Summary
Presenteras här är ett protokoll för att mäta prolifererande CD4+ T-celler som svar på antigen proteiner eller peptider med hjälp av färg utspädning. Denna analys är särskilt känslig för sällsynta antigen-specifika T-celler och kan ändras för att underlätta kloning av antigen-specifika celler.
Abstract
Beskrivs är en enkel, in vitro-, Dye utspädning-baserad metod för att mäta antigen-specifik CD4+ T cell proliferation i human perifert blod mononukleära celler (pbmcs). Utvecklingen av stabila, giftfria, fluorescerande färgämnen som karboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) gör det möjligt för sällsynta, antigen-specifika T-celler att skiljas från åskådare genom minskning av fluorescerande färgning, som upptäcks av flödescytometri. Denna metod har följande fördelar jämfört med alternativa metoder: (i) den är mycket känslig för lågfrekventa T-celler, (II) ingen kunskap om antigen eller epitop krävs, (III) fenotypen för de svarande cellerna kan analyseras och (IV) livskraftiga, svara på celler kan sorteras och användas för ytterligare analys, till exempel T-cellskloning.
Introduction
Förmågan att detektera och studera antigen-specifika T-celler är viktig i studier av cellmedierad immunitet. Emellertid, detta är särskilt utmanande för autoantigen-specifika CD4+ T-cells svar, som är mycket svaga och svåra att upptäcka. En vanlig metod som används för detektion av antigen-specifika lymfocytproliferation är [3H]-tymidin, som är en radioaktivt märkt nukleotid införlivas i DNA av prolifererande celler. Även om [3H]-thymidine-analysen kan detektera DNA-syntes, är denna metod ett indirekt mått på celldelning, eftersom DNA-syntesen kan initiera oberoende av Mitos (dvs. under genduplicering och apoptos1). Denna fråga förvärras av det faktum att antigen-specifik spridning av celler kan resultera i betydande apoptos2, vilket leder till potentiell överskattning av antigen-specifik spridning. Vidare, den [3H]-thymidine metoden ger inte fenotypisk information för prolifererande lymfocyter, såsom CD4+ eller CD8+ härstamning proliferation i pbmcs stimuleras med antigen peptider.
I 2003, vi publicerade den första färg utspädning analysen med cfse, kallas cfse-baserade proliferation assay3,4. CFSE är ett fluorescerande färgämne som binder stabilt till intracellulära proteiner genom att bilda en kovalent bindning till intracellulära lysinrester. Eftersom CFSE-märkta proteiner delas lika mellan dotterceller3, celler som har delat kan särskiljas från odelade celler med flödescytometri, vilket också möjliggör kvantitativ fenotypning av lymfocytpopulationer. Faktum är att antalet divisioner som en cell har genomgått från tidpunkten för CFSE-färgning kan mätas till en viss grad5. På senare tid har många liknande färgämnen som CellTrace Violet proliferation Dye (VPD) och CytoTrack Dye utvecklats, som fungerar på ett liknande sätt6. Detta protokoll fokuserar på CFSE, men principerna gäller också för andra relaterade färgämnen.
Peptid-MHC tetramer färgning är en allmänt använd metod för att upptäcka och kloning antigen-specifika CD8+ T-celler. Detta är en väletablerad metod7,8,9,10; den tetramer-baserade kloningen kräver dock befintlig kunskap om begränsningen av epitop/MHC och varje epitop kräver sin egen tetramer11, vilket begränsar omfattningen av upptäckten och kloningen av nya epitopespecifika T-celler. Den CFSE-baserade spridningen kan användas med peptider, proteiner, eller cell Lysates. Det protokoll som beskrivs häri är både enkel och robust, och de svarande CD4+ T-celler kan sorteras för användning i nedströms funktionella och biokemiska karakteriseringstester12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försökspersoner gav informerat samtycke före insamlingen av perifert blod. Etiskt godkännande av experiment med hjälp av PBMC gavs av St Vincent ' s Hosptial (HREC-A 135/08, och HREC-A 161/15).
1. beredning av reagens
-
Mänskliga T-cellmedia
- Förbered RP-5-medier för odling av PBMC, som består av RPMI 1640, 1x icke-essentiella aminosyror, L-alanyl-L-glutamin dipeptid (2 mM), penicillin (100 U/mL)/streptomycin (0,1 mg/mL) och 5% poolat humant serum (PHS).
-
CFSE lagerlösningar
- Förbered en masterstock genom att lösa upp 25 mg CFSE i ~ 9 mL DMSO för att uppnå en slutlig stamlösning med en koncentration av 5 mM.
- Förbered en arbets lager genom att späda masterstocken i PBS för att uppnå en arbets koncentration på 10 μM.
2. beredning av humana PBMCs från helblod
- Det finns i allmänhet mellan 0.5 – 1.5 x 106 pbmcs/ml av humant perifert blod. Därför, mängden blod som krävs beror på önskat antal PBMCs. Späd humant perifert blod med PBS minst 1:2. Separera PBMCs genom att tillsätta 15 mL densitet gradient medium till en 50 mL rör, sedan overlay 35 mL av utspädd helblod.
- Centrifugera vid 850 x g i 15 min utan retardation vid rumstemperatur (RT). Detta kommer att resultera i tre tydliga lager: bottenskiktet som innehåller röda blodkroppar pelleten, mellersta lagret av densitet gradient medium med vita blodkroppar som kantar dess övre gränssnitt, och översta plasma skikt14.
- Ta bort cirka 20 mL av det översta plasma skiktet. Samla in vita blodkroppar lagret, är noga med att undvika den röda blodkroppar pelleten. Tvätta 3x med PBS och räkna livskraftiga celler med trypan blå uteslutning på en hemocytometer. Späd till 1 x 106 pbmcs/ml i PBS.
-
Icke-CFSE-färgade celler
- Dessa celler används som kompensationskontroller för flödescytometri, bestående av ofärgade och CD4+ enfärgade celler. Tillsätt 300 μL av varje kontrollprov PBMC-suspension till en 10 mL tub, topp med PBS och centrifugera vid 550 x g i 5 minuter vid RT.
- Omsuspendera 1 x 106 celler/ml i RP-5-medier. Inkubera dessa omärkta celler i 7 dagar i en 37 ° c/5% CO2 inkubator med cfse-märkta celler (steg 2.6.1).
-
CFSE-färgade celler
- Överför cellerna från steg 2,3 till en 50 mL tub. Tillsätt 1,0 μL CFSE-arbetslagerlösning (10 μM) per 1 mL cellsuspension till sidan av röret. Blanda snabbt genom att invertera röret flera gånger. Den slutliga koncentrationen av CFSE är 10 nM.
- Inkubera i 5 minuter i en 37 ° c/5% CO2 inkubator. För att stoppa färgning, tillsätt 5 mL RP-5-media, pellets cellerna genom centrifugering för 5 min vid 550 x g. Omsuspendera PBMCs vid 1 x 106/ml i RP-5-medier.
- Tillsätt 1,0 mL cellsuspension till en 10 mL tub. Använd ett rör för varje antigen som ska testas.
-
Antigen stimulering av humana PBMCs och cellkulturer
- Kultur humant CFSE-märkt PBMCs med antigener i RP-5-medier i 7 dagar i en 37 ° c/5% CO2 inkubator. Kultur 1 x 105 celler/brunn (100 μl) i en 96 väl tallrik med 100 μl/brunn av RP-5-material som innehåller utspädd antigen.
Anmärkning: antigener som används, inklusive arbets koncentrationer, sammanfattas i tabell 1.
- Kultur humant CFSE-märkt PBMCs med antigener i RP-5-medier i 7 dagar i en 37 ° c/5% CO2 inkubator. Kultur 1 x 105 celler/brunn (100 μl) i en 96 väl tallrik med 100 μl/brunn av RP-5-material som innehåller utspädd antigen.
3. anti-CD4 färgning för FACS analys
- Pipettera över 200 μL av de odlade cellerna till FACS-rören, tvätta cellerna 1x i 1,0 mL PBS innehållande 0,1% FCS och Centrifugera i 5 minuter vid 550 x g.
- Fläcken med anti-human CD4 Alexa fluor 647 (0,25 mg/mL) i 100 μL av PBS/0,1% FCS. Lägg undan ett urval av CFSE-märkta celler, ofärgade med andra fluoroforer, för att fastställa ersättningen för FACS CFSE. Inkubera cellerna vid 4 ° c skyddat från ljus i 20 min.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 mL PBS/0,1% FCS, Centrifugera vid 550 x g i 5 min vid RT och Omsuspendera i 100 μl PBS/0,1% FCS. Tillsätt omedelbart före FACS-analysen 1 μl propidiumjodid jodid (Pi, 0,1 mg/ml) till alla rör så att de döda cellerna kan uteslutas genom flödescytometri.
4. flödes Cytometrisk konfiguration och gating strategi
Anmärkning: Figur 1 visar FACS-konfigurationen, inklusive kompensationskontroller och gating-strategi.
- Grinden framåt scatter (FSC) kontra sida scatter (SSC) (figur 1a) population att inkludera alla lymfocyter.
- Grinden FSC vs PI (figur 1b) population på Pi negativa celler att utesluta apoptotiska celler.
- Använd ofärgade celler för att ställa in en spännings baslinje för icke-fluorescerande celler. Ställ in spänningar för CD4-A647 och CFSE så att fluorescens signalen är under 1 000 för varje (figur 1c). Använd den enda färg kontroller CFSE (figur 1d) och CD4-A647 (figur 1e) för att bekräfta positiva fluorescerande signaler (~ 10 000) för varje färg, med hjälp av spänningar med ofärgade celler.
- CFSE och PI har en viss spektralöverlappning; justera ersättningen för att subtrahera PI-fluoresence från CFSE fluoresence tills det CFSE-enda exemplet inte ger en signal i PI-kanalen.
Anmärkning: Dessa grindar tillämpades på alla prover som analyserades häri.
5. beräkning av cell Division index för att räkna upp antigen-specifik CD4+ T cell proliferation
Anmärkning: Cell Division index (CDI) hänvisar till antalet uppdelade celler (CD4+/cfsedim) per 5 000 odelade celler (CD4+/cfseBright). När antalet odelade CD4+ celler är inte exakt 5 000, antalet uppdelade celler korrigeras för att uttrycka antalet uppdelade celler per 5 000 odelade celler. Till exempel, med hjälp av stelkramp toxoid-specifik proliferation (figur 2D), fanns det 4 930 odelade celler (cfseBright) och 3 268 uppdelade celler (cfsedim); Därför är det korrigerade antalet uppdelade celler (5000/4930) x 3 268 = 3 304,3.
- Beräkna CDI (tabell 1) genom att dividera antalet uppdelade celler/5000 odelade celler från den antigenstimulerade gruppen med medelvärdet av antalet uppdelade celler (per 5 000 odelade celler) från cellerna odlade utan antigen (tabell 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro stimulering av mänskliga PBMCs med stelkramp tetanustoxoid protein: PBMCs färgas med CFSE och stimulerades för 7 dagar i närvaro av stelkramp tetanustoxoid. Nästan alla givare visade en stark T-cell svar på stelkramp tetanustoxoid eftersom de hade vaccinerats, vilket gör stelkramp tetanustoxoid en användbar positiv kontroll antigen. Figur 2 visar i tre exemplar, att cfse spridning av CD4+ T-celler från ostimulerad pbmcs var minimal (~ 12 cfsedim celler; Figur 2A , B, C), medan det fanns en markant spridning av CD4+ T-celler som svar på stelkramp tetanustoxoid (> 3000 cfsedim celler; Figur 2D , E, F).
In vitro-stimulering av humana PBMCs med antigena peptider: PBMCs färgas med CFSE och stimulerades i 7 dagar i närvaro av Human proinsulin C-peptid. Figur 3 visar detektion av proinsulin C-peptid-specifika CD4+ T-celler i perifert blod av en individ med typ 1-diabetes. Proliferation observerades inte hos den friska donatorns PBMC (data ej visad). I figur 4, pbmcs stimulerad med influensa a-virus (H1N1 PR8) Matrix protein visat proliferation; emellertid, den tetanus-specifika svar för denna givare var relativt svag, och svaren är i allmänhet varierande mellan givarna.
Sammantaget visar dessa resultat att analysen kan utföras med hjälp av fullängds proteiner och korta syntetiska peptider.
Figur 1: kompensationskontroller och gating strategi för CFSE-baserad spridning av CD4+ T-celler. Ostimulerad PBMCs efter 7 dagar av in vitro cellkultur. Lymfocyter (A) färgas med propidiumjodid jodid, och propidiumjodid iodide-negativa celler var gated att utesluta döda celler (B). FACS kompensationskontroller inkluderade ofärgade celler (C), celler färgade med enbart Cfse (D) och celler färgade med enbart CD4 (E). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: spridning av CFSE-färgade tetanusspecifika CD4+ T-celler. Pbmcs var cfse-färgade och odlade i 7 dagar i närvaro av 145 ng/ml (166 lfu/ml) stelkramp toxoid. Celler färgas med CD4. Spädning med CFSE visas utan antigen (a-C) och som svar på tetanustoxoidprotein (D-F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: spridning av CFSE-färgade humana CD4+ T-celler som svar på proinsulin C-peptid. Cfse-färgade PBMCs var odlade i 7 dagar i närvaro av 10 μm proinsulin C-peptid. Celler färgas med CD4. Spädning med CFSE visas med hjälp av PBMC från en givare med typ 1-diabetes. CFSE utspädning i ostimulerad PBMCs (A), stelkramp tetanustoxoid Proteinstimulerad (B), och Human proinsulin c-peptid stimulerad pbmcs (c). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: spridning av CFSE-färgade mänskliga CD4 + T-celler som svar på influensa a-virus (H1N1 PR8) Matrix protein 1. PBMCs var CFSE-färgade och odlade i 7 dagar i närvaro av 0,08 μg/mL influensa A-virus Matrix protein 1. Celler färgas med CD4. Spädning av CFSE visas för ostimulerade celler (a), stimulerade celler av tetanustoxoid (B) och influensa a-virus Matrix proteinstimulerad celler (C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antigen | Arbets koncentration |
| Tetanus toxoid protein | 145 ng/mL |
| Influensa A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | 0,08 – 10 μg/mL |
| Proinsulinc-peptid PI33-63 | 10 nM |
Tabell 1: uppräkning av tetanusspecifik CD4+ -proliferation. CDI beräkningar med 5 000 inspelade flöde flödescytometrianalys händelser från ostimulerad och stelkramp-stimulerad mänsklig PBMC.
| Prov | Odelade celler CD4+cfseljust | Uppdelade celler CD4+cfsedim | Antal uppdelade celler CFSEdim/5 000 cfseBright | Medelvärde delade celler CFSEdim/5 000 cfseBright | |
| Nil 1 | 5 004 | 11 | 11 | 12,3 | |
| Nil 2 | 4 995 | 14 | 14 | ||
| Nil 3 | 5 006 | 12 | 12 | ||
| Prov | Odelade celler CD4+cfseljust | Uppdelade celler CD4+cfsedim | Antal uppdelade celler CFSEdim/5000 cfseBright | CDI antal uppdelade celler (tetanus) medelvärde uppdelade celler (Nil) | Medelvärde för CDI |
| Tetanus 1 | 4 930 | 3 258 | 3 304,3 | 268 | 263,7 |
| Tetanus 2 | 4 928 | 3 205 | 3 251,8 | 263,7 | |
| Tetanus 3 | 4 910 | 3 142 | 3 199,6 | 259,5 |
Tabell 2: antigener som används för att simulera CD4+ proliferation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CFSE-baserad spridning är en enkel och robust metod för att upptäcka och räkna upp antigen-specifika humana CD4+ T-celler. Det har tidigare visats att användning av den optimala koncentrationen av CFSE är avgörande för optimala resultat4. För mycket cfse upphäver spridning, medan för lite inte tillåter delade och odelade celler som skall särskiljas. Däremot används relativt höga koncentrationer (5,0 μM) av CFSE för att märka renade murina T-celler3. På grund av variabilitet mellan partier, rekommenderas att varje parti titreras för att bestämma den optimala koncentrationen. Vi använder vår nuvarande sats med en mycket lägre koncentration (10 nM) än i den ursprungliga publikationen (200 nM)4.
En annan viktig aspekt av denna metod är optimering av antigen dosen. Det har varit väl fastställt att T-celler odlade med mindre antigen kan vara känsligare och uppvisar förbättrad funktion. Detta visades ursprungligen i samband med HIV-peptider15. Mängden tetanustoxoid som används i detta protokoll har också optimerats tidigare4 för att framkalla mycket känsliga och PROLIFERATIVA CD4+ T-celler. Intressant, det har visats tidigare att överskott antigen minskar antigen-specifik proliferation15. Därför, för att upptäcka och räkna upp sällsynta T cellpopulationer i perifert blod, optimera både antigen och CFSE koncentration är av yttersta vikt.
Eftersom vi publicerade den första Human Dye utspädnings-baserade assay4, många liknande färgämnen har utvecklats. Vi fann att CD4+ T cell proliferation upptäcktes mindre effektivt när PKH-26, en lipofila färgämne, användes jämfört med cfse (opublicerade). Vi har inte systematiskt testat andra färgämnen på marknaden, så det finns ingen kommentar om deras relativa styrkor. Protokollet för kvantifiering av T-cellsspridning är dock lika tillämpligt på samtliga spridningsanalyser med färgutspädning.
Uttrycka proliferation som ett cell Division index (CDI) innehåller bakgrund spridning i beräkningen av omfattningen av svaren. I våra händer, bakgrunden är oftast låg (t. ex., < 15 händelser/5000 CD4+ cfseBright). Bakgrundproliferation varierar mellan individer och experiment. Med hjälp av ett förhållande (i detta fall, CDI) för att uttrycka styrkan i spridningen är något effektivt för att minska dess inverkan på resultaten. Bakgrunds svar på proteiner i medierna kan vara problematiskt. Det rekommenderas att använda vävnad kultur medier som innehåller humant serum, inte bovint serum, som nötkreatur proteiner kan stimulera en svag bakgrund svar som minskar känsligheten hos analysen. En hög bakgrund spridning har hittats hos personer som har en mild infektion, förmodligen på grund av proliferation som är primade in vivo som svar på infektion. I sådana fall måste analysen upprepas när givaren har rensat infektionen.
Den CFSE-baserade spridnings analysen kan ändras för att effektivt klona humana antigen-specifika CD4+ T-celler direkt från pbmcs12. Till exempel har denna metod använts för att klona CD4+ T-celler som är specifika för insulin12. På senare tid, kloning och funktionella analyser av proinsulin C-peptid-specifika CD4+ T-celler har gett anmärkningsvärd insikt i patogenesen av T1D, särskilt hos patienter med nyligen debuterad T1D13.
Sammanfattningsvis är den CFSE-baserade spridnings analysen både känslig och robust. Den är snabb och tekniskt enkel och kan utföras med färsk eller kryopreserverad PBMC. Förmågan att införliva CFSE i multicolor FACS analys ger ett kvantitativt mått på immunophenotypen av prolifererande T-celler från PBMC som innehåller många celltyper, och denna grad av detaljer är inte möjligt med analyser som utnyttjar DNA-inkorporering såsom [3H]-tymidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av: den juvenila diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Den nationella hälso-och medicinsk forskningrådet (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Australien Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), drift infrastruktur stödprogram av den viktorianska regeringen (S. M., A. D., E. T., M. S.), och NHMRC Doktorandstipendium APP1094337 och JDRF PhD top-up stipendium (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
