclusão, o ensaio de proliferação baseado em CFSE é sensível e robusto. É rápido e tecnicamente simples e pode ser realizado usando PBMC fresco ou criopreservado. A habilidade de incorporar o CFSE na análise multicolor de FACS fornece uma medida quantitativa do immunophenotype de proliferating pilhas de T de PBMC que contem muitos tipos da pilha, e este grau de detalhe não é possível com os ensaios que utilizam a incorporação do ADN como [3H]-thymidine.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por: o juvenil diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). O Conselho Nacional de saúde e pesquisa médica (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Austrália Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), programa de apoio à infra-estrutura operacional do governo vitoriano (S. M., A. D., E. T., M. S.), e NHMRC Bolsista de pós-graduação APP1094337 e JDRF PhD top-up Scholarship (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
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