Summary
Presentert her er en protokoll for å måle voksende CD4+ T-celler som svar på antigen proteiner eller peptider ved hjelp av fargestoff fortynning. Denne analysen er spesielt følsom for sjeldne antigen-spesifikke T-celler og kan endres for å lette kloning av antigen-spesifikke celler.
Abstract
Beskrevet er en enkel, in vitro, fargestoff fortynning-basert metode for å måle antigen-spesifikke CD4+ T celle spredning i humant perifert blod mononukleære celler (pbmc). Utviklingen av stabile, ikke-giftig, fluorescerende fargestoffer som carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) gjør det mulig for sjeldne, antigen-spesifikke T-celler som skal skilles fra tilskuere av reduksjon i fluorescerende flekker, som oppdages av flyt flowcytometri. Denne metoden har følgende fordeler fremfor alternative tilnærminger: (i) det er svært følsom for lavfrekvente T-celler, (II) ingen kunnskap om Antigen eller epitope er nødvendig, (III) fenotype av de reagerer cellene kan analyseres, og (IV) levedyktig, svare -celler kan sorteres og brukes til videre analyse, for eksempel T-celle kloning.
Introduction
Evnen til å oppdage og studere antigen-spesifikke T-celler er viktig i studier av celle-mediert immunitet. Dette er imidlertid spesielt utfordrende for autoantigen-spesifikke CD4+ T-Cell-svar, som er veldig svake og vanskelige å oppdage. En vanlig metode som brukes for påvisning av antigen-spesifikk spredning av lymfocytter er [3H]-tymidin, som er en radiolabeled nukleotid innlemmet i DNA av voksende celler. Selv om [3H]-tymidin analysen kan oppdage DNA-syntese, er denne metoden et indirekte mål på celledeling, fordi DNA-syntese kan initiere uavhengig av mitose (dvs. under gen duplisering og apoptose1). Dette problemet er forsterket av det faktum at antigen-spesifikk spredning av celler kan resultere i betydelig apoptose2, fører til potensielle overvurdering av antigen-spesifikk spredning. Videre, [3H]-tymidin metoden gir ikke fenotypiske informasjon for voksende lymfocytter, som CD4+ eller CD8+ Lineage spredning i pbmc stimulert med antigen peptider.
I 2003 publiserte vi den første fargestoff fortynning analysen bruker CFSE, kalt CFSE-baserte spredning analysen3,4. CFSE er et fluorescerende fargestoff som binder stabilt til intracellulære proteiner ved å danne en kovalente obligasjon til intracellulære lysin rester. Siden CFSE-merket proteiner er delt likt mellom datter celler3, celler som har delt kan skilles fra udelt celler ved flyt flowcytometri, som også gjør det mulig for den kvantitative bestemmelse av fenotype av lymfocytter populasjoner. Faktisk har antall divisjoner en celle gjennomgått fra tidspunktet for CFSE-farging kan måles til en viss grad5. Flere nylig, mange lignende fargestoffer som CellTrace Violet spredning Dye (VPD) og CytoTrack fargestoff har blitt utviklet, som fungerer på en lignende måte6. Denne protokollen fokuserer på CFSE, men prinsippene gjelder like til andre relaterte fargestoffer.
Peptid-MHC tetramer farging er en mye brukt metode for å oppdage og kloning antigen-spesifikke CD8+ T celler. Dette er en veletablert metode7,8,9,10; Imidlertid, tetramer-basert Klon behøver eksisterende kunnskap av det epitope/MHC begrensning og hver epitope behøver dens egen tetramer11, hvilke rammer omfanget av oppdagelsen og klon av romersk epitope-spesifikk T celler. Den CFSE-baserte spredningen kan brukes med peptider, proteiner eller celle lysater. Protokollen beskrevet her er både enkel og robust, og reagerer CD4+ T celler kan sorteres for bruk i nedstrøms funksjonelle og biokjemiske karakterisering analyser12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle ga informert samtykke før innsamling av perifert blod. Etisk godkjenning for eksperimenter med PBMC ble gitt av St. Vincent ' s Hosptial (HREC-A 135/08, og HREC-A 161/15).
1. forberedelse av reagens
-
Human T celle Media
- Forbered RP-5-medier for dyrking PBMC, som består av RPMI 1640, 1x ikke-essensielle aminosyrer, L-alanyl-L-glutamin dipeptidet (2 mM), penicillin (100 U/mL)/Streptomycin (0,1 mg/mL), og 5% samlet humant serum (PHS).
-
CFSE lager løsninger
- Forbered en Master Stock ved å oppløse 25 mg CFSE i ~ 9 mL DMSO å oppnå en endelig lagerløsning med en konsentrasjon på 5 mM.
- Forbered et arbeids lager ved å fortynne Master-aksjen i PBS for å oppnå en arbeids konsentrasjon på 10 μM.
2. utarbeidelse av Human Pbmc fra hele Blood
- Det er vanligvis mellom 0,5 – 1,5 x 106 Pbmc/ml av humant perifert blod. Derfor avhenger mengden av blod som kreves på ønsket antall Pbmc. fortynne humant perifert blod med PBS minst 1:2. Skill Pbmc ved å legge til 15 mL tetthet gradient medium til en 50 mL rør, deretter overlay 35 mL av fortynnet hele blod.
- Sentrifuger ved 850 x g i 15 min uten retardasjon ved romtemperatur (RT). Dette vil resultere i tre klare lag: det nederste laget som inneholder røde blodlegemer pellet, midterste laget av tetthet gradient medium med hvite blodlegemer fôr sin topp grensesnitt, og topp plasma lag14.
- Fjern ca. 20 mL av det øverste plasma laget. Samle det hvite blodlegemer lag, være forsiktig for å unngå den røde blodlegemer pellet. Vask 3x med PBS og telle levedyktige celler ved hjelp trypan blå eksklusjon på en hemocytometer. Fortynne til 1 x 106 Pbmc/ml i PBS.
-
Ikke-CFSE-fargede celler
- Disse cellene brukes som kompensasjon kontroller for Flow flowcytometri, bestående av unstained og CD4+ single-beiset celler. Tilsett 300 μL av hver kontroll prøve PBMC-suspensjon til en 10 mL tube, topp med PBS, og sentrifuger på 550 x g i 5 min ved RT.
- Resuspend 1 x 106 celler/ml i RP-5-medier. Ruge disse umerkede cellene i 7 dager i en 37 ° c/5% CO2 INKUBATOR med CFSE-merket celler (trinn 2.6.1).
-
CFSE-fargede celler
- Overfør cellene fra trinn 2,3 til et 50 mL rør. Tilsett 1,0 μL av CFSE arbeids lagerløsning (10 μM) per 1 mL celle oppheng på siden av slangen. Bland raskt ved invertere røret flere ganger. Den endelige konsentrasjonen av CFSE er 10 nM.
- Ruge i 5 min i en 37 ° c/5% CO2 inkubator. For å stoppe farging, tilsett 5 mL RP-5 Media, pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 550 x g. Resuspend den Pbmc på 1 x 106/ml i RP-5 Media.
- Tilsett 1,0 mL celle fjæring til et 10 mL rør. Bruk ett rør for hvert antigen som skal testes.
-
Antigen stimulering av menneskelig Pbmc og cellekultur
- Kultur Human CFSE-merket Pbmc med antigener i RP-5 Media for 7 dager i en 37 ° c/5% CO2 inkubator. Kultur 1 x 105 celler/brønn (100 μL) i en 96 brønn plate med 100 μL/BRØNN av RP-5 medier som inneholder fortynnet antigen.
Merk: antigener som brukes, inkludert arbeids konsentrasjoner, er oppsummert i tabell 1.
- Kultur Human CFSE-merket Pbmc med antigener i RP-5 Media for 7 dager i en 37 ° c/5% CO2 inkubator. Kultur 1 x 105 celler/brønn (100 μL) i en 96 brønn plate med 100 μL/BRØNN av RP-5 medier som inneholder fortynnet antigen.
3. anti-CD4 farging for FACS analyse
- Pipetter 200 μL av de dyrkede cellene i FACS-rør, vask celler 1x i 1,0 mL PBS inneholder 0,1% FCS, og sentrifuger i 5 min ved 550 x g.
- Stain med anti-menneskelige CD4 Alexa fluor 647 (0,25 mg/mL) i 100 μL av PBS/0.1% FCS. Hold til side et utvalg av CFSE-merkede celler, unstained med andre fluorophores, å bruke for å sette FACS CFSE kompensasjon. Ruge cellene ved 4 ° c beskyttet mot lys i 20 min.
- Vask cellene ved å legge til 1 mL PBS/0.1% FCS, sentrifuger på 550 x g i 5 min ved RT, og resuspend i 100 ΜL av PBS/0.1% FCS. Umiddelbart før FACS analyse, tilsett 1 μL av propidium iodide (PI, 0,1 mg/mL) til alle rør for å tillate at døde celler skal utelukkes ved flyt flowcytometri.
4. Flow analytiske konfigurasjon og gating strategi
Merk: Figur 1 viser FACS-konfigurasjonen, inkludert kompensasjons kontroller og gating strategi.
- Gate den Forward scatter (FSC) g. side scatter (SSC) (figur 1a) befolkning å inkludere alle lymfocytter.
- Gate FSC vs. PI (figur 1B) BEFOLKNING på pi negative celler for å utelukke apoptotisk celler.
- Bruk unstained celler til å sette en spenning Baseline for ikke-fluorescerende celler. Sett spenninger for CD4-A647 og CFSE slik at fluorescens signalet er under 1 000 for hver (figur 1C). Bruk én fargekontrollene CFSE (figur 1d) og CD4-A647 (figur 1e) for å bekrefte positive fluorescerende signaler (~ 10 000) for hver farge, ved hjelp av spenninger satt med unstained celler.
- CFSE og PI har noen Spectral overlapping; justere kompensasjonen til å trekke fra PI-fluoresence fra CFSE-fluoresence til CFSE-Only-prøven ikke gir et signal i PI-kanalen.
Merk: Disse portene ble brukt på alle prøvene analysert her.
5. beregning av Cell Division index å nummerere antigen-spesifikke CD4+ T celle spredning
Merk: Cell Division index (CDI) refererer til antall delte celler (CD4+/CFSEdim) per 5 000 udelt celler (CD4+/CFSEBright). Når antall udelt CD4+ celler er ikke akkurat 5 000, antall delte celler er korrigert for å uttrykke antall delte celler per 5 000 udelt celler. For eksempel bruker stivkrampe difteritoksoid-spesifikk spredning (figur 2D), var det 4 930 udelt celler (CFSEbright) og 3 268 delt celler (CFSEDim); Derfor er korrigert antall delte celler (5000/4930) x 3 268 = 3 304,3.
- Beregn CDI (tabell 1) ved å dele antall delte celler/5000 udelt celler fra antigen-stimulert gruppe av gjennomsnittlig antall delte celler (per 5 000 udelt celler) fra cellene kultivert uten antigen (tabell 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro stimulering av humant Pbmc med stivkrampe difteritoksoid protein: Pbmc ble farget med CFSE og stimulert i 7 dager i nærvær av stivkrampe difteritoksoid. Nesten alle givere viste en sterk T-celle respons på stivkrampe difteritoksoid fordi de hadde blitt vaksinert, noe som gjør stivkrampe difteritoksoid en nyttig positiv kontroll antigen. Figur 2 demonstrerer i tre eksemplarer, at CFSE SPREDNING av CD4+ T celler fra unstimulated pbmc var MINIMAL (~ 12 CFSEDim celler; Figur 2a , B, C), mens det var en markert SPREDNING av CD4+ T celler som svar på stivkrampe DIFTERITOKSOID (> 3000 CFSEDim celler; Figur 2D , E, F).
In vitro stimulering av humant Pbmc med antigen peptider: Pbmc ble farget med CFSE og stimulert i 7 dager i nærvær av menneskelig proinsulin C-peptid. Figur 3 demonstrerer påvisning av proinsulin C-peptid-spesifikke CD4+ T celler i perifert blod av en person med type 1 diabetes. Spredning ble ikke observert i den sunne donor ' s PBMC (data ikke vist). I Figur 4, pbmc stimulert med influensa A virus (H1N1 PR8) matrise protein demonstrert spredning; men den stivkrampe spesifikke responsen for denne giveren var relativt svak, og responsen er vanligvis variabel mellom giverne.
Til sammen viser disse resultatene at analysen kan utføres ved hjelp av full-lengde proteiner og korte syntetiske peptider.
Figur 1: kompensasjon kontroller og gating strategi for CFSE-basert spredning av CD4+ T celler. Unstimulated pbmc følgende 7 dager av in vitro cellekultur. Lymfocytter (A) ble farget med propidium iodide, og propidium iodide-negative celler var gated å utelukke døde celler (B). FACS kompensasjon kontroller inkludert unstained celler (C), celler BEISET med CFSE alene (D), og celler beiset med CD4 alene (E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: spredning av CFSE-beiset stivkrampe-spesifikke CD4+ T celler. Pbmc var CFSE-farget og kultivert for 7 dager i nærvær av 145 ng/ml (166 LfU/ml) stivkrampe difteritoksoid. Celler ble farget med CD4. CFSE fortynning vises uten antigen (A-C) og som respons på stivkrampe difteritoksoid protein (D-F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: spredning av CFSE menneskelige CD4+ T celler som svar på proinsulin C-peptid. CFSE-beiset pbmc ble kultivert for 7 dager i nærvær av 10 μM Proinsulin C-peptid. Celler ble farget med CD4. CFSE fortynning er vist ved hjelp av PBMC fra en giver med type 1 diabetes. CFSE fortynning i unstimulated Pbmc (A), stivkrampe difteritoksoid protein stimulert (B), og menneskelig proinsulin C-peptid stimulert pbmc (c). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: spredning av CFSE menneskelige CD4 + T celler som svar på influensa A virus (H1N1 PR8) matrise protein 1. Pbmc ble CFSE-farget og kultivert for 7 dager i nærvær av 0,08 μg/mL influensa A virus Matrix protein 1. Celler ble farget med CD4. CFSE fortynning er vist for unstimulated celler (A), stivkrampe difteritoksoid stimulert celler (B), og influensa A virus Matrix protein-stimulert celler (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antigen | Arbeids konsentrasjon |
| Stivkrampe difteritoksoid protein | 145 ng/mL |
| Influensa A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | 0.08 – 10 μg/mL |
| Proinsulin C-peptid PI33-63 | 10 nM på |
Tabell 1: opplisting av stivkrampe spesifikke CD4+ spredning. CDI beregninger bruker 5 000 innspilt flyt flowcytometri hendelser fra unstimulated og stivkrampe stimulert menneskelig PBMC.
| Eksempel | Udelt celler CD4+CFSEBright | Delte celler CD4+CFSEDim | Antall delte celler CFSEDim/5 000 CFSEBright | Mean delte celler CFSEDim/5 000 CFSEBright | |
| Null 1 | 5 004 | 11 | 11 | 12,3 | |
| Nil 2 | 4 995 | 14 | 14 | ||
| Nil 3 | 5 006 | 12 | 12 | ||
| Eksempel | Udelt celler CD4+CFSEBright | Delte celler CD4+CFSEDim | Antall delte celler CFSEDim/5000 CFSEBright | CDI antall delte celler (stivkrampe) bety delte celler (Nil) | Gjennomsnittlig CDI |
| Stivkrampe 1 | 4 930 | 3 258 | 3 304,3 | 268 | 263,7 |
| Stivkrampe 2 | 4 928 | 3 205 | 3 251,8 | 263,7 | |
| Stivkrampe 3 | 4 910 | 3 142 | 3 199,6 | 259,5 |
Tabell 2: antigener brukes til å simulere CD4+ spredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CFSE-basert spredning er en enkel og robust metode for å oppdage og opplisting antigen-spesifikke menneskelige CD4+ T celler. Det har tidligere blitt demonstrert at bruk av optimal konsentrasjon av CFSE er avgjørende for optimale resultater4. For mye CFSE opphever spredning, mens for lite tillater ikke for delt og udelt celler skal skilles. Relativt høye konsentrasjoner (5,0 μM) av CFSE brukes derimot til å merke renset murine T-celler3. På grunn av variasjon mellom partier, anbefales det at hvert parti skal titrert for å bestemme den optimale konsentrasjonen. Vi bruker vår nåværende batch på en mye lavere konsentrasjon (10 nM) enn i den opprinnelige publikasjonen (200 nM)4.
En annen viktig del av denne metoden er optimalisering av antigen dose. Det har vært godt etablert at T-celler kultivert med mindre antigen kan være mer følsom og utstillingen forbedret funksjon. Dette ble opprinnelig demonstrert i sammenheng med HIV-peptider15. Mengden av stivkrampe difteritoksoid som brukes i denne protokollen har også blitt optimalisert tidligere4 for å lokke fram svært følsomme og proliferativ CD4+ T celler. Interessant, har det vært vist tidligere at overflødig antigen reduserer antigen-spesifikk spredning15. Derfor, for å oppdage og nummerere sjeldne T celle populasjoner i perifert blod, optimalisere både antigen og CFSE konsentrasjon er av største betydning.
Siden vi publiserte den første menneskelige fargestoff fortynning-baserte analysen4, har mange lignende fargestoffer er utviklet. Vi fant at CD4+ T celle spredning ble oppdaget mindre effektivt når PKH-26, en lipofile fargestoff, ble brukt i forhold til CFSE (upublisert). Vi har ikke systematisk testet andre fargestoffer på markedet, så det er ingen kommentar på deres relative styrker. Men protokollen for kvantifisere T celle spredning er like gjeldende for alle fargestoff fortynning spredning analyser.
Å uttrykke spredning som en celle divisjons indeks (CDI) inkorporerer bakgrunns spredningen i beregningen av omfanget av svarene. I våre hender, er bakgrunnen vanligvis lav (f. eks < 15 hendelser/5000 CD4+ CFSEBright). Bakgrunn spredning varierer mellom individer og eksperimenter. Å bruke et forhold (i dette tilfellet CDI) til å uttrykke styrken på spredningen er noe effektivt for å redusere dens innvirkning på resultatene. Bakgrunns responsen på proteiner i Media kan være problematisk. Det anbefales å bruke vev kultur Media som inneholder humant serum, ikke storfe serum, som storfe proteiner kan stimulere en svak bakgrunn respons som reduserer følsomheten av analysen. En høy bakgrunn spredning er funnet hos personer som har en mild infeksjon, antagelig på grunn av spredning som er primet i vivo som svar på smitte. I slike tilfeller må analysen gjentas når giveren har ryddet infeksjonen.
Den CFSE-baserte spredning analysen kan endres for å effektivt klone menneskelig antigen-spesifikke CD4+ T celler direkte fra pbmc12. For eksempel har denne tilnærmingen blitt brukt til å klone CD4+ T celler spesifikke for insulin12. Flere nylig, kloning og funksjonelle analyser av proinsulin C-peptid-spesifikke CD4+ T celler har gitt bemerkelsesverdig INNSIKT i patogenesen av T1D, spesielt hos pasienter med siste utbruddet T1D13.
Avslutningsvis er den CFSE-baserte sprednings analysen både følsom og robust. Det er raskt og teknisk enkel og kan utføres ved hjelp av friske eller embryo PBMC. Evnen til å innlemme CFSE i flerfarget FACS analyse gir en kvantitativ mål på immunophenotype av voksende T-celler fra PBMC inneholder mange celletyper, og denne graden av detaljer er ikke mulig med analyser utnytte DNA innlemmelse som [3H]-tymidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av: den juvenile diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). The National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), operasjonell infrastruktur støtte program av den viktorianske regjeringen (S. M., A. D., E. T., M. S.), og NHMRC Postgraduate Scholarship APP1094337 og JDRF PhD Top-Up stipend (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
