Summary
Представлен протокол для измерения размножающихся CD4и Т-клеток в ответ на антигенные белки или пептиды с использованием разбавления красителей. Этот ассси особенно чувствителен к редким антиген-специфическим Т-клеткам и может быть модифицирован для облегчения клонирования антиген-специфических клеток.
Abstract
Описанный является простой, in vitro, на основе разбавления красителей метод для измерения антиген-специфических CD4и Т-клеток пролиферации в периферических клеток крови человека (PBMCs). Развитие стабильных, нетоксических, флуоресцентных красителей, таких как carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) позволяет отличать редкие, антиген-специфические Т-клетки от прохожих путем увлажнения флуоресцентного окрашивания, как обнаруживается цитометрией. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с альтернативными подходами: i) он очень чувствителен к низкочастотным Т-клеткам, (ii) не требуется никаких знаний об антигене или эпитопе, (iii) фенотип ответных клеток может быть проанализирован, и (iv) жизнеспособный, отвечая клетки могут быть отсортированы и использованы для дальнейшего анализа, такие как клонирование Т-клеток.
Introduction
Способность обнаруживать и изучать антиген-специфические Т-клетки имеет важное значение в исследованиях клеточного иммунитета. Тем не менее, это особенно сложно для аутоантигена конкретных CD4и Т-клеток ответов, которые являются очень слабыми и трудно обнаружить. Распространенным методом, используемым для обнаружения пролиферации антигена специфического лимфоцита, является тимидин, который представляет собой радиомаркированный нуклеотид, включенный в ДНК размножающихся клеток. Несмотря на то, что анализ «3H» может обнаружить синтез ДНК, этот метод является косвенным мерилом деления клеток, потому что синтез ДНК может инициировать независимо от митоза (т.е. во время дублирования генов и апоптоза1). Этот вопрос усугубляется тем фактом, что антиген-специфическое пролиферацияклеток может привести к значительному апоптозу 2, что приводит к потенциальной переоценке антиген-специфического распространения. Кроме того, метод «3H» -тимидина не обеспечивает фенотипическую информацию для распространения лимфоцитов, таких как CD4или CD8- распространение линии в ПБМК, стимулируемых антигенными пептидами.
В 2003 году мы опубликовали первый рассеивание разбавления красителя с использованием CFSE, называется CFSE основе пролиферации асссы3,4. CFSE является флуоресцентным красителем, который связывается с внутриклеточными белками, образуя ковалентную связь с внутриклеточными остатками лизина. Так как белки с маркировкой CFSE делятся поровну между дочерными клетками3, клетки, которые разделились, можно отличить от неразделенных клеток по цитометрии потока, что также позволяет количественное фенотипирование популяций лимфоцитов. Действительно, количество делений клетки претерпела со времени CFSE-окрашивания может быть измерена в некоторой степени5. В последнее время, многие подобные красители, такие как CellTrace фиолетовый краситель пролиферации (VPD) и CytoTrack краситель были разработаны, которые работают аналогичным образом6. Этот протокол фокусируется на CFSE, но принципы в равной степени применимы к другим связанным красителей.
Тетрамер пептида-MHC является широко используемым методом для обнаружения и клонирования антигена конкретных CD8и Т-клеток. Это устоявшийсяметод 7,8,9,10; однако, тетрамер основе клонирования требует существующих знаний о эпитоп / MHC ограничения и каждый эпитоп требует своего собственного тетрамера11, который ограничивает область открытия и клонирования новых эпитопных конкретных Т-клеток. Пролиферация на основе CFSE может быть использована с пептидами, белками или клеточными лисатами. Описанный в настоящем году протокол является простым и надежным, а ответные CD4и Т-клетки могут быть отсортированы для использования в нижепотечений функциональных и биохимических характеристик анализов12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все испытуемые дали информированное согласие до сбора периферической крови. Этическое одобрение для экспериментов с использованием PBMC было дано Хосптиал Сент-Винсента (HREC-A 135/08, и HREC-A 161/15).
1. Подготовка реагента
-
Т-клеточные носители
- Приготовьте rp-5 media для культивирования PBMC, который состоит из RPMI 1640, 1x несущественных аминокислот, L-аланил-L-глютамин дипептид (2 мМ), пенициллин (100 U/mL)/стрептомицин (0,1 мг/мл), и 5% объединившейся человеческой сыворотки (PHS).
-
Акционерные решения CFSE
- Подготовьте основной запас, растворив 25 мг CFSE в 9 мл DMSO для достижения окончательного решения запасов с концентрацией 5 мМ.
- Подготовьте рабочий запас, разбавив основной запас в PBS для достижения рабочей концентрации в 10 км.
2. Подготовка ПБМК человека из цельной крови
- Есть, как правило, между 0,5-1,5 х 106 PBMCs / мл человеческой периферической крови. Таким образом, количество необходимой крови зависит от желаемого количества ПБМК. Разбавить человеческую периферийную кровь PBS по крайней мере 1:2. Отделите PBMCs путем добавлять 15 ml среды градиента плотности к пробке 50 mL, тогда накладываем 35 ml разбавленной цельной крови.
- Центрифуга при 850 х г в течение 15 мин без замедления при комнатной температуре (RT). Это приведет к трем ясным слоям: нижний слой, содержащий гранулы красных кровяных клеток, средний слой градиентной среды плотности с белыми кровяными клетками, выстилающими его верхний интерфейс, и верхний плазменный слой14.
- Удалите около 20 мл верхнего слоя плазмы. Соберите слой белых кровяных телец, стараясь избежать красных кровяных клеток. Вымойте 3x с PBS и рассчитывать жизнеспособных клеток с помощью trypan синий исключение на гемоцитометр. Разбавить до 1 х 106 PBMCs/mL в PBS.
-
Не-CFSE окрашенные клетки
- Эти клетки используются в качестве компенсационного контроля для цитометрии потока, состоящей из неокрашенных и CD4- одноцветных клеток. Добавьте 300 л каждого контрольного образца подвески PBMC к трубке 10 мл, сверху с PBS и центрифугу при 550 х г в течение 5 мин на РТ.
- Resuspend 1 х 106 ячеек/мл в носителе RP-5. Инкубировать эти немаркированные клетки в течение 7 дней в инкубаторе CO/5% co2 с клетками с маркировкой CFSE (шаг 2.6.1).
-
Окрашенные CFSE клетки
- Перенесите клетки со ступени 2.3 в трубку 50 мл. Добавьте 1,0 л рабочего запаса CFSE (10 мкм) на 1 мл клеточной подвески на бок трубки. Быстро перемешайте, инвертируя трубку несколько раз. Окончательная концентрация CFSE составляет 10 нм.
- Инкубировать в течение 5 мин в инкубаторе CO 2 37 градусов по Цельсию/5%. Чтобы остановить окрашивание, добавьте 5 мл носителей RP-5, гранулы клетки центрифугирование м 5 мин при 550 х г. Приостановить PBMCs на 1 х 106/мл в RP-5 средств массовой информации.
- Добавьте 1,0 мл клеточной подвески в трубку 10 мл. Используйте одну трубку для каждого антигена для тестирования.
-
Антигенная стимуляция ПБМК и клеточной культуры человека
- Культура человека CFSE помечены PBMCs с антигенами в RP-5 средств массовой информации в течение 7 дней в 37 КС / 5% CO2 инкубатора. Культура 1 х 105 клеток/хорошо (100 л) в пластине 96 скважин с 100 Л/кололи носителей RP-5, содержащими разбавленный антиген.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые антигены, включая рабочие концентрации, обобщены в таблице 1.
- Культура человека CFSE помечены PBMCs с антигенами в RP-5 средств массовой информации в течение 7 дней в 37 КС / 5% CO2 инкубатора. Культура 1 х 105 клеток/хорошо (100 л) в пластине 96 скважин с 100 Л/кололи носителей RP-5, содержащими разбавленный антиген.
3. Anti-CD4 Окрашивание для анализа FACS
- Пипетка 200 л культивированных клеток в трубки FACS, мыть клетки 1x в 1,0 мл PBS, содержащий 0,1% FCS, и центрифуги в течение 5 мин при 550 х г.
- Пятно с анти-человеческой CD4 Alexa Fluor 647 (0,25 мг/мл) в 100 Л Л PBS/0,1% FCS. Держите в стороне образец клеток с маркировкой CFSE, неокрашенных любыми другими флюорофорами, чтобы использовать для установки компенсации FACS CFSE. Инкубировать клетки при 4 градусах по Цельсию, защищенные от света в течение 20 мин.
- Вымойте клетки, добавив 1 мл PBS/0,1% FCS, центрифугу при 550 х г в течение 5 мин на РТ, и повторно в 100 л PBS/0,1% FCS. Непосредственно перед анализом FACS, добавить 1 литр пропидия йодида (PI, 0,1 мг/мл) для всех труб, чтобы мертвые клетки должны быть исключены поток цитометрии.
4. Поток Цитометрическая конфигурация и Стратегия Gating
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показана конфигурация FACS, включая контроль над компенсацией и стратегию gating.
- Ворота вперед рассеяния (FSC) против стороны рассеяния (SSC) (Рисунок 1A) населения включить все лимфоциты.
- Ворота FSC против PI(Рисунок 1B) населения на PI отрицательных ячеек, чтобы исключить апоптотические клетки.
- Используйте неокрашенные клетки, чтобы установить базовый уклад напряжения для нелюфлуесцентных клеток. Установите напряжение для CD4-A647 и CFSE так, чтобы сигнал флуоресценции был ниже 1000 для каждого(рисунок 1C). Используйте одноцветные элементы управления CFSE(рисунок 1D)и CD4-A647 (рисунок1E)для подтверждения положительных флуоресцентных сигналов (10 000 евро) для каждого цвета, используя напряжение, установленное с неокрашенными клетками.
- CFSE и PI имеют некоторые спектральные перекрытия; настроить компенсацию для вычета ФЛуоресции PI из ФЛуоресции CFSE до тех пор, пока только образец CFSE не даст сигнала в канале PI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти ворота были применены ко всем образцам, проанализированным в данном документе.
5. Расчет индекса деления клеток для перечисления антигена конкретных CD4и T-сотовой пролиферации
ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс деления ячеек (CDI) относится к числу разделенных ячеек (CD4/CFSEdim)на 5000 неразделенных ячеек (CD4/CFSEяркий). Когда количество неразделенных клеток CD4и составляет не совсем 5000, количество разделенных ячеек корректируется, чтобы выразить количество разделенных ячеек на 5000 неразделенных ячеек. Например, с использованием столбняка токсоидного-специфического пролиферации(рисунок 2D),было 4930 неразделенных клеток (CFSEяркий) и 3268 разделенных клеток (CFSEтусклый); Таким образом, исправленное число разделенных ячеек составляет (5000/4,930) х 3268 и 3 304,3.
- Рассчитайте CDI (Таблица 1) путем деления числа разделенных клеток / 5000 неразделенных клеток из антиген-стимулировали группу на среднее количество разделенных клеток (на 5000 неразделенных клеток) из клеток, культивируемых без антигена (Таблица 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В пробирке стимуляция ПБМК человека с столбняком токсоидного белка: ПБМК были окрашены CFSE и стимулировали в течение 7 дней в присутствии столбняка токсоидов. Почти все доноры показали сильную реакцию Т-клеток на столбняк аксоид, потому что они были вакцинированы, что делает столбняка токсоидов полезным положительным антигеном контроля. Рисунок 2 показывает в тройном, что пролиферация CFSE CD4и Т-клеток от нестимулированных ПБМК была минимальной (No 12дим-клеток CFSE; Рисунок 2A ,B,C), в то время как было заметное распространение CD4и Т-клеток в ответ на столбняка токсоида (зgt;3,000 CFSEтусклых клеток; Рисунок 2D ,E,F).
В пробирке стимуляция ПБМК человека с антигенными пептидами: ПБМК были окрашены CFSE и стимулировали в течение 7 дней в присутствии человека проинсулин C-пептид. Рисунок 3 демонстрирует обнаружение проинсулина C-пептид-специфических CD4и Т-клеток в периферической крови человека с диабетом типа 1. Распространение не наблюдалось в PBMC здорового донора (данные не показаны). На рисунке 4ПБМК, стимулируемые с помощью вируса гриппа А (H1N1 PR8) матричного белка продемонстрировали пролиферацию; однако реакция на столбняк для этого донора была относительно слабой, и ответы, как правило, являются переменными между донорами.
Взятые вместе, эти результаты показывают, что анализ может быть выполнен с использованием полнометражных белков и коротких синтетических пептидов.
Рисунок 1: Компенсационный контроль и стратегия gating для cfSE-пролиферации CD4и Т-клеток. Нестимулированные ПБМК после 7 дней культуры клеток in vitro. Лимфоциты (A) были окрашены пропидий йодид, и propidium йодид-отрицательные клетки были закрыты, чтобы исключить мертвые клетки (B). FACS компенсации контроля включены неокрашенные клетки (C), клетки окрашенных CFSE в одиночку (D), и клетки окрашенных CD4 только (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Распространение окрашенных ДОФЦ столбняка, специфических CD4и Т-клеток. ПБМК были запятнаны CFSE и культивировались в течение 7 дней при наличии 145 нг/мл (166 LfU/mL) столбняка токсоидов. Клетки были окрашены CD4. Разбавление CFSE показано без антигена(A-C)и в ответ на столбняк токсоидный белок(D-F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Распространение CFSE-окрашенных человеческих CD4и Т-клеток в ответ на проинсулин C-пептид. CFSE окрашенных ПБМК были культивированы в течение 7 дней в присутствии 10 мкм проинсулин C-пептид. Клетки были окрашены CD4. Разбавление CFSE показано с помощью PBMC от донора с диабетом типа 1. РАЗбавление CFSE в нестимулированных ПБМК (A), столбняка токсоидного белка стимулировали (B), и человека проинсулин C-пептид стимулировали ПБМК (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Распространение окрашенных CFSE человеческих CD4 'Т-клеток в ответ на вирус гриппа А (H1N1 PR8) матричного белка 1. ПБМК были запятнаны CFSE и культивировались в течение 7 дней при наличии 0,08 мкг/мЛ гриппа вирусной матрицы белка 1. Клетки были окрашены CD4. Разбавление CFSE показано для нестимулированных клеток (A), столбняка токсоидов стимулировали клетки (B), и гриппа вирус матрицы белка стимулировали клетки (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Антигена | Рабочая концентрация |
| Столбняк токсоидный белок | 145 нг/мл |
| Грипп A H1N1 (PR8) Матрица белка 1 | 0,08-10 мкг/мл |
| Проинсулин C-пептид PI33-63 | 10 нм |
Таблица 1: Перечисление столбняка конкретных CD4и распространения. CdI расчеты с использованием 5000 зарегистрированных событий цитометрии потока от нестимулированных и столбняка стимулировали человека PBMC.
| Образец | Неразделенные клетки CD4иCFSEяркие | Разделенные ячейки CD4иCFSEтусклый | Количество разделенных ячеек CFSEтусклый/5,000 CFSEяркий | Средние разделенные клетки CFSEтусклый/5,000 CFSEяркий | |
| Нил 1 | 5,004 | 11 Год | 11 Год | 12.3 | |
| Нил 2 | 4 995 | 14 Год | 14 Год | ||
| Нил 3 | 5,006 | 12 Лет | 12 Лет | ||
| Образец | Неразделенные клетки CD4иCFSEяркие | Разделенные ячейки CD4иCFSEтусклый | Количество разделенных ячеек CFSEтусклый/ 5000 CFSEяркий | CDI Количество разделенных клеток (столбняк) Средние разделенные клетки (Nil) | Средний CDI |
| Столбняк 1 | 4 930 | 3 258 | 3 304,3 | 268 г. | 263,7 |
| Столбняк 2 | 4 928 | 3 205 | 3 251,8 | 263,7 | |
| Столбняк 3 | 4 910 | 3 142 | 3 199,6 | 259,5 |
Таблица 2: Антигены, используемые для имитации пролиферации CD4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пролиферация на основе CFSE является простым и надежным методом для обнаружения и перечисления антиген-специфических человеческих CD4и Т-клеток. Ранее было продемонстрировано, что использование оптимальной концентрации CFSE имеет важное значение для оптимальных результатов4. Слишком много CFSE отменяет распространение, в то время как слишком мало не позволяет различать разделенные и неделимые ячейки. В отличие от этого, относительно высокие концентрации (5,0 мкм) CFSE используются для обозначения очищенных цур-клеток 3. Из-за изменчивости между партиями, рекомендуется, чтобы каждая партия была титровать, чтобы определить оптимальную концентрацию. Мы используем нашу текущую партию в гораздо более низкой концентрации (10 нм), чем в оригинальной публикации (200 нм)4.
Другим важным аспектом этого метода является оптимизация дозы антигена. Было хорошо установлено, что Т-клетки, культивируемые с меньшим количеством антигена, могут быть более чувствительными и выполнять повышенную функцию. Это было первоначально продемонстрировано в контексте ПЕПтидов ВИЧ15. Количество столбняка токсоида, используемого в этом протоколе, также было оптимизировано ранее4 для выяснения высокочувствительных и пролиферативных CD4и Т-клеток. Интересно, что ранее было показано, что избыток антигена уменьшает антиген-специфическое пролиферация15. Поэтому для выявления и перечисления редких популяций Т-клеток в периферической крови крайне важно оптимизировать концентрацию антигена и CFSE.
Так как мы опубликовали первый человек красителя разбавления на основе асссе4, многие подобные красители были разработаны. Мы обнаружили, что пролиферация клеток CD4и Т была обнаружена менее эффективно, когда PKH-26, липофильный краситель, был использован по сравнению с CFSE (неопубликованные). Мы не проверяли на рынке другие красители, поэтому не комментируют их относительные сильные стороны. Тем не менее, протокол для количественной пролиферации Т-клеток в равной степени применим ко всем анализам пролиферации дифероции красителей.
Выражение пролиферации как индекса деления клеток (CDI) включает фоновое распространение в расчет величины ответов. В наших руках фон, как правило, низкий (например, lt;15 событий / 5,000 CD4и CFSEяркий). Фоновое распространение действительно варьируется между отдельными лицами и экспериментами. Использование соотношения (в данном случае CDI) для выражения силы распространения несколько эффективно в снижении его влияния на результаты. Фоновая реакция на белки в средствах массовой информации может быть проблематичной. Рекомендуется использовать средства культуры тканей, которые содержат сыворотку человека, а не бычья сыворотку, так как бычьи белки могут стимулировать слабую фоновую реакцию, которая снижает чувствительность анализов. Высокий фон распространения было обнаружено у людей, которые имеют легкую инфекцию, предположительно из-за распространения, которое загрунтовано in vivo в ответ на инфекцию. В таких случаях анализ должен быть повторен после того, как донор очищает инфекцию.
ПРОцирование на основе CFSE может быть изменено, чтобы эффективно клонировать человека антиген-специфических CD4и Т-клеток непосредственно из PBMCs12. Например, этот подход был использован для клонирования CD4и Т-клеток, специфиченных для инсулина12. В последнее время, клонирование и функциональный анализ проинсулин C-пептид-специфических CD4и Т-клеток предоставила замечательное понимание патогенеза T1D, особенно у пациентов с недавним началом T1D13.
В заключение я хотел бы сказать, что данный вопрос о распространении на основе CFSE является как деликатным, так и надежным. Это быстро и технически просто и может быть выполнена с помощью свежих или криоконсервированных PBMC. Способность включать CFSE в многоцветный анализ FACS обеспечивает количественную меру иммунофенотипа размножающихся Т-клеток из PBMC, содержащих многие типы клеток, и эта степень детализации невозможна с анализами с использованием регистрации ДНК например, тимидин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана: Фонд исследований диабета для несовершеннолетних (JDRF 5-CDA-2014-210-A-N) (S. M.). Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC GNT123586) (S. M.), Премия по исследованию диабета Австралии (Y17M1-MANS) (S. M.), Программа поддержки оперативной инфраструктуры правительства Виктории (S. M., A. D., E. T., M. S.) и NHMRC Аспирантская стипендия APP1094337 и стипендия JDRF PhD Top-up (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
