Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Quantification de la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

doi: 10.3791/59545 Published: June 4, 2019

Summary

Présenté ici est un protocole pour mesurer la prolifération des cellules CD4T en réponse à des protéines antigéniques ou des peptides en utilisant la dilution des colorants. Cet analyse est particulièrement sensible aux rares lymphocytes T spécifiques à l'antigène et peut être modifié pour faciliter le clonage des cellules spécifiques à l'antigène.

Abstract

Décrit est une méthode simple, in vitro, colorant basée sur la dilution pour mesurer la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l'antigène dans les cellules mononucléaires périphériques humaines (PBMC). Le développement de colorants fluorescents stables, non toxiques, tels que carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) permet de distinguer les lymphocytes T rares et spécifiques à l'antigène des passants par diminution de la coloration fluorescente, telle qu'elle est détectée par la cytométrie du débit. Cette méthode présente les avantages suivants par rapport aux approches alternatives : (i) elle est très sensible aux lymphocytes T à basse fréquence, (ii) aucune connaissance de l'antigène ou de l'épitopie n'est requise, (iii) le phénotype des cellules répondantes peut être analysé, et (iv) viable, répondant les cellules peuvent être triées et utilisées pour une analyse plus approfondie, comme le clonage des lymphocytes T.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La capacité de détecter et d'étudier les lymphocytes T spécifiques à l'antigène est importante dans les études de l'immunité à médiation cellulaire. Cependant, cela est particulièrement difficile pour les réponses CD4et Lymphocellulaires spécifiques à l'autoantigène, qui sont très faibles et difficiles à détecter. Une méthode courante utilisée pour la détection de la prolifération des lymphocytes spécifiques à l'antigène est [3H]-thymidine, qui est un nucléotide radio-étiqueté incorporé dans l'ADN des cellules proliférantes. Bien que l'analyse [3H]-thymidine puisse détecter la synthèse de l'ADN, cette méthode est une mesure indirecte de la division cellulaire, car la synthèse de l'ADN peut initier indépendamment de la mitose (c.-à-d. pendant la duplication génétique et l'apoptose1). Cette question est aggravée par le fait que la prolifération des cellules spécifique à l'antigène peut entraîner une apoptose considérable2, conduisant à une surestimation potentielle de la prolifération spécifique à l'antigène. En outre, la méthode [3H]-thymidine ne fournit pas d'informations phénotypiques pour les lymphocytes proliférants, tels que la prolifération des lignées CD4 ou CD8 dans les PBMC stimulées par des peptides antigéniques.

En 2003, nous avons publié le premier essais de dilution de colorant utilisant CFSE, appelé l'assay de prolifération basé sur CFSE3,4. CFSE est un colorant fluorescent qui se lie de façon stable aux protéines intracellulaires en formant un lien covalent avec les résidus intracellulaires de lysine. Puisque les protéines labellées CFSE sont divisées également entre les cellules filles3, les cellules qui se sont divisées peuvent être distinguées des cellules indivises par cytométrie de flux, qui permet également le phénotypage quantitatif des populations de lymphocytes. En effet, le nombre de divisions qu'une cellule a subies depuis le moment de la coloration DE la SCEPeut peut être mesuré à un certain degré5. Plus récemment, de nombreux colorants similaires tels que CellTrace Violet proliferation dye (VPD) et CytoTrack colorant ont été développés, qui fonctionnent d'une manière similaire6. Ce protocole met l'accent sur l'ESFC, mais les principes s'appliquent également à d'autres colorants connexes.

La coloration des tétramères Peptide-MHC est une méthode largement utilisée pour détecter et clonage des cellules CD8et T spécifiques à l'antigène. Il s'agit d'une méthode bien établie7,8,9,10; cependant, le clonage à base de tétramères exige une connaissance existante de la restriction de l'épitope/MHC et chaque épitome nécessite son propre tétramer11, ce qui limite la portée de la découverte et du clonage de nouvelles cellules T spécifiques à l'épitopène. La prolifération à base de CFSE peut être utilisée avec des peptides, des protéines ou des lysates cellulaires. Le protocole décrit ci-dessus est à la fois simple et robuste, et les cellules CD4et T qui répondent peuvent être triées pour être utilisées dans les tests de caractérisation fonctionnelle et biochimique en aval12,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tous les sujets ont donné le consentement informé avant la collecte du sang périphérique. L'approbation éthique des expériences utilisant PBMC a été donnée par St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08, et HREC-A 161/15).

1. Préparation de réactif

  1. Médias de cellule T humains
    1. Préparer rp-5 médias pour la culture PBMC, qui se compose de RPMI 1640, 1x acides aminés non essentiels, L-alanyl-L-glutamine dipeptide (2 mM), pénicilline (100 U/mL)/streptomycine (0,1 mg/mL), et 5% de sérum humain mis en commun (PHS).
  2. Solutions d'actions CFSE
    1. Préparer un stock maître en dissolvant 25 mg de CFSE dans 9 ml de DMSO pour obtenir une solution de stock finale avec une concentration de 5 mM.
    2. Préparer un stock de travail en diluant le stock principal en PBS pour atteindre une concentration de travail de 10 M.

2. Préparation des PBMC humains à partir de Sang entier

  1. Il y a généralement entre 0.5-1.5 x 106 PBMCs/mL de sang périphérique humain. Par conséquent, la quantité de sang requise dépend du nombre désiré de PBMCs. Diluer le sang périphérique humain avec PBS au moins 1:2. Séparer les PBMC en ajoutant 15 ml de gradient de densité moyen à un tube de 50 ml, puis recouvrir 35 ml de sang entier dilué.
  2. Centrifugeuse à 850 x g pendant 15 min sans décélération à température ambiante (RT). Ceci se traduira par trois couches claires: la couche inférieure contenant la pastille de globulerouge rouge, couche moyenne de gradient de densité avec des globules blancs doublant son interface supérieure, et la couche plasmatique supérieure14.
  3. Enlever environ 20 ml de la couche plasmatique supérieure. Recueillir la couche de globules blancs, en prenant soin d'éviter la pastille de globules rouges. Laver 3x avec PBS et compter les cellules viables en utilisant l'exclusion trypan bleu sur un hémocytomètre. Diluer à 1 x 106 PBMCs/mL en PBS.
  4. Cellules non tachées de CFSE
    1. Ces cellules sont utilisées comme contrôles de compensation pour la cytométrie du débit, comprenant des cellules non tachées et CD4- single-stained. Ajouter 300 OL de chaque suspension PBMC de l'échantillon de contrôle à un tube de 10 ml, le dessus avec pbS, et la centrifugeuse à 550 x g pendant 5 min à RT.
    2. Resuspendre 1 x 106 cellules/mL dans le support RP-5. Incuber ces cellules non étiquetées pendant 7 jours dans un incubateur de CO2 de 37 oC/5 % avec les cellules étiquetées CFSE (étape 2.6.1).
  5. Cellules tachées de CFSE
    1. Transférer les cellules de l'étape 2.3 dans un tube de 50 ml. Ajouter 1,0 L de solution de bouillon de travail CFSE (10 M) par 1 ml de suspension cellulaire sur le côté du tube. Mélanger rapidement en inversant le tube plusieurs fois. La concentration finale de CFSE est de 10 nM.
    2. Incuber 5 min dans un incubateur co2 de 37 oC/5 %. Pour arrêter la coloration, ajouter 5 ml de support RP-5, granuler les cellules en centrifuge pendant 5 min à 550 x g. Resuspendre les PBMC à 1 x 106/mL dans les médias RP-5.
    3. Ajouter 1,0 ml de suspension cellulaire à un tube de 10 ml. Utilisez un tube pour chaque antigène à tester.
  6. Stimulation antigénique des PBMC humains et de la culture cellulaire
    1. Culture humaine étiquetée CFSE PBMc avec des antigènes dans les médias RP-5 pendant 7 jours dans un incubateur de CO2 de 37 oC/5 %. Culture 1 x 105 cellules/puits (100 l) dans une plaque de puits de 96 avec 100 l/puits de support RP-5 contenant de l'antigène dilué.
      REMARQUE : Les antigènes utilisés, y compris les concentrations de travail, sont résumés au tableau 1.

3. Staining anti-CD4 pour l'analyse FACS

  1. Pipette 200 l des cellules cultivées dans des tubes FACS, laver les cellules 1x dans 1,0 ml de PBS contenant 0,1 % de FCS, et centrifugeuse pendant 5 min à 550 x g.
  2. Tache avec anti-humain CD4 Alexa Fluor 647 (0.25 mg/mL) dans 100 'L de PBS/0.1% FCS. Gardez de côté un échantillon de cellules étiquetées CFSE, non tachées avec d'autres fluorophores, à utiliser pour fixer la compensation FACS CFSE. Incuber les cellules à 4 oC à l'abri de la lumière pendant 20 min.
  3. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS/0,1% FCS, centrifugeuse à 550 x g pendant 5 min à RT, et resuspendre dans 100 oL de PBS/0,1% FCS. Immédiatement avant l'analyse DU FACS, ajouter 1 l d'iodure de propidium (PI, 0,1 mg/mL) à tous les tubes pour permettre aux cellules mortes d'être exclues par la cytométrie du débit.

4. Configuration cytométrique de flux et stratégie de gating

REMARQUE: La figure 1 montre la configuration du FACS, y compris les contrôles de rémunération et la stratégie de gating.

  1. Portez la dispersion vers l'avant (FSC) par rapport à la dispersion latérale (SSC) (figure 1A) pour inclure tous les lymphocytes.
  2. Portez la population FSC vs PI (Figure 1B) sur les cellules négatives PI pour exclure les cellules apoptotiques.
  3. Utilisez des cellules non tachées pour définir une ligne de base de tension pour les cellules non fluorescentes. Définir les tensions pour le CD4-A647 et le CFSE de sorte que le signal de fluorescence soit inférieur à 1 000 pour chaque (figure1C). Utilisez les commandes de couleur unique CFSE (Figure 1D) et CD4-A647 (Figure 1E) pour confirmer les signaux fluorescents positifs (10 000 euros) pour chaque couleur, en utilisant les tensions fixées avec des cellules non tachées.
  4. CFSE et PI ont un certain chevauchement spectral; ajuster la compensation pour soustraire la fluorence de l'IP de la fluoresence de l'ESFC jusqu'à ce que l'échantillon de L'ESFC seulement ne donne pas de signal dans le canal DE l'IP.
    REMARQUE: Ces portes ont été appliquées à tous les échantillons analysés ci-contre.

5. Calcul de l'indice de division cellulaire pour énumérer le CD4 spécifique à l'antigèneet la prolifération des lymphocytes T

REMARQUE: L'indice de division cellulaire (CDI) se réfère au nombre de cellules divisées (CD4et/CFSEdim) pour 5 000 cellules non divisées (CD4etCFSElumineux). Lorsque le nombre de cellules CD4et cellules indivises n'est pas exactement de 5 000, le nombre de cellules divisées est corrigé pour exprimer le nombre de cellules divisées par 5 000 cellules non divisées. Par exemple, en utilisant la prolifération toxiale-spécifique du tétanos (figure2D),il y avait 4 930 cellules non divisées (CFSEbright) et 3 268 cellules divisées (CFSEdim); par conséquent, le nombre corrigé de cellules divisées est (5 000/4 930) x 3 268 et 3 304,3.

  1. Calculer l'ICD (tableau1) en divisant le nombre de cellules divisées/5 000 cellules non divisées du groupe stimulé par l'antigène par le nombre moyen de cellules divisées (pour 5 000 cellules non divisées) des cellules cultivées sans antigène (tableau 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Stimulation in vitro des PBMC humains avec la protéine toxicoïde de tétanos : LES PBMC ont été souillés avec CFSE et stimulés pendant 7 jours en présence du toxioïde de tétanos. Presque tous les donneurs ont montré une forte réponse des lymphocytes T au tétanos toxioïde parce qu'ils avaient été vaccinés, ce qui rend le tétanos toxicoïde un antigène de contrôle positif utile. La figure 2 démontre dans le triplicate que la prolifération de CFSE des cellules CD4et T des PBMC non stimulées était minimale (12 cellulesdim de CFSE ; Figure 2A ,B,C), alors qu'il y avait une prolifération marquée des cellules CD4t en réponse au tétanos toxioïde (3 000 cellulesdim CFSE; Figure 2D ,E,F).

Stimulation in vitro des PBMC humains avec des peptides antigéniques : les PBMC ont été souillés avec CFSE et stimulés pendant 7 jours en présence du Proinsulin humain C-peptide. La figure 3 démontre la détection de cellules CD4 cD4et T spécifiques à la proinsuline C-peptide dans le sang périphérique d'une personne atteinte de diabète de type 1. La prolifération n'a pas été observée dans le PBMC du donneur en bonne santé (données non montrées). Dans la figure 4, les PBMC stimulés par la protéine matrice du virus de l'influenza A (H1N1 PR8) ont démontré une prolifération; cependant, la réponse spécifique au tétanos pour ce donneur était relativement faible, et les réponses sont généralement variables entre les donneurs.

Pris ensemble, ces résultats démontrent que l'analyse peut être effectuée en utilisant des protéines pleine longueur et des peptides synthétiques courts.

Figure 1
Figure 1 : Contrôle de la rémunération et stratégie de gating pour la prolifération des cellules CD4et T basées sur la LSE. PBMCs non stimulés après 7 jours de culture cellulaire in vitro. Les lymphocytes (A) ont été tachés d'iodure de propidium, et les cellules propidium iodide-négatives ont été fermées pour exclure les cellules mortes (B). Les contrôles de compensation FACSont inclus les cellules non tachées ( C), les cellules tachées de CFSE seul (D), et les cellules tachées de CD4 seul (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Prolifération des cellules CD4 cD4et T spécifiques au tétanos souillés par le SSES. Les PBMC ont été tachés et cultivés pendant 7 jours en présence de 145 ng/mL (166 LfU/mL) de tétanos toxioïde. Les cellules ont été tachées avec CD4. La dilution de CFSE est montrée sans antigène (A-C) et en réponse à la protéine toxiade de tétanos (D-F). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Prolifération des cD4 humains tachés par l'ESFC en réponse au proinsulinEc-peptide. Les PBMC souillés de CFSE ont été cultivés pendant 7 jours en présence de 10 Proinsulin C-peptide de 10 M. Les cellules ont été tachées avec CD4. La dilution de CFSE est montrée utilisant PBMC d'un donneur avec le diabète de type 1. La dilution de CFSE dans les PBMC non stimulés (A), la protéine toxicoïde de tétanos stimulée (B), et le proinsulin humain C-peptide ont stimulé des PBMC (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Prolifération des lymphocytes T CD4MD humains atteints de CFSE en réponse au virus de l'influenza A (H1N1 PR8) protéine matrice 1. Les PBMC ont été tachés de CFSE et cultivés pendant 7 jours en présence de la protéine de matrice de virus de l'influenza A de 0,08 g/mL 1. Les cellules ont été tachées avec CD4. La dilution de CFSE est montrée pour les cellules non stimulées (A), les cellules stimulées par le tétanos toxicoïdes (B), et les cellules stimulées par la matrice de virus de l'influenza A (C).      Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

antigène Concentration de travail
Protéine toxiade du tétanos 145 ng/mL
Grippe A H1N1 (PR8) Protéine de matrice 1 0,08 à 10 g/mL
Proinsuline C-peptide PI33-63 10 nM

Tableau 1 : Recensement du CD4 spécifique au tétanos 4et prolifération. Calculs en CDI à l'aide de 5 000 événements de cytométrie de flux enregistrés à partir de PBMC humain non stimulé et stimulé par le tétanos.

échantillon Cellules indivises CD4etCFSElumineux Cellules divisées CD4etCFSEdim Nombre de cellules divisées CFSEdim/5,000 CFSElumineux Cellules moyennes divisées CFSEdim/5,000 CFSElumineux
Nil 1 5 004 11 Ans, états-unis ( 11 Ans, états-unis ( 12,3
Nil 2 4 995 14 (en) 14 (en)
Nil 3 5 006 12 Ans, états-unis 12 Ans, états-unis
échantillon Cellules indivises CD4etCFSElumineux Cellules divisées CD4etCFSEdim Nombre de cellules divisées CFSEdim/ 5000 CFSElumineux CDI Nombre de cellules divisées (Tétanos) Cellules moyennes divisées (Nil) IcDI moyen
Tétanos 1 4 930 3 258 3 304,3 268 Annonces 263,7
Tétanos 2 4 928 3 205 3 251,8 263,7
Tétanos 3 4 910 3 142 3 199,6 259,5

Tableau 2 : Antigènes utilisés pour simuler la proliférationdu CD4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La prolifération à base de CFSE est une méthode simple et robuste pour détecter et énumérer les cellules CD4et T humaines spécifiques à l'antigène. Il a déjà été démontré que l'utilisation de la concentration optimale de CFSE est essentielle pour des résultats optimaux4. Trop de CFSE abroge la prolifération, alors que trop peu ne permet pas de distinguer les cellules divisées et indivises. En revanche, des concentrations relativement élevées (5,0 M) de CFSE sont utilisées pour étiqueter les lymphocytes T murines purifiés3. En raison de la variabilité entre les lots, il est recommandé que chaque lot soit titré pour déterminer la concentration optimale. Nous utilisons notre lot actuel à une concentration beaucoup plus faible (10 nM) que dans la publication originale (200 nM)4.

Un autre aspect important de cette méthode est l'optimisation de la dose d'antigène. Il a été bien établi que les lymphocytes T cultivés avec moins d'antigène peuvent être plus sensibles et présenter une fonction améliorée. Cela a été démontré à l'origine dans le contexte des peptides VIH15. La quantité de tétanos toxioïde utilisée dans ce protocole a également été optimisée précédemment4 pour susciter des cellules CD4et T hautement sensibles et proliférantes. Fait intéressant, il a été démontré précédemment que l'excès d'antigène réduit la prolifération antigène spécifique15. Par conséquent, pour détecter et énumérer les populations rares de cellules T dans le sang périphérique, l'optimisation de la concentration d'antigène et de CFSE est de la plus haute importance.

Depuis que nous avons publié le premier assay basé sur la dilution de colorant humain4, beaucoup de colorants semblables ont été développés. Nous avons constaté que la prolifération des lymphocytes T CD4a été détectée moins efficacement lorsque PKH-26, un colorant lipophilique, a été utilisé par rapport à CFSE (non publié). Nous n'avons pas systématiquement testé d'autres colorants sur le marché, il n'y a donc aucun commentaire sur leurs forces relatives. Cependant, le protocole pour quantifier la prolifération des lymphocytes T s'applique également à tous les tests de prolifération de dilution de colorant.

L'expression de la prolifération en tant qu'indice de division cellulaire (ICD) intègre la prolifération de fond dans le calcul de l'ampleur des réponses. Dans nos mains, l'arrière-plan est généralement faible (par exemple, les événements de lt;15/5 000 CD4et CFSElumineux). La prolifération des antécédents varie d'un individu à l'autre et d'une expérience à l'autre. L'utilisation d'un ratio (dans ce cas, l'ICD) pour exprimer la force de la prolifération est quelque peu efficace pour réduire son impact sur les résultats. Les réponses de fond aux protéines dans les médias peuvent être problématiques. Il est recommandé d'utiliser des milieux de culture tissulaire qui contiennent du sérum humain, et non du sérum bovin, car les protéines bovines peuvent stimuler une faible réponse de fond qui diminue la sensibilité de l'analyse. Une prolifération de fond élevée a été trouvée dans les personnes qui ont une infection douce, probablement due à la prolifération qui est amorcée in vivo en réponse à l'infection. Dans de tels cas, l'analyse doit être répétée une fois que le donneur a éliminé l'infection.

L'analyse de prolifération basée sur la CFSE peut être modifiée pour cloner efficacement les cellules CD4 et T spécifiques à l'antigène humain directement à partir des PBMC12. Par exemple, cette approche a été utilisée pour cloner les cellules CD4et T spécifiques à l'insuline12. Plusrécemment, le clonage et les analyses fonctionnelles des cellules CD4et T spécifiques au proinsulin C-peptide ont fourni un aperçu remarquable de la pathogénie du DT1, en particulier chez les patients atteints de T1D13.

En conclusion, l'essais de prolifération fondé sur la FCSE est à la fois sensible et robuste. Il est rapide et techniquement simple et peut être effectué en utilisant PBMC frais ou cryoconservé. La capacité d'incorporer CFSE dans l'analyse FACS multicolore fournit une mesure quantitative de l'immunophénotype des cellules T proliférantes de PBMC contenant beaucoup de types de cellules, et ce degré de détail n'est pas possible avec des essais utilisant l'incorporation d'ADN tels que [3H]-thymidine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par : La Fondation de recherche sur le diabète juvénile [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Le National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), Operational Infrastructure Support Program of the Victorian Government (S. M., A. D., E. T., M. S.), et NHMRC Bourse d'études supérieures APP1094337 et Bourse de doctorat de la FRDJ (M. S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647 Biolegend 317422 RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ThermoFisher C1157
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 71-7167-00
Glutamax (1x) Gibco 35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 Sino Biological 40010-V07E
Non-essential amino acids (1x) Gibco 11140
Penicillin/Streptomycin (1x) Gibco 15070063
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Pooled human serum Australian Red Cross N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63 Purar Chemicals N/A Custom made synthetic peptide
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Tetanus Toxoid protein Statens Serum Intitut N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
  2. Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
  3. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
  4. Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 4-7 (2010).
  6. Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
  7. Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
  8. Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
  9. Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
  10. Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
  11. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  12. Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
  13. So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
  14. Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. 2-7 (2011).
  15. Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
Quantification de la prolifération des cellules CD4<sup>et</sup> T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).More

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter