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Developmental Biology

ग्रीन Alga Chlamydomonas reinhardtii के सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों के इन-डेप्थ विश्लेषण के लिए एक मल्टी-ओमिक्स निष्कर्षण विधि

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59547
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Max Planck Institute of Biology of Ageing

Summary

जैविक प्रक्रियाओं में कार्यात्मक और मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए कई जैव अणुओं का सिस्टम-व्यापी विश्लेषण महत्वपूर्ण है। इसके द्वारा, एक व्यापक प्रोटोकॉल सिंक्रनाइज़ Chlamydomonas संस्कृति से काटा एक एकल नमूना से लिपिड, चयापचयों, प्रोटीन और स्टार्च के उच्च थ्रूपुट निष्कर्षण के लिए वर्णित है।

Abstract

Microalgae उच्च मूल्य यौगिकों, भोजन और ईंधन के उत्पादन में अपने अनुप्रयोगों के लिए अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है. इसके अलावा, वे मूल्यवान प्रकाश संश्लेषण मॉडल बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ को सुविधाजनक बना रहे हैं. प्रणाली व्यापक अध्ययन जीवों के आणविक कार्यों की व्यापक और गहन समझ सक्षम. हालांकि, कई स्वतंत्र नमूने और प्रोटोकॉल proteomics के लिए आवश्यक हैं, लिपिडोमिक्स और metabolmics उच्च त्रुटि और परिवर्तनशीलता शुरू अध्ययन. हरे alga Lamydomonas reinhardtii के एक नमूने से क्लोरोफिल, लिपिड, चयापचयों, प्रोटीन और स्टार्च के एक साथ निष्कर्षण के लिए एक मजबूत उच्च थ्रूपुट निष्कर्षण विधि यहाँ प्रस्तुत किया जाता है। सचित्र प्रयोगात्मक सेटअप 12 h/12 h प्रकाश / नमूने एक 24 एच सेल चक्र पर एकत्र करने के लिए प्रदर्शित करता है कि चयापचयों, लिपिड और स्टार्च डेटा विभिन्न विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों का उपयोग कर प्राप्त अच्छी तरह से अनुरूप हैं. इसके अलावा, एक ही निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकत्र प्रोटीन नमूने उनकी गुणवत्ता और reproducibility का मूल्यांकन करने के लिए विस्तृत proteomics विश्लेषण का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. आंकड़ों के आधार पर, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि सचित्र विधि बुनियादी और लागू अनुसंधान दोनों के लिए अधिक से अधिक विश्वास के साथ विभिन्न जैव रासायनिक रास्ते और उनके कार्यों की समझ अग्रिम करने के लिए एक मजबूत और पुन: उत्पादनीय दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

Microalgae प्राकृतिक उत्पादों (उदा., ईंधन, मानव और पशु पोषण, सौंदर्य प्रसाधन और औषधीय पदार्थ) का एक समृद्ध स्रोत हैं। सूक्ष्म शैवाल1,2,3,4से उच्च मूल्य के उत्पादों के उत्पादन की दक्षता बढ़ाने के लिए अनेक अनुसंधान प्रयास किए जाते हैं . चयापचय की प्रणाली-स्तर की समझ प्राकृतिक उत्पादों की गुणवत्ता और उपज में सुधार करने के लिए एक पूर्व-आवश्यकता है5,6,7. कार्यात्मक जीनोमिक तकनीकों और बेहतर मास स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों के आगमन के साथ, जीन के हजारों, प्रतिलिपि, प्रोटीन, और चयापचयों एक साथ नजर रखी जा सकती है. हालांकि, कई नमूनों में गहराई से proteomics, लिपिडोमिक्स और metabolomics अध्ययन के लिए आवश्यक हैं, जो अक्सर एककोशिक ीय जीवों में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, खासकर अगर समय पाठ्यक्रम अध्ययन किया जा रहे हैं. इसके अलावा, संग्रह और विभिन्न प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में विभिन्न नमूना alicots के प्रसंस्करण के लिए अत्यधिक जटिल omics डेटा इकट्ठा करने के लिए (यानी, proteomic, lipidomic, और metabolomics) परिवर्तनशीलता का परिचय, इस प्रकार डेटा के एकीकरण एक बनाने चुनौतीपूर्ण कार्य.

क्लैमाइडोमोनास सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए न केवल एक उत्कृष्ट माइक्रोबियल प्रणाली प्रदान करता है, बल्कि सेल चक्र और चयापचय के समन्वय का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक मॉडल भी प्रदान करता है। तदनुसार, सेल चक्र के साथ प्रतिलिपि अभिव्यक्ति का एक मजबूत समन्वय Chlamydomonas8के सिंक्रनाइज़ संस्कृति के उच्च संकल्प transcriptome रूपरेखा का उपयोग कर दिखाया गया है. विश्लेषित प्रतिलिपिके लगभग 80% ने 24 एच सेल चक्र8में मजबूत आवधिकता का प्रदर्शन किया . इसी तरह, शुष्क वजन, प्रोटीन, क्लोरोफिल, एमिनो एसिड और क्लैमाइडोमोना के दो अलग अलग उपभेदों के फैटी एसिड एक अध्ययन में सेल विभाजन के साथ सहसंबंधित करने के लिए दिखाया गया था जहां नमूना हर 4 एच9प्रदर्शन किया गया था। हाल ही में, यह बताया गया था कि सेल चक्र10के विशिष्ट चरणों के आधार पर सेल शिफ्ट की मेटाबोलाइट और लिपिड गतिशीलता । विभिन्न जैव अणुओं में सूक्ष्म परिवर्तन एक मजबूत मिथाइल tertका उपयोग कर निगरानी करने के लिए संभव थे -butyl ईथर (MTBE): मेथनॉल: पानी आधारित निष्कर्षण विधि, जो व्यापक बहु-ओमिक्स विश्लेषण के लिए एक आदर्श प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है10 , 11|

प्रस्तुत प्रोटोकॉल गाइड एक reproduible और कुशल रणनीति के माध्यम से10, लिपिड के एक साथ निष्कर्षण के लिए, चयापचयों, प्रोटीन और स्टार्च एक एकल नमूना alicot से, समय के लिए हल metabolomic और लिपिडोमिक अध्ययन के लिए तुल्यकालिक बढ़ रही क्लैमाइडोमोनास संस्कृतियों. मजबूत और reproduible चयापचय और लिपिडोमिक डेटा उदाहरण के अलावा10,यहाँ, एक ही गोली से प्राप्त proteomic नमूनों की गुणवत्ता भी प्रदर्शन किया है.

Protocol

1. क्लैमिडोमोनास रेनहार्ड्टी की पूर्व-संस्कृति

  1. क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटीई (तनाव जंगली प्रकार सीसी-1690 मीटर+) की पूर्व-संस्कृति को एचएसएम मध्यम12के 200 एमएल के साथ एर्लेनमेयर फ्लास्क में टैप मीडियम की ठोस प्लेटों से कोशिकाओं को स्थानांतरित करके तैयार करें।
  2. एक घूर्णनी शेकर पर पूर्व-संस्कृतियों को 100 डिग्री सेल्सियसपर बढ़ाएँ जब तक कोशिका घनत्व तक नहीं पहुंच जाता तब तक 100 डिग्री सेल्सियस -2 [s-1 सतत प्रकाश ] 2 x 106 कोशिकाओं/

2. fermenters में क्लैमाइडोमोनास तरल संस्कृतियों का तुल्यकालन

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत पैरामीटर, जैसे तापमान, प्रकाश और CO2,तनाव CC-1690 mt + के तुल्यकालन के लिए विशिष्ट हैं। आदेश में एक और तनाव का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ संस्कृति विकसित करने के लिए, यह इष्टतम स्थितियों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है।

  1. एक fermenter प्रणाली के लिए पूर्व संस्कृति स्थानांतरण (कस्टम बनाया fermenter डिजाइन के लिए पूरक चित्रा 1 देखें), एक recirculating कूलर से जुड़े तापमान को बनाए रखने के लिए, फ़िल्टर किए गए सीओ2 (2%, v/v) के bubbling के साथ और एक के साथ हलचल लगातार आंदोलन के साथ fermenter के तल पर चुंबकीय हलचल बार.
  2. तुल्यकालन आरंभ करने के लिए, 34 डिग्री सेल्सियस और 200 डिग्री सेल्सियस-2के तहत 12:12 एच के प्रकाश-अंधेरे शासन में fermenter सेट और यह सुनिश्चित करें कि यह 1 x 106 कोशिकाओं /
  3. 24 एच चक्र के अंत में, re-dilute करने के लिए संस्कृति 1 x 106 कोशिकाओं / ऑटोक्लेव-स्टरलाइज्ड माध्यम।
    नोट: peristaltic पंपों के लिए एक वैकल्पिक के रूप में, inoculating सिरिंजों संस्कृति को वापस लेने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि ताजा माध्यम की आवश्यक मात्रा बाँझ शर्तों के तहत fermenter में सीधे जोड़ा जा सकता है.
  4. टीका के 4वें दिन सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए चरण 2.3 तीन बार दोहराएँ।
  5. कोशिकाओं के तुल्यकालन को मान्य करने के लिए, प्रत्येक 2 ज के अंतराल पर फसल के नमूने और सेल काउंटर और आकार विश्लेषक का उपयोग करके सेल घनत्व और सेल वॉल्यूम को मापें (सामग्री की तालिकादेखें)। कोशिका घनत्व के आधार पर, 1:10 से 1:100 के बीच नमूनों को पतला करें और 30 - 1900 उ3की आकार सीमा में मापें।

3. हार्वेस्टिंग क्लैमाइडोमोनास सेल

  1. 15 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूबों को लेबल करें और तरल नाइट्रोजन से भरा एक देवर तैयार करें।
  2. किण्वित की भीतरीकांच की ट्यूब के माध्यम से सीरिंज (50 सेमी 3) का उपयोग करके फसल के नमूने। शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूबों में नमूने वितरित करें जिसमें 10-15 x 106 कोशिकाएं होनी चाहिए। प्रत्येक ट्यूब को स्थानांतरित मात्रा नोट करें और सेल घनत्व और सेल काउंटर और आकार विश्लेषक का उपयोग कर प्रत्येक समय बिंदु के सेल आकार को मापने (सामग्री की तालिकादेखें )
  3. 4000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें . फिर सुपरनेंट को त्याग दें, छर्रों को तरल नाइट्रोजन में स्थिर करें और बाद में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. निष्कर्षण बफ़र्स और निष्कर्षण क्लोरोफिल, लिपिड और चयापचयों की तैयारी

चेतावनी: मेथेनोल (MeOH) और MTBE ज्वलनशील हैं और लंबे समय तक जोखिम और / कृपया उन्हें ध्यान से केवल एक धूआं हुड में संभाल और निष्कर्षण के दौरान उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें (लैब कोट, सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, आदि).

  1. निष्कर्षण बफ़र 1
    1. 100 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में, एमटीबीई के 75 एमएल, 25 एमएल एमओएच (यूएचपीएलसी ग्रेड) और समरूप (3:1, vol/
    2. निम्नलिखित आंतरिक मानकों के समाधान जोड़ें: 50 $L corticosterone (1 mg/mL MeOH में), 50 $L 1,2-diheptadecanoyl-SN-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलीन (17:0 पीसी) (1 mg/mL in chloroform H grade), 25 डिग्री एल एम्पीसिलिन के एपिकिलिन (1 mg/ डी-Sorbitol-1-13C (1 मिलीग्राम /
    3. निकासी बफर को एक साफ कांच की बोतल में स्थानांतरित करें और उपयोग करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस, 1 एच पर समाधान को पूर्व-कूल करें। निकासी के लिए ताजा तैयार समाधान का प्रयोग करें। यह समाधान 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. निष्कर्षण बफ़र 2
    1. एक 100 एमएल volumetric फ्लास्क में, पानी के 75 एमएल UHPLC ग्रेड और MeOH UHPLC ग्रेड के 25 एमएल जोड़ें और homogenize.
    2. एक साफ कांच की बोतल के लिए निष्कर्षण बफर स्थानांतरण। extractions के लिए ताजा समाधान का उपयोग करें। यह समाधान कई हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. क्लोरोफिल, लिपिड और चयापचयों का निष्कर्षण

  1. ट्यूब की व्यवस्था, सेल गोली के साथ (जिसमें 10-15 x 106 कोशिकाओं), तरल नाइट्रोजन में.
  2. पूर्व ठंडा (-20 डिग्री सेल्सियस) निष्कर्षण बफर 1 के 1 एमएल के साथ प्रत्येक ट्यूब में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
    नोट: कम चिपचिपापन निष्कर्षण बफर के वाष्पीकरण से बचने के लिए जल्दी से इस कदम को पूरा करें। निष्कर्षण बफर 1 जोड़ने के बाद, कमरे के तापमान पर ट्यूबों को बनाए रखें।
  3. भंवर जब तक कोशिकाओं को अच्छी तरह से निष्कर्षण मिश्रण के भीतर homogenized रहे हैं और 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में मिश्रण alicot.
  4. Sonication स्नान का उपयोग कर संस्कृतियों Sonicate (सामग्री की मेजदेखें) 10 मिनट के लिए बर्फ ठंडा पानी में.
  5. एक कक्षीय शेकर पर सभी नमूनों को 1000 आरपीएम पर 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. चरण पृथक्करण को प्रेरित करने के लिए, निष्कर्षण बफर 2 के 650 $L जोड़ें।
  7. भंवर संक्षेप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 20000 x ग्राम पर centrifugation द्वारा पीछा किया।
    नोट: इस कदम के बाद, वहाँ तरल चरणों और ट्यूब के नीचे में एक ठोस गोली की एक जुदाई है. दो तरल चरणों के मिश्रण से बचने के लिए देखभाल के साथ ट्यूबों को संभालें। शीर्ष MTBE चरण लिपिड और क्लोरोफिल शामिल हैं, जबकि निचले चरण ध्रुवीय और अर्द्ध ध्रुवीय चयापचयों शामिल हैं. तल पर वेगित गोली में प्रोटीन, स्टार्च और अन्य अघुलनशील अणु होते हैं।

6. अलीकोटिंग अंश

  1. 1.5 एमएल ट्यूब लेबल में ऊपरी MTBE-चरण (लिपिड) के 500 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण। एक वैक्यूम concentrator का उपयोग कर नमूने सूखी (सामग्री की मेजदेखें) और माप तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  2. एक 200 $L पिपेट का उपयोग कर शेष MTBE-चरण निकालें।
  3. एक नए लेबल ट्यूब करने के लिए निचले चरण (ध्रुवीय और अर्द्ध ध्रुवीय चयापचयों) के 650 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण। एक वैक्यूम concentrator का उपयोग कर नमूने सूखी (सामग्री की मेजदेखें) और माप तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. अतिरिक्त मात्रा बंद pipeting द्वारा शेष निचले चरण निकालें.
  5. तरल नाइट्रोजन में ठोस गोली फ्रीज और आगे निष्कर्षण जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

7. ध्रुवीय चयापचयों का निर्धारण (प्राथमिक चयापचयों)

  1. कार्बनिल समूहों के मेथॉक्सीमीकरण के लिए मेथॉक्सीमाइन-हाइड्रोक्लोराइड/पाइरिडीन विलयन में ध्रुवीय चरण (चरण 6-3) के सूखे गोली को पुन: निलंबित करें।
  2. 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने गरम करें।
  3. एन-मेथिल-एन-ट्राइमेथिलसिलिफ्लोरेक्ट्राइटमाइड (MSTFA) के साथ नमूनों को 37 मिनट पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए Derivatize के रूप में पहले13वर्णित .
  4. प्राथमिक चयापचयों का विश्लेषण करने के लिए गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग समय-की-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-टीओएफ-एमएस) के साथ युग्मित करें। उपयोग किए गए प्रवणता पैरामीटर पूर्व वर्णित प्रोटोकॉल14के अनुसार थे।

8. गैर ध्रुवीय चयापचयों का निर्धारण (लिपिड)

  1. एसीटोनिट्रिल:आइसोप्रोपेनॉल (7:3, v:v) के मिश्रण में गैर-ध्रुवीय चरण (चरण 6.1) के सूखे गोली को पुन: निलंबित करें।
  2. 20000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और एक रिवर्स चरण C8 स्तंभ पर अलग (100 मिमी $2.1 मिमी ]1.7 $m कणों), एक UPLC प्रणाली का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें). दो मोबाइल चरणों 1% 1 एम अमोनियम एसीटेट, 0.1% एसिटिक एसिड बफर (ए), और एसीटोनिट्रिल: isopropanol (7:3) युक्त 1% 1 एम अमोनियम एसीटेट, 0.1% एसिटिक एसिड (बी) के साथ पानी थे।
  3. पहले वर्णित प्रोटोकॉल14के अनुसार प्रवणता पैरामीटरों का प्रयोग करें।

9. क्लोरोफिल सामग्री का निर्धारण

  1. MTBE-चरण (चरण 6.1) के 100 डिग्री सेल्सियस को एक विधि रिक्त और साथ ही प्रयोगात्मक नमूनों के लिए 900 डिग्री एमथनॉल के साथ मिलाएं।
  2. 665 एनएम और 652 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अवशोषण को मापने के लिए क्लोरोफिल ए और क्लोरोफिल ख के बीच अंतर करने के लिए।
    नोट: अवशोषण के बीच श्रेणी चाहिए 0.1 और 1 मान्य एकाग्रता गणना के लिए. यदि आवश्यक हो तो नमूनों को पतला करें।
  3. क्लोरोफिल ए और ख सामग्री की गणना करें, और निम्नलिखित सूत्रों के अनुसार कुल क्लोरोफिल सामग्री भी।
    Chlएक $ 16.82A665 - 9.28A652
    Chlb ] 36.92A652 - 16.54A665
    Chla$b ] 0.28A665 + 27.64A652
    नोट: सूत्रबार-नून और ओहद15द्वारा वर्णित किए गए थे।

10. निष्कर्षण और प्रोटीन सामग्री का निर्धारण, पाचन और विश्लेषण

नोट: प्रोटीन को पुन: निलंबित करने के लिए, गोली यूरिया /थाइयूरिया बफर (6 एम यूरिया, 2 एम थाइओरियांड प्रोटीज़ और फॉस्फेटेज इनहिबिटर) का उपयोग पहलेवर्णितप्रोटोकॉल में संशोधनों के साथ किया गया था। हालांकि, पसंद के किसी भी बफर प्रोटीन के resuspension के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. निम्न सांद्रता का उपयोग करके प्रोटीन बफर तैयार करें: यूरिया का 6 एम और थियुरिया का 2 एम।
  2. प्रोटीन बफर (10.1) के 200 डिग्री एल में गोली (चरण 6.5) को भंग करें।
  3. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने इनक्यूबेट, 5 मिनट के लिए 20000 x ग्राम पर centrifugation के बाद.
  4. सुपरनेटेंट को स्थानांतरित करें, जिसमें प्रोटीन होता है, एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. ब्रैडफोर्ड परख17द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें.
  6. पसंद के एक प्रोटोकॉल के साथ में समाधान प्रोटीन के 50 डिग्री ग्राम डाइजेस्ट. यहाँ, निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    1. 30 मिनट के लिए 5 एमएम डीटीटी का उपयोग करप्रोटीन नमूनों की 50 डिग्री ग्राम की कमी करें जिसके बाद अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 10 एमएम आयोडोऐसीटामाइड का उपयोग किया गया।
    2. एक 25:1 प्रोटीन: protease अनुपात (w/w) में Trypsin/Lys-C मिक्स जोड़ें, मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए इनक्यूबेट।
    3. 50 एम एम त्रिशसीएल (पीएच 8) और इनक्यूबेट का उपयोग करके नमूनों को छह गुना 37 डिग्री सेल्सियस पर पतला करें।
    4. 0.5-1% की अंतिम सांद्रता में ट्राइफ्लोरोएटिक एसिड (टीएफए) जोड़कर पाचन समाप्त करें।
  7. पाचन के बाद, सी18 चरण सुझावों का उपयोग कर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले पेप्टाइड्स के desalting प्रदर्शन और पचा पेप्टाइड्स18को पूरा .
  8. नमूनों को सूखे पनक के निकट पर ध्यान केंद्रित करें, एक निर्वात संकेन्द्रक में समाधान के 2-5 डिग्री सेल्सियस को छोड़ दें (सामग्री की सारणीदेखें) बिना हीटिंग के।
  9. बफर लोड करने में नमूनों को पुन: निलंबित (5% एसीटोनिट्रिल, 0.5% फोरमिक एसिड) और एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर LC-MS/MS द्वारा पेप्टाइड मिश्रण का विश्लेषण (सामग्री की तालिकादेखें) एक नैनो-UPLC प्रणाली से जुड़े.
  10. UPLC प्रणाली का उपयोग कर पेप्टाइड्स को अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें ) एक 20 सेमी रिवर्स चरण आवेशित सतह संकर (सीएसएच) स्तंभ पर (सामग्री की तालिकादेखें ) 75 डिग्री उ के एक आंतरिक व्यास और 1ण्7 डिग्री उ के कण आकार के साथ।
  11. नमूने का 4 डिग्री एल लोड करें और 300 एनएल/मिनट की प्रवाह दर पर 90 मिनट ढाल के माध्यम से चलाएं।
  12. ग्रेडिएंट सेट करें. आंशिक लूप-ऑफ़लाइन सेटिंग्स के साथ समस्थानिक ढाल सेट के साथ आंशिक लूप-ऑफ़लाइन सेटिंग्स का उपयोग करें बफर बी (99.9% एसीटोनिट्रिल + 0.1% फोरमिक एसिड) के 3% पर लूप को कॉलम के साथ ऑनलाइन स्थिति में स्थानांतरित करने से पहले 14 मिनट के लिए आयोजित किया जाता है, उसके बाद ढाल को रैखिक रूप से 50 मिनट के लिए बढ़ा दिया जाता है, जब तक 20% तक बफ़र B तक पहुँच गया है।
  13. अगले 15 मिनट के भीतर, 30% करने के लिए बफर बी की एकाग्रता में वृद्धि. फिर निम्नलिखित 15 मिनट में, बफर बी को 40% तक बढ़ाएं, एक और 4 मिनट के बाद बफर बी के 90% तक पहुंचने से पहले, धोने का चरण करें, जो कॉलम को साफ करने के लिए आवश्यक है, 400 nL/min पर और अतिरिक्त 10 मिनट के लिए होल्ड करें (विस्तृत प्रवणता के लिए तालिका 1 देखें शर्तें)।
  14. अंत में, सिस्टम को 300 nL/min की प्रवाह दर और 1 मिनट के भीतर 3% बफर बी की सांद्रता पर वापस सेट करें. अगले नमूने के इंजेक्शन से पहले 15 मिनट के लिए कॉलम को बराबर कर दें।
    नोट: LCMS/MS विश्लेषण तालिका 2में प्रस्तुत किया जाता है के बाद पहचान प्रोटीन की एक पूरी सूची.

11. निष्कर्षण और स्टार्च सामग्री का निर्धारण

नोट: कुल प्रोटीन और स्टार्च सामग्री के निर्धारण के लिए, ठोस गोली एक दो कदम प्रक्रिया में निकाला गया था के रूप में पहले वर्णित10.

  1. सेल गोली (चरण 6.5) में 80% (v/v) इथेनॉल का 500 $L जोड़ें और 80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। फिर 100 एम एम सोडियम ऐसीटेट के 250 डिग्री एल के अलावा बाँझ पानी में गोली भंग.
  3. 99 डिग्री सेल्सियस पर 3 ज के लिए गर्म करके स्टार्च को हाइड्रोलाइज़ करें। घुले हुए स्टार्च को रात भर ग्लूकोज मोनोमर में डाइज करें, जिसमें जेड-एमाइलेज (4.2 यूनिट प्रति प्रति नमूना) और जेड-एमाइलोलुकोसिडीज (प्रति प्रति प्रति प्रति इकाई) का एंजाइम मिश्रण मिलाकर। ट्यूबों को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऊष्मायन के बाद, नमूने कुछ दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर, या कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर, ग्लूकोज माप से पहले जमे हुए किया जा सकता है।
  4. 5 मिनट के लिए 20000 x ग्राम पर पचा निकालने सेंट्रीफ्यूज और supernatant इकट्ठा। सुपरनेटेंट (स्टार्च व्युत्पन्न ग्लूकोज मोनोमर के साथ) को HEPES-बफर (पीएच 7) के 100 एम एम में भंग करें जिसमें 5 एमएम एमजीसीएल2, 60 मिलीग्राम/एमएल एटीपी, 36 मिलीग्राम/एमएल एनएडीपी और ग्लूकोज-6-फॉस्फेट-डिहाइड्रोजनेज (1 यूनिट प्रति नमूना) शामिल हैं।
  5. स्टार्च सामग्री का विश्लेषण करने के लिए, पहले 340 एनएम पर आधारभूत अवशोषण को मापें। फिर प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए हेक्सोकिनेस (1 यूनिट प्रति नमूना) जोड़ें। अंत में एक 96 अच्छी तरह से प्लेट रीडर के साथ 340 एनएम पर NADPH + एच+ (चर्क पचा के स्तर का संकेत) की वृद्धि को मापने।
    नोट: 340 एनएम पर अधिकतम मान का अंतर (के रैखिक रेंज से अधिक नहीं होना चाहिए 1) और आधार रेखा पचा स्टार्च की ग्लूकोज एकाग्रता के बराबर है. प्रति एमएल ग्लूकोज के nmol में ग्लूकोज एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक ग्लूकोज वक्र किया जाना चाहिए।

Representative Results

क्लैमिडोमोनास रेनहार्ड्टी सीसी-1690 संस्कृति तुल्यकालन
दिए गए प्रोटोकॉल के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करने के लिए, हम उदाहरण बहु-omics डेटा कटाई और सिंक्रनाइज़ Chlamydomonas rehardtii संस्कृतियों से नमूनों की निकासी के बाद प्राप्त प्रस्तुत10. क्लैमाइडोमोनास की सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों में एक विशिष्ट समय बिंदु पर एक समान विकास चरण से संबंधित कोशिकाओं का समावेश होता है। क्लैमाइडोमोनास संस्कृतियों को 12 h/12 h light/अंधेरे चक्र में सिंक्रनाइज़ किया गया था, 34 डिग्री सेल्सियस की प्रकाश तीव्रता के साथ 200 [मोल]m-2[s-1 और सीओ2 एकाग्रता 2%, v/v, तनाव CC-1690 mt+ 10 के लिए इष्टतम एकाग्रता के रूप में वर्णित . इन शर्तों को पहले से अनुकूलित किया गया था और विभिन्न सेल चक्र पैरामीटर10का उपयोग करके मान्य किया गया था। चित्र 1 सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों के अलग-अलग समय बिंदुओं पर Coulter काउंटर के साथ मापा गया कक्ष आकार वितरण प्रदर्शित करता है। कोशिका खंड में एक बदलाव देखा जा सकता है के रूप में कोशिकाओं प्रकाश चरण में आकार में वृद्धि, 10 एच से प्रकाश चरण के अंत में शुरू बेटी कोशिकाओं की रिहाई के बाद. एक बार जब सभी पुत्री कोशिकाओं को जारी कर दिया जाता है, तो कोशिका खंड में परिवर्तन देखा जा सकता है क्योंकि नव जारी की गई पुत्री कोशिकाओं को अगले चक्र 10 (चित्र1) को शुरू करने के लिए निपटान किया जाता है।

नमूना कटाई, -हैंडलिंग और -निष्कर्षण
नमूनों की तेजी से कटाई सेंट्रीफ्यूगेशन का उपयोग करके की जाती है और सुपरनेंट को हटाने के बाद, छर्रों को निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। जैसा कि ऊपर वर्णित (चरण 5), तीन अलग-अलग चरणों में MTBE निष्कर्षण परिणाम: क) कार्बनिक चरण लिपिड के साथ-साथ क्लोरोफिल स्तर (सामान्यीकरण कारक) को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था, ख) ध्रुवीय चरण GCMS पर चयापचयों को मापने के लिए एकत्र किया गया था जबकि, सी) गोली का इस्तेमाल किया गया था स्टार्च सामग्री और प्रोटीन को मापने के लिए। विभिन्न चरणों और उनके रोजगार के वितरण का अवलोकन चित्र 2में दिखाया गया है ।

ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय चयापचयों
ध्रुवीय अंश के GCMS विश्लेषण के आधार पर, 65 चयापचयों एनोटेट थे, एमिनो एसिड को कवर, न्यूक्लिक एसिड, ग्लाइकोलिसिस के मध्यवर्ती, gluconeogenesis, tricarboxylic एसिड चक्र, पेंटोस फॉस्फेट मार्ग और polyamines (चित्र 3A). लिपिड युक्त तटस्थ चरण के LCMS विश्लेषण विभिन्न लिपिड वर्गों अर्थात् फॉस्फेटिडेलिग्लिसरोल, फॉस्फेटिडेलिथेलेथेरामाइन, सल्फोक्विनोवोसिल डायसाइलग्लिसरोल्स को कवर करने वाले 204 अलग-अलग लिपिड प्रजातियों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया, मोनोगैलैक्टोसिलीसिलिग्लिसरोलॉल्स, डाइगालेक्टोसिल्डिसिलीसिलीसेरोलॉल्स, डाइसाइलगलीसिलट्राइमथल्मोसेरिन, फैटी एसिड, डाइसाइल्ग्लिसराइड्स और ट्रायसाइलग्लिसराइड्स। सेल चक्र में चयापचयों और लिपिड में वैश्विक बदलाव कल्पना करने के लिए, मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग किया गया था। पीसीए दोनों metabolomics और lipidomic डेटा के लिए प्रकाश और अंधेरे चरणों की एक जुदाई प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, एक अर्द्ध चक्रीय (आंशिक रूप से खुला वृत्त) दोनों डेटा के लिए देखा जा सकता है (चित्र 3 ब्,डी). परिपत्र पैटर्न में आंशिक अंतर इस तथ्य के लिए जिम्मेदार है कि सेल चक्र के 24 एच पर नमूने प्रकाश के लिए जोखिम के 0.25 एच के बाद सेल चक्र की शुरुआत में एकत्र नमूनों के विपरीत अंधेरे में एकत्र किए गए थे (चित्र3C , डी).

प्रोटीन और स्टार्च विश्लेषण
MTBE निष्कर्षण का एक परिणाम के रूप में प्राप्त प्रोटीन गोली की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, 6 नमूने proteomic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया. 50 ग्राम प्रोटीन/प्रतिदर्श को पचाकर प्राप्त प्रोटीओमिक्स डेटा की गुणवत्ता की जांच एक संगणकीय गुणवत्ता नियंत्रण उपकरण -प्रोटीओमिक्स गुणवत्ता नियंत्रण (PTXQC)19का उपयोग करके की गई थी, जो प्रोटीओमिक्स डेटा से प्राप्त पुनरुत्पाद्य और उच्च गुणवत्ता का संकेत देता है। सभी प्रतिकृतियां (अनुपूरक चित्र 1)। REVIGO20का उपयोग करके प्रोटीनों के आण्विक कार्यात्मक कवरेज की जांच की गई . 2463 अभिज्ञात प्रोटीनों के कार्यात्मक संवर्धन का अवलोकन (तालिका 2देखें ) चित्र 4कमें प्रस्तुत किया गया है . प्रोटीन निष्कर्षण के बाद शेष गोली का उपयोग स्टार्च के पुनरुत्पादक परिमाणीकरण के लिए किया गया था जैसा कि विभिन्न प्रतिकृतियां के बीच निम्न मानक विचलन द्वारा दर्शाया गया था (चित्र 4ख) ।

Figure 1
चित्र 1: क्लैमिडोमोनस रीनहार्ड्टीमें सेल चक्र के विभिन्न चरणों में कोशिका आयतन में परिवर्तन का उदाहरण। x-अक्ष कक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करते हुए कक्ष वॉल्यूम का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: बहु-ओमिक्स निष्कर्षण सेल छर्रों के दौरान विभिन्न चरणों के रोजगार के लिए इलस्ट्रेटेड कार्यप्रवाह। यह आंकड़ा Juppner, जे एट अल से पुन: उपयोग किया गयाहै. 10इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पहचाने गए चयापचयों और लिपिडों का प्रतिनिधि उदाहरण। (A) GCMS विश्लेषण द्वारा पहचाने गए मेटाबोलाइट वर्ग। (बी) लिपिड प्रजातियों LCMS विश्लेषण द्वारा पहचान की विभिन्न वर्गों से संबंधित. (ग) 24 एच कोशिका चक्र में मेटाबोलाइट स्तरों का सिद्धांत घटक विश्लेषण। (घ) 24 एच कोशिका चक्र में लिपिड का सिद्धांत घटक विश्लेषण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रोटीन और स्टार्च डेटा का प्रतिनिधि उदाहरण. क) LCMS विश्लेषण का उपयोग करपहचान प्रोटीन के आणविक कार्यात्मक संवर्धन, REVIGO 20 बी) प्रतिनिधि स्टार्च डेटा प्रोटोकॉल की पुनरुत्पाद्यता प्रदर्शित का उपयोग कर तैयार treemap. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: तापमान और वातन के लिए fermenter प्रणाली के अनुकूलित डिजाइन Chlamydomonas संस्कृतियों के तुल्यकालिक विकास नियंत्रित. यह आंकड़ा Juppner, जे एट अल से पुन: उपयोग किया गयाहै. 10 इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2: proteomics डेटा की गुणवत्ता के लिए प्रतिनिधि परिणाम. हीटमैप अभिकल्पित संगणकीय PTXQC उपकरण19का उपयोग कर | इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

समय (न्यूनतम) % बफ़र B से बफ़र A
0 से 15 मिनट रैखिक प्रवणता 0 से 3% तक बफर ए: UPLC ग्रेड पानी में 0.1% formic एसिड
15 से 75 मिनट रैखिक प्रवणता 3% से 30% तक बफर बी: 60% UPLC ग्रेड एसीटोनिट्रिल में 0.1% formic एसिड
75 से 90 मिनट रैखिक प्रवणता 30% से 40% तक फ्लो रेट 300 एनएल/
90 से 94 मिनट रैखिक प्रवणता 40% से 90% तक इंजेक्शन की मात्रा 4 डिग्री सेल्सियस
94 से 104 मिनट 90% के साथ धोने स्तंभ
105 से 120 मिनट 3% पर 15 मिनट के लिए स्तंभ बराबर करें

तालिका 1: पेप्टाइड नमूने, ढाल मापदंडों के तरल क्रोमैटोग्राफी।

तालिका 2: LCMS/MS विश्लेषण के बाद पहचाने गए प्रोटीनों की सूची। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस लेख में, हम 10-15 x 106 कोशिकाओं के एक गोली से व्यापक lipidomics, metabolomics, स्टार्च और proteomics विश्लेषण के लिए एक मजबूत और अत्यधिक लागू निष्कर्षण प्रोटोकॉल सचित्र. विधि सफलतापूर्वक कोशिकाओं और ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए कई अध्ययनों में लागू किया गया है10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. यहाँ, हम क्लैमिडोमोनास reinhardtii (CC-1690 मीटर +) संस्कृति से काटा एक नमूना से विभिन्न जैव अणुओं के बहु-ओमिक्स विश्लेषण के लिए एक कदमवार पाइप लाइन प्रस्तुत की।

प्रोटोकॉल विभिन्न जैव अणुओं के विश्लेषण के लिए, एक बार में कई नमूनों को संसाधित करने के लिए एक मजबूत और पुन: उत्पादनीय दृष्टिकोण प्रदान करता है। तथापि, तकनीकी भिन्नता को कम करने के लिए अनेक महत्वपूर्ण कदम उठाए जाने चाहिए। सबसे पहले, कोशिकाओं की जैविक स्थिति को बनाए रखने के लिए सभी काटे गए नमूनों के लिए एक समान शर्तों को बनाए रखते हुए कोशिकाओं की कटाई जितनी जल्दी हो सके की जानी चाहिए। यद्यपि हमने कोशिकाओं को काटने के लिए अपकेंद्रण का उपयोग किया था, फिर भी नमूनों की कटाई के लिए वैकल्पिक कटाई रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न कटाई रणनीतियों कोशिकाओं की चयापचय स्थिति को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है37 इसलिए, लगातार कटाई दृष्टिकोण सभी प्रयोगात्मक नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. दूसरे, ऊपरी गैर-ध्रुवीय चरण जिसमें क्लोरोफिल के सूखने से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह नमूनों के लिए सामान्यीकरण कारक को प्रभावित करने वाले विलायक में भंग क्लोरोफिल के स्तर को प्रभावित कर सकता है। अंत में, प्रोटीन और स्टार्च गोली प्राप्त करने के लिए शेष ध्रुवीय चरण को हटाने के दौरान देखभाल की जानी चाहिए, गोली जो स्टार्च और प्रोटीन सामग्री को प्रभावित कर सकते हैं परेशान से बचने के लिए.

इस तरह प्रस्तुत निष्कर्षण प्रोटोकॉल एकाधिक-omics डेटा विश्लेषण के लिए कई लाभ प्रदान करता है. आवश्यक नमूना alicots की संख्या को कम करने के अलावा, यह भी विभिन्न जैव अणुओं के लिए प्राप्त विश्लेषणात्मक परिणामों के बीच भिन्नता कम कर देता है। यह प्राथमिक चयापचयों, लिपिड और प्रोटीओमिक डेटा से प्राप्त परिणामों की सीधी तुलना की अनुमति देता है। इसी प्रकार, एकाधिक यौगिक वर्गों का एक साथ निष्कर्षण विभिन्न डेटा सेटों की संगत और समान सामान्यीकरण रणनीति की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से लागू होता है अगर सामान्यीकरण शुष्क या ताजा वजन38 या सेल संख्या का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए मुश्किल है.

प्रोटोकॉल एक जटिल जैविक नमूने की नियमित जांच के लिए लागू किया जा सकता है. ये समग्र मेटाब्लोलोमिक, लिपिडोमिक और प्रोटीओमिक डेटा सेट चयापचय में व्यवस्थित परिवर्तन के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रोटीओमिक्स विश्लेषण से प्राप्त डेटा, चयापचयों के संबंध में प्रोटीन में मात्रात्मक (बहुतायत) और गुणात्मक (संशोधन) परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। अतः ओमिक्स डेटा को एकीकृत करने से आनुवंशिक या जैविक और/अथवा जैविक प्रणाली के अजैविक क्षोभ क्षोभ के कारण होने वाले परिवर्तनों के बारे में गहन जानकारी प्रकट हो सकती है। इस प्रकार, विशिष्ट चयापचय रास्ते या सेलुलर प्रक्रियाओं के आणविक परिवर्तन स्पष्ट. इसी प्रकार, ये उच्च-थ्रूपुट डेटा चयापचय अभियांत्रिकी के लिए लक्ष्यों की पहचान की अनुमति दे सकते हैं और जीनोम-स्केल चयापचय मॉडल37,39से परिष्कृत या परीक्षण भविष्यवाणियों की अनुमति दे सकते हैं।

Disclosures

लेखकों कोई खुलासे नहीं है.

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Gudrun Wolter और nne Michaelis के लिए बहुत आभारी हैं. हम उनकी मदद के लिए Giavalisco प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम एल ए Giraldi की फैलोशिप के लिए अनुसंधान और FAPESP वित्त पोषण के लिए मैक्स प्लैंक सोसायटी के आभारी हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and standards
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) Avanti Polar Lipids 850360P Internal standard for lipids
13C Sorbitol Sigma Aldrich 605514 Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes
Ampicillin Sigma Aldrich A9393-5G Internal standard for metabolites
Corticosterone Sigma Aldrich 27840-500MG Internal standard for metabolites, HPLC grade
Methanol (MeOH) Biosolve Chemicals 13684102 ULC-MS grade
Methyl tert-butyl ether (MTBE) Biosolve Chemicals 13890602 HPLC grade
Trypsin/Lys-C mix Promega V5072 Enzymatic digestion of proteins
Water Biosolve Chemicals 23214102 ULC-MS grade
Equipment
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086 Used for fractions
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120094 Used for sample extarction
Balance Sartorius Corporation 14 557 572
Fermenter system Glasbläserei Müller, Berlin, Germany custom made fermenter of 800ml capacity
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf, model 5427R 22620701
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) Waters, Machester, UK 186002878 Analysis of lipids
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm Waters, Machester, UK 186007477 Analysis of proteins
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) Waters, Machester, UK 186003539 Analysis of metabolites
Shaker Eppendorf Thermomixer 5436 2050-100-05
Sonicator USC 300 TH 142-0084 standard preset sonication power at 45kHz
UPLC system Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)
Vacuum concentrator Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators 7.008.500.002
Vortex mixer Vortex-Genie 2, Model G560 SI-0236
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer Beckman Coulter 6605700 particle (cells) volume and number analyser

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References

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Mubeen, U., Giraldi, L. A., Jüppner, J., Giavalisco, P. A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii. J. Vis. Exp. (150), e59547, doi:10.3791/59547 (2019).

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