Summary
Aquí se presenta un protocolo para medir las células CD4+ T proliferantes en respuesta a proteínas antigénicas o péptidos mediante dilución de tinte. Este ensayo es particularmente sensible a las células T específicas del antígeno poco frecuente y se puede modificar para facilitar la clonación de células específicas del antígeno.
Abstract
Descrito es un método simple, in vitro, basado en la dilución de tinte para medir la proliferación de células CD4+ T específicas de antígenos en células mononucleares de sangre periférica humana (PPC). El desarrollo de tintes fluorescentes estables, no tóxicos, como el éster de carboxifluoresceína succinimidyl (CFSE) permite distinguir las células T raras específicas del antígeno de los transeúntes por la disminución de la tinción fluorescente, detectada por la citometría de flujo. Este método tiene las siguientes ventajas sobre los enfoques alternativos: (i) es muy sensible a las células T de baja frecuencia, (ii) no se requiere conocimiento del antígeno o epítopo, (iii) se puede analizar el fenotipo de las células que responden, y (iv) ser viable, responder, respondiendo, respondiendo, respondiendo, respondiendo, respondiendo células se pueden ordenar y utilizar para análisis adicionales, como clonación de células T.
Introduction
La capacidad de detectar y estudiar células T específicas del antígeno es importante en estudios de inmunidad mediada por células. Sin embargo, hacerlo es particularmente difícil para las respuestas CD4+ Células T específicas de autoantígenos, que son muy débiles y difíciles de detectar. Un método común utilizado para la detección de la proliferación de linfocitos específicos de antígenos es [3H]-timidina, que es un nucleótido radiomarcado incorporado en el ADN de las células que proliferan. Aunque el ensayo [3H]-timidina puede detectar la síntesis de ADN, este método es una medida indirecta de la división celular, porque la síntesis de ADN puede iniciarse independientemente de la mitosis (es decir, durante la duplicación de genes y la apoptosis1). Este problema se agrava por el hecho de que la proliferación específicade antígenos de las células puede resultar en una apoptosis considerable 2, lo que conduce a una posible sobreestimación de la proliferación específica de antígenos. Además, el método [3H]-timidina no proporciona información fenotípica para los linfocitos que proliferan, como CD4+ o CD8+ proliferación de linaje en PMC estimulado con péptidos antigénicos.
En 2003, publicamos el primer ensayo de dilución de colorante utilizando CFSE, denominado ensayo de proliferación basado en CFSE3,4. CFSE es un tinte fluorescente que se une establemente a las proteínas intracelulares mediante la formación de un enlace covalente a los residuos de lisina intracelular. Dado que las proteínas etiquetadas por CFSE se dividen equitativamente entre las células hijas3, las células que se han dividido se pueden distinguir de las células no divididas por la citometría de flujo, lo que también permite el fenotipado cuantitativo de las poblaciones de linfocitos. De hecho, el número de divisiones a las que ha sufrido una céluladesde el momento de la tinción CFSE se puede medir hasta cierto grado 5. Más recientemente, se han desarrollado muchos tintes similares como CellTrace Violet proliferation dye (VPD)y CytoTrack dye, que funcionan de una manera similar 6. Este protocolo se centra en la CFSE, pero los principios se aplican por igual a otros dedos relacionados.
La tinción de tetramer péptido-MHC es un método ampliamente utilizado para detectar y clonar células CD8+ T específicas de antígenos. Este es un método bien establecido7,8,9,10; sin embargo, la clonación basada en tetrameros requiere el conocimiento existente de la restricción del epítopo/MHC y cada epítopo requiere su propio tetramémero11,lo que limita el alcance del descubrimiento y clonación de células T nuevas específicas de epítopos. La proliferación basada en CFSE se puede utilizar con péptidos, proteínas o lisados celulares. El protocolo descrito en este documento es simple y robusto, y las células CD4+ T que responden se pueden clasificar para su uso en ensayos de caracterización funcional y bioquímica aguas abajo12,13.
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Protocol
Todos los sujetos dieron su consentimiento informado antes de la recolección de sangre periférica. La aprobación ética para experimentos con PBMC fue dada por St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08, y HREC-A 161/15).
1. Preparación de reactivos
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Medios de células T humanas
- Preparar medios RP-5 para el cultivo de PBMC, que consiste en RPMI 1640, 1x aminoácidos no esenciales, Dipéptido L-aanyl-L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (0,1 mg/ml) y 5% suero humano agrupado (PHS).
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Soluciones bursátiles de CFSE
- Preparar un stock maestro disolviendo 25 mg de CFSE en 9 ml de DMSO para lograr una solución de stock final con una concentración de 5 mM.
- Preparar un stock de trabajo diluyendo el stock maestro en PBS para lograr una concentración de trabajo de 10 m.
2. Preparación de PBL humanos a partir de sangre entera
- Generalmente hay entre 0.5–1.5 x 106 PBMCs/ml de sangre periférica humana. Por lo tanto, la cantidad de sangre requerida depende del número deseado de PBL. Separe los PWC añadiendo 15 ml de medio de gradiente de densidad a un tubo de 50 ml y, a continuación, superponga 35 ml de sangre entera diluida.
- Centrífuga a 850 x g durante 15 min sin desaceleración a temperatura ambiente (RT). Esto resultará en tres capas claras: la capa inferior que contiene el pellet de glóbulos rojos, la capa media del medio de gradiente de densidad con glóbulos blancos que recubren su interfaz superior, y la capa plasmática superior14.
- Retire aproximadamente 20 ml de la capa de plasma superior. Recoger la capa de glóbulos blancos, teniendo cuidado de evitar el pellet de glóbulos rojos. Lave 3 veces con PBS y cuente las células viables usando la exclusión azul de trippan en un hemocitómetro. Diluir a 1 x 106 PBMCs/mL en PBS.
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Células no teñidas de CFSE
- Estas celdas se utilizan como controles de compensación para la citometría de flujo, que comprende de células sin mancha y CD4+ de un solo teñido. Añadir 300 l de cada muestra de control de suspensión PBMC a un tubo de 10 ml, parte superior con PBS, y centrífuga a 550 x g durante 5 min en RT.
- Resuspenda 1 x 106 celdas/mL en medios RP-5. Incubar estas células sin etiquetar durante 7 días en una incubadora de CO2 de 37 oC/5% con las células etiquetadas por CFSE (paso 2.6.1).
-
Células teñidas por CFSE
- Transfiera las células del paso 2.3 a un tubo de 50 ml. Añadir 1,0 ml de solución de material de trabajo CFSE (10 m) por 1 ml de suspensión celular al lado del tubo. Mezcle rápidamente invirtiendo el tubo varias veces. La concentración final de CFSE es de 10 nM.
- Incubar durante 5 min en una incubadora de CO2 de 37oC/5%. Para detener la tinción, añadir 5 mL de medios RP-5, pellet las células mediante centrifugación durante 5 min a 550 x g. Resuspenda los PPC a 1 x 106/mL en soportes RP-5.
- Añadir 1,0 ml de suspensión celular a un tubo de 10 ml. Utilice un tubo para cada antígeno que se va a probar.
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Estimulación antigénica de los PBL humanos y el cultivo celular
- Cultivo humano sólPC etiquetados cfSE con antígenos en medios RP-5 durante 7 días en una incubadora de CO2 de 37 oC/5%. Cultivo de 1 x 105 células/pozo (100 l) en una placa de 96 pocillos con 100 l/pozo de medios RP-5 que contienen antígeno diluido.
NOTA: Los antígenos utilizados, incluidas las concentraciones de trabajo, se resumen en el Cuadro1.
- Cultivo humano sólPC etiquetados cfSE con antígenos en medios RP-5 durante 7 días en una incubadora de CO2 de 37 oC/5%. Cultivo de 1 x 105 células/pozo (100 l) en una placa de 96 pocillos con 100 l/pozo de medios RP-5 que contienen antígeno diluido.
3. Tinción anti-CD4 para el análisis FACS
- Pipetear 200 l de las células cultivadas en tubos FACS, lavar las células 1x en 1,0 ml de PBS que contiene 0,1% de FCS y centrifugar durante 5 min a 550 x g.
- Mancha con CD4 antihumano Alexa Fluor 647 (0,25 mg/ml) en 100 oL de PBS/0.1% FCS. Mantenga a un lado una muestra de células etiquetadas cfSE, sin mancha rinde con otros fluoróforos, para utilizar para establecer la compensación FACS CFSE. Incubar las células a 4oC protegidas de la luz durante 20 min.
- Lave las células agregando 1 ml de PBS/0.1% FCS, centrífuga a 550 x g durante 5 min en RT, y resuspende en 100 sde PBS/0.1% FCS. Inmediatamente antes del análisis facS, agregue 1 l de yoduro de propidium (PI, 0,1 mg/ml) a todos los tubos para permitir que las células muertas sean excluidas por citometría de flujo.
4. Configuración citométrica de flujo y estrategia de gating
NOTA: La Figura 1 muestra la configuración FACS incluyendo los controles de compensación y la estrategia de gating.
- Gate the forward scatter (FSC) vs. side scatter (SSC) (Figura1A)población para incluir todos los linfocitos.
- Forme la población FSC frente a PI (Figura1B)en células negativas de PI para excluir las células apoptoticas.
- Utilice celdas no retenidas para establecer una línea base de tensión para las celdas no fluorescentes. Ajuste los voltajes para CD4-A647 y CFSE de modo que la señal de fluorescencia sea inferior a 1.000 para cada uno (Figura1C). Utilice los controles de color único CFSE (Figura 1D) y CD4-A647 (Figura1E) para confirmar señales fluorescentes positivas (10.000 euros) para cada color, utilizando los voltajes establecidos con celdas no manchadas.
- CFSE y PI tienen cierta superposición espectral; ajustar la compensación para restar PI fluoresence de fluoresencia CFSE hasta que la muestra sólo CFSE no produzca una señal en el canal PI.
NOTA: Estas puertas se aplicaron a todas las muestras analizadas en este documento.
5. Cálculo del índice de división celular para enumerar la proliferación de células T + CD4 específica sin antígenos
NOTA: El índice de división de celdas (CDI) se refiere al número de celdas divididas (CD4+/CFSEdim) por 5.000 celdas no divididas (CD4+/ CFSEbright). Cuando el número de células CD4+ no divididas no es exactamente 5.000, el número de celdas divididas se corrige para expresar el número de celdas divididas por 5.000 celdas no divididas. Por ejemplo, utilizando la proliferación específica de toxoides de tétanos (Figura2D),había 4.930 células no divididas (CFSEbrillante)y 3.268 células divididas (CFSEdim); por lo tanto, el número corregido de celdas divididas es (5.000/4.930) x 3.268 a 3.304,3.
- Calcular el CDI (Tabla1) dividiendo el número de celdas divididas/5.000 celdas no divididas del grupo estimulada por antígenos por el número medio de células divididas (por 5.000 células no divididas) de las células cultivadas sin antígeno (Tabla 2).
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Representative Results
Estimulación in vitro de PASTRO humanos con proteína toxoide del tétanos: los PBMU se mancharon con CFSE y se estimularon durante 7 días en presencia de toxoide de tétanos. Casi todos los donantes mostraron una fuerte respuesta de células T al toxoide del tétanos porque habían sido vacunados, lo que hace que el toxoide del tétanos sea un antígeno de control positivo útil. La Figura 2 demuestra en triplicado, que la proliferación CFSE de células CD4+ T de PPC no estimulados fue mínima (célulasdiminutas de CFSE de 12 CFSE; Figura 2A ,B,C), mientras que hubo una marcada proliferación de células CD4+ T en respuesta al toxoide del tétanos (>3,000 célulastenues CFSE; Figura 2D ,E,F).
Estimulación in vitro de PBMC humanos con péptidos antigénicos: los PBMC se mancharon con CFSE y se estimularon durante 7 días en presencia de péptido C de proinsulina humana. La Figura 3 muestra la detección de células CD4+ T específicas de péptidoC de proinsulina en la sangre periférica de un individuo con diabetes tipo 1. No se observó proliferación en el PBMC del donante sano (datos no mostrados). En la Figura4, los PPB estimulados con la proteína de matriz del virus de la gripe A (H1N1 PR8) demostraron la proliferación; sin embargo, la respuesta específica del tétanos para este donante fue relativamente débil, y las respuestas son generalmente variables entre los donantes.
En conjunto, estos resultados demuestran que el ensayo se puede realizar utilizando proteínas de longitud completa y péptidos sintéticos cortos.
Figura 1: Controles de compensación y estrategia de gating para la proliferación basada en CFSE de células CD4+ T. PPM no estimulados después de 7 días de cultivo celular in vitro. Los linfocitos (A) se teñían con yoduro de propidium, y las células propidum y negativas de yoduro se habían cerrado para excluir las células muertas (B). Los controles de compensación FACS incluían celdas no manchadas (C), celdas manchadas con CFSE sola (D) y celdas manchadas con CD4 solo (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Proliferación de células CD4+ T específicas del tétanos teñidas con CFSE. Los PMC fueron teñidos y cultivados por CFSE durante 7 días en presencia de 145 ng/mL (166 LfU/mL) toxoide del tétanos. Las células se tiñieron con CD4. La dilución de CFSE se muestra sin antígeno (A-C) y en respuesta a la proteína toxoide del tétanos (D-F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Proliferación de células CD4+ T humanas teñidas con CFSE en respuesta a la proinsulina C-péptido. Los PBMC teñidos de CFSE se cultivaron durante 7 días en presencia de péptido C de proinsulina de 10 m. Las células se tiñieron con CD4. La dilución de CFSE se muestra utilizando PBMC de un donante con diabetes tipo 1. Dilución de CFSE en PASTRO no estimulados (A), proteína toxoide del tétanos estimulada (B) y pbMC estimulado con proinsulina humana (C ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Proliferación de células T CD4+ humanas teñidas de CFSE en respuesta a la proteína de matriz del virus de la gripe A (H1N1 PR8) 1. Los PPB se mancharon y cultivaron cfSE durante 7 días en presencia de una proteína de matriz de virus de la gripe A de 0,08 g/ml 1. Las células se tiñieron con CD4. La dilución de CFSE se muestra para las células no estimuladas (A), las células estimuladas por toxoide del tétanos (B) y las células estimuladas por proteínas de la matriz del virus de la gripe A (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Antígeno | Concentración de trabajo |
| Proteína toxoide del tétanos | 145 ng/mL |
| Influenza A H1N1 (PR8) Proteína matriz 1 | 0.08–10 g/ml |
| Proinsulin C-péptido PI33-63 | 10 nM |
Tabla 1: Enumeración de CD4+ proliferación específico del tétanos. Cálculos de CDI utilizando 5.000 eventos de citometría de flujo registrados a partir de PBMC humano no estimulado y estimulado por el tétanos.
| Muestra | Células no divididas CD4+CFSEbrillante | Células divididas CD4+CFSEdim | Número de celdas divididas CFSEdim/5,000 CFSEbright | Células divididas medias CFSEdim/5,000 CFSEbrillante | |
| Nil 1 | 5.004 | 11 | 11 | 12.3 | |
| Nil 2 | 4.995 | 14 | 14 | ||
| Nil 3 | 5.006 | 12 | 12 | ||
| Muestra | Células no divididas CD4+CFSEbrillante | Células divididas CD4+CFSEdim | Número de celdas divididas CFSEdim/ 5000 CFSEbrillante | CDI Número de células divididas (Tétanos) Células divididas medias (Nil) | CDI medio |
| Tétanos 1 | 4.930 | 3.258 | 3.304,3 | 268 | 263.7 |
| Tétanos 2 | 4.928 | 3.205 | 3.251,8 | 263.7 | |
| Tétanos 3 | 4.910 | 3.142 | 3.199,6 | 259.5 |
Tabla 2: Antígenos utilizados para simular CD4+ proliferación.
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Discussion
La proliferación basada en CFSE es un método simple y robusto para detectar y enumerar células CD4+ T humanas específicas del antígeno. Se ha demostrado previamente que el uso de la concentración óptima de CFSE es esencial para obtener resultados óptimos4. Demasiada CFSE abroga la proliferación, mientras que muy poco no permite distinguir las células divididas e indivisas. Por el contrario, se utilizan concentraciones relativamente altas (5,0 m)de CFSE para etiquetar las células T murinas purificadas 3. Debido a la variabilidad entre lotes, se recomienda que cada lote sea valorado para determinar la concentración óptima. Utilizamos nuestro lote actual a una concentración mucho menor (10 nM) que en la publicación original (200 nM)4.
Otro aspecto importante de este método es la optimización de la dosis de antígeno. Se ha establecido que las células T cultivadas con menos antígeno pueden ser más sensibles y exhibir una función mejorada. Esto se demostró originalmente en el contexto de los péptidos del VIH15. La cantidad de toxoide del tétanos utilizado en este protocolo también se ha optimizado previamente4 para lograr células CD4+ T altamente sensibles y proliferativas. Curiosamente, se ha demostrado anteriormente que el exceso de antígeno reduce la proliferación específica de antígenosorgeno 15. Por lo tanto, para detectar y enumerar poblaciones raras de células T en sangre periférica, optimizar tanto la concentración de antígeno como la concentración de CFSE es de suma importancia.
Desde que publicamos el primer ensayo basado en dilución de tinte humano4, se han desarrollado muchos tintes similares. Encontramos que la proliferación de células CD4+ T se detectó de manera menos efectiva cuando PKH-26, un tinte lipofílico, se utilizó en comparación con CFSE (inédito). No hemos probado sistemáticamente otros dedos en el mercado, por lo que no hay comentarios sobre sus fortalezas relativas. Sin embargo, el protocolo para cuantificar la proliferación de células T es igualmente aplicable a todos los ensayos de proliferación de dilución de tinte.
Expresar la proliferación como índice de división celular (CDI) incorpora la proliferación de fondo en el cálculo de la magnitud de las respuestas. En nuestras manos, el fondo suele ser bajo (por ejemplo, <15 eventos/5.000 CD4+ CFSEbrillante). La proliferación de fondo varía entre individuos y experimentos. El uso de una relación (en este caso, el CDI) para expresar la fuerza de la proliferación es algo eficaz en la reducción de su impacto en los resultados. Las respuestas de fondo a las proteínas en los medios pueden ser problemáticas. Se recomienda utilizar medios de cultivo de tejido que contengan suero humano, no suero bovino, ya que las proteínas bovinas pueden estimular una respuesta de fondo débil que disminuye la sensibilidad del ensayo. Se ha encontrado una proliferación de antecedentes elevados en personas que tienen una infección leve, presumiblemente debido a la proliferación que se prepara in vivo en respuesta a la infección. En tales casos, el ensayo debe repetirse una vez que el donante ha limpiado la infección.
El ensayo de proliferación basado en CFSE se puede modificar para clonar eficientemente células CD4+ T específicas de antígenos humanos directamente de PBMCs12. Por ejemplo, este enfoque se ha utilizado para clonar células CD4+ T específicas para insulina12. Másrecientemente, la clonación y los análisis funcionales de los células CD4+ T específicas de la proinsulina C-péptido han proporcionado una visión notable de la patogénesis de la T1D, particularmente en pacientes con inicio reciente T1D13.
En conclusión, el ensayo de proliferación basado en la CFSE es sensible y robusto. Es rápido y técnicamente simple y se puede realizar utilizando PBMC fresco o crioconservado. La capacidad de incorporar CFSE en el análisis FACS multicolor proporciona una medida cuantitativa del inmunofenotipo de las células T proliferantes de PBMC que contienen muchos tipos de células, y este grado de detalle no es posible con ensayos que utilizan la incorporación de ADN como [3H]-timidina.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por: The Juvenile Diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). El Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC GNT123586) (S. M.), Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), Programa de Apoyo a la Infraestructura Operacional del Gobierno Victoriano (S. M., A. D., E. T., M. S.) y NHMRC Beca de posgrado APP1094337 y Beca JDRF Ph-up (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
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