Summary
Systeembrede analyse van meerdere biomoleules is cruciaal om functionele en mechanistische inzichten in biologische processen te krijgen. Hierbij wordt een uitgebreid protocol beschreven voor een hoge doorvoer extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster geoogst uit gesynchroniseerde Chlamydomonas-cultuur.
Abstract
Microalgen zijn de focus van onderzoek geweest op hun toepassingen bij de productie van hoogwaardige verbindingen, voedsel en brandstof. Bovendien zijn ze waardevolle fotosynthetische modellen die het inzicht in de elementaire cellulaire processen vergemakkelijken. Systeembrede studies maken uitgebreid en diepgaand inzicht in de moleculaire functies van de organismen mogelijk. Echter, meerdere onafhankelijke monsters en protocollen zijn vereist voor Proteomics, jachtgeweerlipidomics en metabolomica studies introduceren hogere fout en variabiliteit. Hier wordt een robuuste extractiemethode met hoge doorvoer voor de gelijktijdige extractie van chlorofyl, lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster van de groene Alga Chlamydomonas Chlamydomonas gepresenteerd. De geïllustreerde experimentele opstelling is voor Chlamydomonas-culturen gesynchroniseerd met 12 h/12 h licht/donker voorwaarden. Monsters werden verzameld over een 24 h celcyclus om aan te tonen dat de metabolieten, lipiden en zetmeel gegevens verkregen met behulp van verschillende analytische platforms zijn goed conformed. Bovendien werden eiwit monsters die met hetzelfde extractie protocol werden verzameld gebruikt om gedetailleerde proteomica-analyses uit te voeren om hun kwaliteit en reproduceerbaarheid te evalueren. Op basis van de gegevens kan worden afgeleid dat de geïllustreerde methode een robuuste en reproduceerbare benadering biedt om het begrip van verschillende biochemische trajecten en hun functies met meer vertrouwen te vergroten voor zowel fundamenteel als toegepast onderzoek.
Introduction
Microalgen zijn een rijke bron van natuurlijke producten (bijvoorbeeld brandstoffen, menselijke en dierlijke voeding, cosmetica en farmacologische stoffen). Talrijke onderzoeksinspanningen worden uitgevoerd om de efficiëntie van de productie van hoogwaardige producten van microalgen1,2,3,4te verbeteren. Op systemen niveau begrip van metabolisme is een voorwaarde om de kwaliteit en de opbrengst van natuurlijke producten5,6,7te verbeteren. Met de komst van functionele genomische technieken en verbeterde massaspectrometrie methoden, kunnen duizenden genen, transcripten, eiwitten en metabolieten tegelijkertijd worden bewaakt. Echter, meerdere monsters zijn vereist voor diepgaande Proteomics, jachtgeweerlipidomics en metabolomica studies, die vaak moeilijk te bereiken in eencellige organismen, vooral als de tijd cursus studies moeten worden uitgevoerd. Bovendien introduceert de verzameling en verwerking van verschillende monster aliquots in combinatie met verschillende protocollen voor het verzamelen van de zeer complexe omics-gegevens (d.w.z. Proteomic, lipidomic en metabolomics) variabiliteit, waardoor de integratie van gegevens een uitdagende taak.
Chlamydomonas biedt niet alleen een uitstekend microbieel Systeem voor het onderzoek van cellulaire processen, maar ook een handig model om de coördinatie van de celcyclus en het metabolisme te bestuderen. Dienovereenkomstig is een sterke coördinatie van de transcriptsuitdrukking met celcyclus aangetoond met behulp van een hoge resolutie transcriptome profilering van gesynchroniseerde cultuur van Chlamydomonas8. Over 80% van de geanalyseerde transcripten vertoonde een robuuste perioverplaats over een 24 uur celcyclus8. Evenzo bleken drooggewicht, eiwitten, chlorofyl, aminozuren en vetzuren van twee verschillende Chlamydomonas -stammen te correleren met celdeling in een studie waarbij elke 4 h9werd bemonsterd. Onlangs werd gemeld dat de metaboliet en lipide dynamiek van de cel verschuiving op basis van specifieke fasen van de cel cyclus10. De subtiele veranderingen in verschillende biomoleules waren mogelijk om te monitoren met behulp van een robuuste methyl tert-butyl ether (MTBE): methanol: watergebaseerde extractiemethode, die een ideaal uitgangspunt biedt voor uitgebreide multi-omics-analyse10 , 11.
De gepresenteerde protocol gidsen door middel van een reproduceerbare en efficiënte strategie10, voor de gelijktijdige extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster aliquot, voor de tijd verdwenen metabolomic en lipidomische studie van synchrone groei van Chlamydomonas-culturen. Naast het illustreren van de robuuste en reproduceerbare metabole en lipide-gegevens10, hier, de kwaliteit van de Proteomic monsters verkregen uit dezelfde pellet is ook aangetoond.
Protocol
1. pre-culturen van Chlamydomonas Chlamydomonas
- Bereid de pre-culturen van Chlamydomonas Chlamydomonas (stam wild type CC-1690 MT +) door cellen van vaste platen van kraan medium naar Erlenmeyerkolven te verplaatsen met 200 ml HSM medium12.
- Kweek de pre-culturen op een hiervoor Shaker bij 24 °c bij 100 μmoles · m-2· s-1 continu licht tot de celdichtheid ~ 2 x 106 cellen/ml bereikt.
2. synchronisatie van Chlamydomonas vloeibare culturen in fermentoren
Opmerking: de parameters die in dit protocol worden weergegeven, zoals temperatuur, licht en CO2, zijn specifiek voor de synchronisatie van de stam CC-1690 mt +. Om een gesynchroniseerde cultuur te ontwikkelen met behulp van een andere stam, is het noodzakelijk om de optimale omstandigheden te testen.
- Breng de voor cultuur over naar een Ferment systeem (Zie aanvullend figuur 1 voor het op maat gemaakte Fermenter ontwerp), aangesloten op een Recirculerende koeler om de temperatuur te handhaven, met borrelen van gefilterde co2 (2%, v/v) en geroerd met een magnetische roerstaaf aan de onderkant van de Fermenter met constante opwinding.
- Om de synchronisatie te initiëren, stelt u de Ferment bij licht-donker regime van 12:12 u, onder 34 °C en 200 μmoles · m-2· s-1 licht en zorg ervoor dat het bevat 500 ml cultuur in HSM-medium met een celdichtheid van 1 x 106 cellen/ml.
- Aan het einde van 24 uur cyclus, de cultuur opnieuw verdunnen naar 1 x 106 cellen/ml met verse HSM-medium met minimale perturbatie met behulp van een buis systeem in combinatie met peristaltische pompen, die het mogelijk maakt om eerst een aparte hoeveelheid cultuur uit te pompen en daarna pomp in door autoclaaf gesteriliseerd medium.
Opmerking: als alternatief voor peristaltische pompen kunnen inoculerende spuiten worden gebruikt om de cultuur op te trekken, terwijl het vereiste volume van vers medium direct in de Fermenter kan worden toegevoegd onder steriele omstandigheden. - Herhaal stap 2,3 drie keer om de gesynchroniseerde culturen te verkrijgen op 4e dag van inoculatie.
- Om Synchrony van cellen te valideren, oogst monsters met een interval van elke 2 h en meet de celdichtheid en het celvolume met behulp van een celteller en grootte Analyzer (Zie tabel met materialen). Verdun, afhankelijk van de celdichtheid, de monsters tussen 1:10 en 1:100 en meet in een groottebereik van 30 – 1900 μm3.
3. het oogsten van Chlamydomonas-cellen
- Label 15 mL conische centrifugebuizen en maak een Dewar gevuld met vloeibare stikstof.
- Oogst monsters met een spuit (50 cm3) door de binnenste glazen buis van het Ferment. Verdeel het monster in conische centrifugebuizen die 10-15 x 106 cellen moeten bevatten. Noteer het volume dat naar elke buis wordt overgebracht en meet de celdichtheid en de celgrootte van elk tijdspunt met behulp van de teller en de grootte Analyzer (Zie tabel met materialen)
- Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min bij 4000 x g. Gooi vervolgens het supernatant weg, Vries de pellets in vloeibare stikstof en bewaar later bij-80 °C.
4. bereiding van extractie buffers en extractie chlorofyl, lipiden en metabolieten
Let op: methanol (MeOH) en MTBE zijn ontvlambaar en kunnen irritatie van de luchtwegen, het oog of de huid veroorzaken bij langdurige blootstelling en/of contact. Behandel ze voorzichtig alleen in een rook afzuigkap en gebruik de juiste veiligheidsprocedures tijdens de extractie (Labcoat, veiligheidsbril, handschoenen, enz.).
-
Extractie buffer 1
- Voeg in een maatkolf van 100 mL 75 mL MTBE, 25 mL MeOH (UHPLC-kwaliteit) toe en homogeniseren (3:1, vol/vol).
- Voeg de volgende oplossing voor interne standaarden toe: 50 μL corticosteron (1 mg/mL in MeOH), 50 μL 1, 2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (17:0 PC) (1 mg/mL in chloroform HPLC-kwaliteit), 25 μL ampicilineen (1 mg/mL in water UHPLC-kwaliteit) en 50 μL D-Sorbitol-1-13C (1 mg/mL in water UHPLC-kwaliteit).
- Breng de extractiebuffer over naar een schone glazen fles en pre-cool de oplossing bij-20 °C, 1 uur voor gebruik. Gebruik vers bereide oplossing voor de extracties. Deze oplossing kan gedurende maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
-
Extractie buffer 2
- Voeg in een maatkolf van 100 mL 75 mL water UHPLC-kwaliteit en 25 mL MeOH UHPLC-kwaliteit toe en homogeniseren.
- Breng de extractiebuffer over naar een schone glazen fles. Gebruik verse oplossing voor de extracties. Deze oplossing kan gedurende enkele weken bij kamertemperatuur worden bewaard.
5. extractie van chlorofyl, lipiden en metabolieten
- Regel de buizen, met de celpellet (bevattende 10-15 x 106 cellen), in vloeibare stikstof.
- Respendeer de celpellet in elke buis met 1 mL voorgekoelde (-20 °C) extractie buffer 1.
Opmerking: Voer deze stap snel uit om verdamping van de extractiebuffer met lage viscositeit te voorkomen. Na toevoeging van de extractie buffer 1, handhaaf de buisjes bij kamertemperatuur. - Vortex totdat de cellen goed zijn gehomogeniseerd binnen het extractiemengsel en het mengsel in 2 mL micro centrifugebuis.
- Soniceren de culturen met behulp van sonicatiebad (Zie tabel met materialen) in ijsgekoeld water gedurende 10 minuten.
- Inincuberen alle monsters op een rondschudapparaat bij 1000 rpm gedurende 60 min bij 4 °C.
- Voeg 650 μL extractie buffer 2 toe om de fasescheiding te induceren.
- Vortex kort gevolgd door centrifugeren bij 20000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
Opmerking: na deze stap is er een scheiding van vloeibare fasen en een vaste pellet in de bodem van de buis. Behandel de buizen voorzichtig om te voorkomen dat de twee vloeistof fasen worden gemengd. De bovenste MTBE-fase bevat lipiden en chlorofyl, terwijl de onderste fase de polaire en semi-polaire metabolieten bevat. De geprecipiteerde pellet op de bodem bevat eiwitten, zetmeel en andere onoplosbare moleculen.
6. de fracties aliquoteren
- Breng 500 μL bovenste MTBE-fase (lipiden) over in een gelabelde buis van 1,5 mL. Droog de monsters met behulp van een vacuümconcentrator (Zie tabel met materialen) en bewaar bij-80 °c tot de meting is uitgevoerd.
- Verwijder de resterende MTBE-fase met een pipet van 200 μL.
- Breng 650 μL van de onderste fase (polaire en semi-polaire metabolieten) over naar een nieuwe gelabelde buis. Droog de monsters met behulp van een vacuümconcentrator (Zie tabel met materialen) en bewaar bij-80 °c tot de meting is uitgevoerd.
- Verwijder de resterende onderste fase door het overtollige volume te pipetteren.
- Vries de vaste pellet in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °C tot verdere extractie.
7. bepaling van polaire metabolieten (primaire metabolieten)
- Rebreng de gedroogde pellet van de polaire fase (stap 6,3) in methoxyamine-hydrochloride/pyridine oplossing voor methoxymisering van carbonylgroepen.
- Verwarm de monsters bij 37 °C gedurende 90 min.
- Derivatiseer de monsters met N-methyl-N-trimethylsilyltrifloracetamide (MSTFA) gedurende 30 minuten bij 37 °C, zoals eerder beschreven13.
- Gebruik gaschromatografie gekoppeld aan de time-of-flight massaspectrometrie (GC-TOF-MS) om de primaire metabolieten te analyseren. De gebruikte gradiënt parameters waren volgens het eerder beschreven protocol14.
8. bepaling van niet-polaire metabolieten (lipiden)
- Resuspendeer de gedroogde pellet van de niet-polaire fase (stap 6,1) in een mengsel van acetonitril: isopropanol (7:3, v:v).
- Centrifugeer bij 20000 x g en scheid op een omgekeerde fase C8-kolom (100 mm × 2,1 mm × 1,7 μm deeltjes) met behulp van een UPLC-systeem (Zie tabel met materialen). De twee mobiele fasen waren water met 1% 1 M ammoniumacetaat, 0,1% azijnzuur (buffer A) en acetonitril: isopropanol (7:3) met 1% 1 M ammoniumacetaat, 0,1% azijnzuur (buffer B).
- Gebruik de verloop parameters volgens het eerder beschreven protocol14.
9. bepaling van het chlorofylgehalte
- Meng 100 μL van de MTBE-fase (stap 6,1) met 900 μL 90% methanol voor een methode blanco en de experimentele monsters.
- Meet de extinctie met spectrofotometer bij een golflengte van 665 nm en 652 nm om een onderscheid te maken tussen chlorofyl a en chlorofyl b.
Opmerking: de absorptie moet variëren tussen 0,1 en 1 voor een geldige concentratie berekening. Verdun de monsters indien nodig. - Bereken het gehalte aan chlorofyl a en b, en ook het totale chlorofylgehalte volgens de volgende formules.
CHLa = 16.82 a665 – 9.28 a652
CHLb = 36.92 a652 – 16.54 a665
CHLa = b = 0.28 a665 + 27.64 a652
Opmerking: de formules werden beschreven door Bar-Nun en Ohad15.
10. extractie en bepaling van het eiwitgehalte, spijsvertering en analyse
Opmerking: om het eiwit te hervatten, werd pellet ureum/thiourea buffer (6 M ureum, 2 M thioureaand protease en fosfatase remmers) gebruikt met wijzigingen in het protocol eerder beschreven16. Echter, elke buffer van keuze kan worden gebruikt voor het resuspensie van eiwitten.
- Bereid de eiwit buffer met behulp van de volgende concentraties: 6 M ureum en 2 M thiourea.
- Los de pellet (stap 6,5) op in 200 μL eiwit buffer (10,1).
- Inbroed de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door centrifugeren bij 20000 x g gedurende 5 minuten.
- Breng het supernatant, dat de eiwitten bevat, over naar een nieuwe buis.
- Bepaal de eiwitconcentratie door Bradford assay17.
- Digest 50 μg eiwit in-oplossing met een protocol naar keuze. Hier gebruikt u het volgende protocol.
- Reduceer 50 μg eiwit monsters met 5 mM DTT gedurende 30 minuten, gevolgd door alkylatie met 10 mM iodoacetamide gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg trypsine/Lys-C mix toe aan een 25:1 proteïne: protease ratio (w/w), meng en inbroed voor 3 uur bij 37 °C.
- Verdun de monsters zes plooien met behulp van 50 mM TrisHCl (pH 8) en Inincuberen bij een nacht bij 37 °C.
- Beëindig de spijsvertering door trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,5 – 1%.
- Na de spijsvertering, uitvoeren ontziltings van de peptiden voorafgaand aan massaspectrometrie met behulp van C18 stage tips en elueer de verteerde peptiden18.
- Concentreer de monsters tot in de buurt van droogheid en laat 2-5 μL oplossing in een vacuümconcentrator (Zie tabel van materialen) zonder verwarming.
- Respendeer de monsters in laad buffer (5% acetonitril, 0,5% mierenzuur) en analyseer de peptide mengsels met LC-MS/MS met behulp van een hoge-resolutie massaspectrometer (Zie tabel met materialen) die is aangesloten op een nano-UPLC-systeem.
- Scheid de peptiden met behulp van UPLC systeem (Zie tabel van de materialen) op een 20 cm omgekeerde fase geladen oppervlak hybride (csh) kolom (Zie tabel van de materialen) met een inwendige diameter van 75 μm en een deeltjesgrootte van 1,7 μm.
- Laad 4 μL monster en loop door 90 min. gradiënt bij een debiet van 300 nL/min.
- Stel het verloop in. Gebruik gedeeltelijke loop-offline-instellingen met isocratische gradiënt ingesteld op 3% van buffer B (99,9% acetonitril + 0,1% mierenzuur) gedurende 14 minuten voordat de lus wordt verschoven naar de online positie met de kolom, daarna wordt het verloop lineair verhoogd voor 50 min, tot 20% buffer B is bereikt.
- Verhoog de concentratie van buffer B in de volgende 15 min tot 30%. Vervolgens in de volgende 15 min, verhoging van de buffer B tot 40%, vóór het bereiken van 90% van buffer B na nog eens 4 min. Voer de wasstap uit, die nodig is om de kolom schoon te maken, bij 400 nL/min en houd gedurende 10 minuten extra vast (Zie tabel 1 voor een gedetailleerd verloop voorwaarden).
- Tot slot, zet het systeem terug op een debiet van 300 nL/min en een concentratie van 3% buffer B binnen 1 min. Equilibrate de kolom gedurende 15 minuten voordat het volgende monster wordt geïnjecteerd.
Opmerking: een volledige lijst van geïdentificeerde eiwitten na LCMS/MS-analyse wordt weergegeven in tabel 2.
11. extractie en bepaling van het zetmeelgehalte
Opmerking: voor de bepaling van het totale gehalte aan eiwitten en zetmeel werd de vaste pellet geëxtraheerd in een tweestapsprocedure zoals eerder beschreven10.
- Voeg 500 μL 80% (v/v) ethanol toe aan de celpellet (stap 6,5) en inincuberen gedurende 10 min bij 80 °C.
- Centrifugeer op 4000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Los vervolgens de pellet op in 250 μL steriel water, gevolgd door toevoeging van 250 μL van 100 mM Natriumacetaat.
- Hydrolyseer het zetmeel door te verwarmen voor 3 uur bij 99 °C. Verteren het opgeloste zetmeel 's nachts in glucose monomeren door een enzym mengsel van α-amylase (4,2 eenheden per monster) en α-Amyloglucosidase (10 eenheden per monster) toe te voegen. Incuberen de buisjes bij 37 °C 's nachts.
Opmerking: Na incubatie kunnen monsters gedurende enkele dagen bij-20 °C worden bevroren, of gedurende enkele maanden bij-80 °C, voorafgaand aan glucosemetingen. - Centrifugeer het verteerde extract bij 20000 x g gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant. Los het supernatant (met zetmeel afkomstige glucose monomeren) op in 100 mM HEPES-buffer (pH 7) die 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP en glucose-6-fosfaat-dehydrogenase bevat (1 eenheid per monster).
- Om het zetmeelgehalte te analyseren, meet u eerst de baseline extinctie bij 340 nm. Voeg vervolgens hexokinase (1 eenheid per monster) toe om de reactie te starten. Tot slot meet de toename van NADPH + H+ (vermelding van het niveau van zetmeel verteerd aan glucose) bij 340 nm met een 96-goed plaat lezer.
Opmerking: het verschil van de maximale waarde bij 340 nm (mag niet hoger zijn dan het lineaire bereik van 1) en de baseline is equivalent aan de glucoseconcentratie van het verteerde zetmeel. Er moet een glucose curve worden gemaakt om de glucoseconcentratie in nmol van glucose per mL te bepalen.
Representative Results
Chlamydomonas Chlamydomonas CC-1690 cultuur synchronisatie
Om de representatieve resultaten voor het gegeven protocol aan te tonen, presenteren wij het voorbeeld multi-omics gegevens verkregen na het oogsten en extractie van monsters van gesynchroniseerde Chlamydomonas Chlamydomonas culturen10. Gesynchroniseerde culturen van Chlamydomonas bestaan uit cellen die tot een uniforme groeifase behoren op een bepaald tijdstip. De Chlamydomonas-culturen werden gesynchroniseerd bij 12 h/12 h licht/donker cyclus, 34 °C met de lichtintensiteit van 200 μmol · m-2· s-1 en de co2 -concentratie of2%, v/v, beschreven als optimale concentratie voor stam CC-1690 MT +10 . Deze voorwaarden waren eerder geoptimaliseerd en gevalideerd met behulp van verschillende celcyclus parameters10. In Figuur 1 wordt de verdeling van de celgrootte gemeten met de Coulter-teller op verschillende tijdstippen van gesynchroniseerde culturen weergegeven. Een verschuiving in het celvolume kan worden waargenomen naarmate de cellen in de gehele licht fase toenemen, gevolgd door het vrijkomen van dochtercellen vanaf het einde van de licht fase vanaf 10 uur. Zodra alle dochtercellen zijn vrijgegeven, kan verschuiving in het celvolume worden waargenomen, omdat de nieuw uitgebrachte dochtercellen zijn verwijderd om de volgende cyclus 10 te beginnen (Figuur 1).
Monster-oogsten,-hanteren en-extractie
Snel oogsten van monsters wordt uitgevoerd met behulp van centrifugeren en na het verwijderen van de supernatant, de pellets kunnen worden opgeslagen bij-80 °C tot extractie. Zoals hierboven beschreven (stap 5), resulteert MTBE extractie in drie verschillende fasen: a) organische fase werd gebruikt voor het meten van lipiden en chlorofyl-niveaus (normalisatie factor), b) polaire fase werd verzameld om metabolieten op GCMS te meten terwijl, c) de pellet werd gebruikt om zetmeelgehalte en eiwitten te meten. Een overzicht van de verdeling van de verschillende fases en hun tewerkstelling wordt geïllustreerd in Figuur 2.
Polaire en niet-polaire metabolieten
Op basis van de GCMS-analyse van de pool fractie werden 65 metabolieten geannoleerd, met betrekking tot aminozuren, nucleïnezuren, tussen producten van glycolyse, gluconeogenese, tricarboxylzuurcyclus, pentose fosfaat pathway en polyaminen (Figuur 3a). De LCM'S analyse van neutrale fase met lipiden leidde tot de identificatie van 204 verschillende lipide soorten die betrekking hebben op verschillende lipide klassen namelijk dunlaag, Phosphatidylethanolamine, sulfoquinovosyl diacylglycerolen, monogalactosyldiacylglycerolen, digalactosyldiacylglycerolen, diacylglyceryltrimethylhomoserine, vetzuren, diacylglyceriden en triacylglyceriden. Om de wereldwijde verschuivingen in de metabolieten en lipiden in de celcyclus te visualiseren, werd Principal component Analysis (PCA) gebruikt. De PCA geeft een scheiding van lichte en donkere fasen voor zowel metabolomica en lipidomische gegevens. Bovendien kan voor beide gegevens een semi-cyclische (deels open cirkel) worden opgemerkt (figuur 3c, D). De partiële kloof in het cirkelvormig patroon wordt toegeschreven aan het feit dat de monsters bij 24 h van de celcyclus in het donker werden opgevangen in tegenstelling tot de monsters die werden verzameld in het begin van de celcyclus na 0,25 h van blootstelling aan het licht (figuur 3c , D).
Analyse van eiwitten en zetmeel
Om de kwaliteit van de eiwit pellet verkregen als gevolg van MTBE extractie te onderzoeken, werden 6 monsters gebruikt voor Proteomic-analyse. De kwaliteit van de gegevens van de proteomica verkregen door het verteerd van 50 μg eiwit/monster, werd onderzocht met behulp van een computationele kwaliteitscontrole tool-proteomica Quality Control (ptxqc)19, wat duidt op reproduceerbare en hoge kwaliteit van de gegevens van proteomica verkregen uit alle replicaten (aanvullend figuur 1). De moleculaire functionele dekking van eiwitten werd onderzocht met REVIGO20. Een overzicht van de functionele verrijking van de 2463 geïdentificeerde eiwitten (Zie tabel 2), wordt weergegeven in figuur 4a. De overblijvende pellet na EiwitExtractie werd gebruikt voor reproduceerbare kwantificering van zetmeel, zoals aangegeven door een lage standaarddeviatie tussen verschillende replicaten (figuur 4b).
Figuur 1: illustratief voorbeeld van de veranderingen in het celvolume over verschillende fasen van de celcyclus in Chlamydomonas Chlamydomonas. De x-as die het celvolume weergeeft terwijl de y-as het celgetal vertegenwoordigt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: geïllustreerde workflow voor de tewerkstelling van verschillende fasen tijdens multi-omics extractie cellen pellets. Het cijfer is hergebruikt door Juppner, J.et al. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatief voorbeeld van metabolieten en lipiden geïdentificeerd met behulp van het beschreven protocol. A) door de GCMS-analyse geïdentificeerde metaboliet klassen. B) lipide-soorten die behoren tot verschillende klassen geïdentificeerd door de lcms-analyse. C) principe component analyse van de metaboliet niveaus gedurende 24 uur celcyclus. D) principe component analyse van de lipiden gedurende 24 h celcyclus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatief voorbeeld van de eiwit-en zetmeel gegevens. A) moleculaire functionele verrijking van de eiwitten geïdentificeerd met behulp van LCMS-analyse, Treemap getekend met REVIGO 20 B) representatieve zetmeel gegevens die de reproduceerbaarheid van het protocol weergeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: aangepast ontwerp van het Fermenter systeem voor de temperatuur en beluchting gecontroleerde synchrone groei van Chlamydomonas culturen. Het cijfer is hergebruikt door Juppner, J.et al. 10. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend figuur 2: representatieve uitkomst voor de kwaliteit van proteomica. Heatmap uitgezet met behulp van Computational PTXQC tool19. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Tijd (min) | % Buffer B naar buffer A | |
| 0 tot 15 min | Lineair verloop van 0 TD 3% | Buffer A: 0,1% mierenzuur in UPLC-kwaliteit water |
| 15 tot 75 min | Lineair verloop van 3% tot 30% | Buffer B: 0,1% mierenzuur in 60% UPLC-kwaliteit acetonitril |
| 75 tot 90 min | Lineair verloop van 30% tot 40% | Debiet 300 nL/min |
| 90 tot 94 min | Lineair verloop van 40% tot 90% | Injectievolume 4 μL |
| 94 to104 min | waskolom met 90% | |
| 105 tot 120 min | De kolom 15 minuten op 3% evenwichts veld |
Tabel 1: vloeistofchromatografie van peptide monsters, gradiënt parameters.
Tabel 2: lijst van eiwitten die zijn geïdentificeerd na LCMS/MS-analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
In dit artikel, we geïllustreerd een robuuste en zeer toepasselijk extractie protocol voor uitgebreide lipidomics, metabolomics, zetmeel en proteomica analyse uit een enkele pellet van 10-15 x 106 cellen. De methode is met succes geïmplementeerd in verschillende studies voor een breed scala van cellen en weefsels10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Hier presenteerden we een stapsgewijze pipeline voor multi-omics analyse van verschillende biomoleules uit een enkel monster geoogst uit Chlamydomonas Chlamydomonas (CC-1690 MT +) cultuur.
Het protocol biedt een robuuste en reproduceerbare benadering om meerdere monsters tegelijk te verwerken, voor de analyse van verschillende biomoleules. Echter, een aantal kritische stappen moeten worden verzorgd om de technische variatie te minimaliseren. Ten eerste moet het oogsten van de cellen zo snel mogelijk plaatsvinden, terwijl de uniforme voorwaarden voor alle geoogste monsters gehandhaafd blijven om de biologische toestand van de cellen te behouden. Hoewel we centrifugeren gebruikten om de cellen te oogsten, kunnen alternatieve oogst strategieën worden gebruikt voor het oogsten van de monsters. Echter, het is belangrijk op te merken dat verschillende oogst strategieën zijn gekend om invloed op de metabole toestand van de cellen37 vandaar, consistente oogst aanpak moet worden gebruikt voor alle experimentele monsters. Ten tweede is het belangrijk om te voorkomen dat de bovenste niet-polaire fase met chlorofyl wordt gedroogd, omdat dit de niveaus van opgeloste chlorofyl in het oplosmiddel dat de normalisatie factor voor de monsters beïnvloedt, kan beïnvloeden. Tot slot moet er voorzichtig worden opgetreden bij het verwijderen van de resterende polaire fase om de proteïne-en zetmeel korrel te verkrijgen, om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord die het zetmeel-en eiwitgehalte kan beïnvloeden.
Aldus gepresenteerd extractie protocol biedt verschillende voordelen voor Multiple-omics data-analyse. Naast het minimaliseren van het aantal benodigde monster aliquots, vermindert het ook de variatie tussen de analytische resultaten die voor verschillende biomoleules zijn verkregen. Dit maakt een directe vergelijking mogelijk van de resultaten verkregen uit de primaire metabolieten, lipiden en proteomische gegevens. Op dezelfde manier kan de gelijktijdige extractie van meerdere samengestelde klassen consistente en uniforme normalisatie strategie van de verschillende gegevenssets. Dit is met name van toepassing als normalisatie moeilijk te bereiken is met behulp van droog of vers gewicht38 of celnummer.
Het protocol kan worden uitgevoerd voor de routine screening van een complex biologisch monster. Deze holistische metabolomic, lipidomic en Proteomic datasets kunnen uitgebreide informatie bieden over systematische veranderingen in het metabolisme. Bovendien geeft de gegevens verkregen uit de proteomica-analyse inzicht in de kwantitatieve (overvloed) en kwalitatieve (modificaties) veranderingen in eiwitten ten opzichte van de metabolieten. Het integreren van omics-gegevens zou dus diepgaande informatie kunnen onthullen over veranderingen die worden veroorzaakt door genetische of biotische en/of abiotische verstoringen van een biologisch systeem. Dus, verhelderende moleculaire veranderingen van specifieke metabole trajecten of cellulaire processen. Op dezelfde manier kunnen deze gegevens met hoge doorvoer identificatie van doelen voor de metabole engineering en verfijnen of testen van voorspellingen van genoom schaal metabolische modellen37,39.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatie.
Acknowledgments
Wij zijn Gudrun Wolter en Änne Michaelis zeer erkentelijk voor de uitstekende technische assistentie. We willen alle leden van het Giavalisco Lab bedanken voor hun hulp. We zijn de Max Planck Society dankbaar voor de financiering van het onderzoek en FAPESP voor het Fellowship of L A Giraldi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
- Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
- Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
- Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
- Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).
- Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).
- Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
- Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
- Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
- Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
- Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).
- Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800 (2011).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).
- Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
- Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
