Summary
Systemomfattende analyse av flere biomolekyler er avgjørende for å få funksjonell og mekanistisk innsikt i biologiske prosesser. En omfattende protokoll er herved beskrevet for høy gjennomstrømming ekstraksjon av lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve høstet fra synkronisert Chlamydomonas kultur.
Abstract
Mikroalger har vært fokus for forskning for sine søknader i produksjon av høy verdi forbindelser, mat og drivstoff. Videre er de verdifulle fotosyntetiske modeller tilrettelegge forståelsen av de grunnleggende cellulære prosesser. Systemomfattende studier muliggjør omfattende og inngående forståelse av molekylære funksjoner av organismer. Det kreves imidlertid flere uavhengige prøver og protokoller for Proteomikk, lipidomics og Plantemetabolomikk studier som introduserer høyere feil og variasjon. En robust høy gjennomstrømning utvinningsmetode for samtidig ekstraksjon av klorofyll, lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra et enkelt utvalg av grønne Alga Chlamydomonas reinhardtii er presentert her. Den illustrerte eksperimentelle oppsettet er for Chlamydomonas kulturer synkronisert med 12 h/12 h lys/mørke forhold. Prøvene ble samlet inn over en 24 h celle syklus for å demonstrere at metabolitter, lipider og stivelse data innhentet ved hjelp av ulike analytiske plattformer er godt likedannet. Videre ble protein prøver som ble samlet inn ved hjelp av den samme utvinnings protokollen, brukt til å gjennomføre detaljert Proteomikk analyse for å evaluere kvaliteten og reproduserbarheten. Basert på data, kan det utledes at den illustrerte metoden gir en robust og reproduserbar tilnærming for å fremme forståelsen av ulike biokjemiske trasé og deres funksjoner med større tillit til både grunnleggende og anvendt forskning.
Introduction
Mikroalger er en rik kilde av naturlige produkter (for eksempel brensel, mennesker og dyr ernæring, kosmetikk og farmakologiske stoffer). En rekke forsknings tiltak gjennomføres for å øke effektiviteten ved produksjon av høyverdiprodukter fra mikroalger1,2,3,4. Systemer-nivå forståelse av metabolisme er en forutsetning for å forbedre kvaliteten og avkastningen av naturlige produkter5,6,7. Med bruk av funksjonelle genomisk teknikker og forbedrede masse massespektrometri metoder, kan tusenvis av gener, transkripsjoner, proteiner og metabolitter overvåkes samtidig. Det er imidlertid nødvendig med flere eksempler for dyptgående Proteomikk, lipidomics og Plantemetabolomikk studier, som ofte er vanskelig å oppnå i encellede organismer, spesielt hvis det skal utføres tids kurs studier. Videre, innsamling og behandling av ulike sample alikvoter i kombinasjon med ulike protokoller for å samle de svært komplekse omics data (dvs. Proteomikk, lipidomic, og Plantemetabolomikk) introduserer variasjon, og dermed gjør integreringen av data en utfordrende oppgave.
Chlamydomonas gir ikke bare en utmerket mikrobiell system for etterforskning av cellulære prosesser, men også en praktisk modell for å studere koordinering av celle syklus og metabolisme. Følgelig er en sterk koordinering av transkripsjoner uttrykk med celle syklus vist ved hjelp av høyoppløselig transcriptome profilering av synkronisert kultur Chlamydomonas8. Om 80% av de analyserte transkripsjoner utstilt robuste periodisitet over en 24 h celle syklus8. Likeledes ble tørr vekt, proteiner, klorofyll, aminosyrer og fettsyrer av to forskjellige stammer av Chlamydomonas vist å relatere med celledeling i en studie der prøvetaking ble utført hver 4 h9. Nylig ble det rapportert at metabolitten og lipid dynamikk av celle Skift basert på bestemte faser av cellen syklus10. De subtile endringene i forskjellige biomolekyler var mulig å overvåke ved hjelp av en robust methyl tert-butyl ETER (MTBE): metanol: vannbasert utvinningsmetode, som gir et ideelt utgangspunkt for omfattende multi-omics analyse10 , 11i.
De presenterte protokollen guider gjennom en reproduserbar og effektiv strategi10, for samtidig ekstraksjon av lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve alikvot, for tiden løst metabolomic og lipidomic studie av synkron voksende Chlamydomonas kulturer. I tillegg til å illustrere de robuste og reproduserbar metabolske og lipidomic data10, her er kvaliteten på Proteomikk prøvene Hentet fra samme pellet også demonstrert.
Protocol
1. pre-kulturer av Chlamydomonas reinhardtii
- Forbered pre-kulturer av Chlamydomonas reinhardtii (stamme vill type CC-1690 Mt +) ved å overføre celler fra solide plater av tap medium til Erlenmeyer flasker med 200 ml av HSM medium12.
- Grow pre-kulturer på en rotatory shaker ved 24 ° c på 100 μmoles · m-2· s-1 kontinuerlig lys til celle tettheten når ~ 2 x 106 celler/ml.
2. synkronisering av Chlamydomonas flytende kulturer i fermentorer
Merk: parametrene som presenteres i denne protokollen, for eksempel temperatur, lys og CO2, er spesifikke for synkronisering av belastningen CC-1690 Mt +. For å utvikle en synkronisert kultur med en annen belastning, er det nødvendig å teste de optimale forhold.
- Overfør pre-kulturen til et fermenter system (se supplerende figur 1 for spesiallaget fermenter design), koblet til en resirkulering kjøler for å opprettholde temperaturen, med bobler av filtrerte co2 (2%, v/v) og rørt med en magnetisk røre bar på bunnen av fermenter med konstant agitasjon.
- For å starte synkroniseringen, Still inn fermenter ved lys-mørkt regime på 12:12 h, under 34 ° c og 200 μmoles · m-2· s-1 lys og sørg for at den inneholder 500 ml kultur i HSM-medium med en celle tetthet på 1 x 106 celler/ml.
- På slutten av 24 h syklus, re-fortynne kulturen til 1 x 106 celler/ml med fersk HSM medium med minimal forstyrrelsene ved hjelp av et rørsystem i kombinasjon med peristaltisk pumper, som gjør det mulig å først pumpe en distinkt mengde kultur ut og etterpå pumpe i autoklav-sterilisert medium.
Merk: som et alternativ til peristaltisk pumper, kan vaksinere sprøyter brukes til å trekke tilbake kulturen, mens det nødvendige volumet av friskt medium kan legges direkte inn i fermenter under sterile forhold. - Gjenta trinn 2,3 tre ganger for å få synkronisert kulturer på 4th dag av inoculation.
- For å validere Synchrony av celler, høste prøver med et intervall på hver 2 h og måle celle tetthet og celle volum ved hjelp av en celle teller og størrelse analysator (se tabell over materialer). Avhengig av celle tettheten, fortynne prøvene mellom 1:10 til 1:100 og måle i en størrelsesklasse på 30 – 1900 μm3.
3. høsting Chlamydomonas celler
- Merk 15 mL koniske sentrifugerør og klargjør en Dewar fylt med flytende nitrogen.
- Høste prøver ved hjelp av en sprøyte (50 cm3) gjennom den indre glassrøret på fermenter. Fordel prøven i koniske sentrifugerør som skal inneholde 10-15 x 106 celler. Legg merke til volumet som overføres til hvert rør, og mål celle tettheten og cellestørrelsen for hvert tidspunkt ved hjelp av celle teller og størrelses analysator (se tabell over materialer)
- Pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 4000 x g. Deretter kastes supernatanten, fryse pellets i flytende nitrogen og senere lagre ved-80 ° c.
4. utarbeidelse av utvinning buffere og utvinning klorofyll, lipider og metabolitter
FORSIKTIG: metanol (MeOH) og MTBE er brannfarlige og kan forårsake irritasjon av luftveiene, øyet eller huden ved langvarig eksponering og/eller kontakt. Vennligst håndter dem forsiktig bare i en avtrekks hette og bruk de riktige sikkerhetsprosedyrene under ekstraksjon (laboratoriefrakk, vernebriller, hansker, etc.).
-
Avtrekks buffer 1
- I en 100 mL volum kolbe, tilsett 75 mL MTBE, 25 mL MeOH (UHPLC grade) og homogenisere (3:1, Vol/Vol).
- Legg til følgende interne standarder løsning: 50 μL av corticosterone (1 mg/mL i MeOH), 50 μL 1, 2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) (1 mg/mL i kloroform HPLC klasse), 25 μL av Ampicillin (1 mg/mL i vann UHPLC klasse) og 50 μL av D-Sorbitol-1-13C (1 mg/mL i vann UHPLC klasse).
- Overfør avsugs bufferen til en ren glass flaske og Avkjøl løsningen ved-20 ° c, 1 time før bruk. Bruk ferskt tilberedt løsning for utdrag. Denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 2 uker.
-
Avtrekks buffer 2
- I en 100 mL volum kolbe, tilsett 75 mL vann UHPLC klasse og 25 mL MeOH UHPLC klasse og homogenisere.
- Overfør avsugs bufferen til en ren glass flaske. Bruk frisk løsning for utdrag. Denne løsningen kan oppbevares ved romtemperatur i flere uker.
5. ekstraksjon av klorofyll, lipider og metabolitter
- Ordne rørene, med cellen pellet (som inneholder 10-15 x 106 celler), i flytende nitrogen.
- Resuspend celle pellet i hvert rør med 1 mL pre-avkjølt (-20 ° c) utvinnings buffer 1.
Merk: Utfør dette steget raskt for å unngå fordamping av utvinnings bufferen med lav viskositet. Når du har lagt til Avsugs buffer 1, opprettholder du rørene ved romtemperatur. - Vortex til cellene er godt homogenisert innenfor utvinning blandingen og alikvot blandingen i 2 mL mikrosentrifugen tube.
- Sonikere kulturene ved hjelp av sonikering bad (se tabell over materialer) i is kjølt vann i 10 min.
- Ruge alle prøvene på en orbital shaker ved 1000 RPM for 60 min ved 4 ° c.
- For å indusere fase separasjon, tilsett 650 μL av utvinnings buffer 2.
- Vortex kort etterfulgt av sentrifugering ved 20000 x g i 5 min ved 4 ° c.
Merk: etter dette trinnet, det er en separasjon av flytende faser og en solid pellet i bunnen av røret. Håndter rørene forsiktig for å unngå blanding av de to væske fasene. Den øverste MTBE-fasen inneholder lipider og klorofyll, mens den nedre fasen inneholder polare og semi-polare metabolitter. Den igangsatte pellets i bunnen inneholder proteiner, stivelse og andre uløselig molekyler.
6. Aliquoting fraksjoner
- Transfer 500 μL av øvre MTBE-fase (lipider) i et merket 1,5 mL rør. Tørk prøvene med en vakuum konsentrat (se tabell over materialer) og oppbevar ved-80 ° c til måling.
- Fjern den gjenværende MTBE-fasen ved hjelp av en 200 μL pipette.
- Overføring 650 μL av den nedre fase (Polar og semi-polare metabolitter) til en ny merket rør. Tørk prøvene med en vakuum konsentrat (se tabell over materialer) og oppbevar ved-80 ° c til måling.
- Fjern den gjenværende nedre fasen ved å pipettering av det overskytende volumet.
- Frys den solide pellet i flytende nitrogen og oppbevar ved-80 ° c til videre ekstraksjon.
7. fastsettelse av polare metabolitter (primære metabolitter)
- Resuspend den tørkede pellet av Polar fasen (trinn 6,3) i methoxyamine-hydrochloride/pyridine løsning for methoxymization av karbonyl grupper.
- Varm opp prøvene ved 37 ° c i 90 min.
- Derivatize prøvene med N-metyl-N-trimethylsilyltrifloracetamide (MSTFA) i 30 min ved 37 ° c som beskrevet tidligere13.
- Bruk gass kromatografi koplet til Time-of-Flight masse massespektrometri (GC-TOF-MS) for å analysere de primære metabolitter. Graderings parametrene som ble brukt var i henhold til protokoll14som ble beskrevet tidligere.
8. fastsettelse av ikke-polare metabolitter (lipider)
- Re-suspendere tørket pellet av ikke-Polar fase (trinn 6,1) i en blanding av acetonitril: isopropanol (7:3, v:v).
- Sentrifuger på 20000 x g og separat på en omvendt fase C8-kolonne (100 mm × 2.1 mm × 1,7 μm-partikler), ved hjelp av et UPLC-system (se tabell over materialer). De to mobile fasene var vann med 1% 1 M ammonium acetate, 0,1% eddiksyre (buffer A), og acetonitril: isopropanol (7:3) inneholdende 1% 1 M ammonium acetate, 0,1% eddiksyre (buffer B).
- Bruk graderings parametrene i henhold til protokoll14som er beskrevet tidligere.
9. bestemmelse av klorofyll innhold
- Bland 100 μL av MTBE-Phase (trinn 6,1) med 900 μL av 90% metanol for en metode blank i tillegg til de eksperimentelle prøvene.
- Mål absorbansen ved hjelp av spektrofotometer i en bølgelengde på 665 NM og 652 NM for å skille mellom klorofyll a og klorofyll b.
Merk: absorpsjonen skal være mellom 0,1 og 1 for gyldig konsentrasjons beregning. Fortynne prøvene, om nødvendig. - Beregn klorofyll a og b-innhold, og også den totale klorofyll innhold i henhold til følgende formler.
CHLa = 16.82 a665 – 9.28 en652
CHLb = 36.92 a652 – 16.54 en665
CHLa = b = 0.28 a665 + 27.64 a652
Merk: formlene ble beskrevet av bar-Nun og Ohad15.
10. ekstraksjon og bestemmelse av proteininnhold, fordøyelse og analyse
Merk: for å resuspend proteinet, ble pellet urea/thiourea buffer (6 M urea, 2 M thioureaand protease og fosfatase hemmere) brukt med modifikasjoner i protokollen tidligere beskrevet16. Imidlertid kan enhver buffer av valget brukes for blanding av proteiner.
- Klargjør protein bufferen ved hjelp av følgende konsentrasjoner: 6 M av urea og 2 M av thiourea.
- Løs opp pellet (trinn 6,5) i 200 μL av protein buffer (10,1).
- Ruge prøvene ved romtemperatur i 30 min, etterfulgt av sentrifugering ved 20000 x g i 5 min.
- Overfør supernatanten, som inneholder proteiner, til et nytt rør.
- Bestem protein konsentrasjonen av Bradford analysen17.
- Digest 50 mikrogram protein i-løsning med en protokoll av valg. Her, bruk følgende protokoll.
- Reduser 50 μg av protein prøver med 5 mM DTT i 30 min etterfulgt av alkylation ved hjelp av 10 mM iodoacetamide i 30 min ved romtemperatur i mørket.
- Legg Trypsin/lys-C Mix på et 25:1 protein: protease ratio (w/w), bland og ruge for 3 timer ved 37 ° c.
- Fortynne prøvene seks folder med 50 mM TrisHCl (pH 8) og ruge over natten ved 37 ° c.
- Avslutt fordøyelsen ved å legge trifluoroacetic syre (TFA) til en endelig konsentrasjon på 0,5-1%.
- Etter fordøyelsen, utføre avsaltingsspisser overlegne sammenlignet av peptider før masse massespektrometri bruker C18 Stage tips og eluere de fordøyd peptider18.
- Konsentrer prøvene til nær tørrhet, slik at 2-5 μL oppløsning i et vakuum konsentratoren (se tabell over materialer) uten oppvarming.
- Resuspend prøvene i lasting buffer (5% acetonitril, 0,5% maursyre syre) og analysere peptid blandinger av LC-MS/MS ved hjelp av en høy oppløsning masse spektrometer (se tabell over materialer) koblet til et nano-UPLC system.
- Skill peptider ved hjelp av UPLC-systemet (se tabell av materialer) på en 20 cm omvendt fase ladet overflate hybrid (csh) kolonne (se tabell over materialer) med en indre diameter på 75 μm og en partikkelstørrelse på 1,7 μm.
- Last 4 μL av prøve og Kjør gjennom 90 min gradient med en strømningshastighet på 300 nL/min.
- Angi graderingen. Bruk delvis løkke-offline innfatningene med isocratic gradient sette for 3% av buffer B (99,9% acetonitril + 0,1% maursyre acid) holdt for 14 min tidligere løkken er skiftet å online holdning med det søylen, deretter det gradient er forhøyet lineært for 50 min, til 20% buffer B er nådd.
- I løpet av de neste 15 min., øke konsentrasjonen av buffer B til 30%. Så i følgende 15 min, øke buffer B til 40%, før de nådde 90% av buffer B etter ytterligere 4 min. Utfør vaske trinnet, som er nødvendig for å rengjøre søylen, på 400 nL/min og hold for ytterligere 10 min (se tabell 1 for detaljert gradient andre forhold).
- Til slutt, sette systemet tilbake til en strømningshastighet på 300 nL/min og en konsentrasjon på 3% buffer B innen 1 min. likevekt kolonnen i 15 minutter før neste prøve injiseres.
Merk: en fullstendig liste over identifiserte proteiner etter LCMS/MS-analyse er presentert i tabell 2.
11. ekstraksjon og bestemmelse av stivelse innhold
Merk: for bestemmelse av totalt protein og stivelse innhold, ble den solide pellet utvunnet i en to-trinns prosedyre som beskrevet tidligere10.
- Tilsett 500 μL av 80% (v/v) etanol til celle pellet (trinn 6,5) og ruge i 10 minutter ved 80 ° c.
- Sentrifuger ved 4000 x g i 10 min ved romtemperatur. Deretter oppløse pellet i 250 μL av sterilt vann etterfulgt av tilsetning av 250 μL av 100 mM natrium acetate.
- Hydrolyserer stivelse ved å varme for 3 h ved 99 ° c. Fordøye den oppløste stivelse i glukose monomerer over natten ved å tilsette en enzym miks av α-Amylase (4,2 enheter per prøve) og α-Amyloglucosidase (10 enheter per prøve). Ruge rørene ved 37 ° c over natten.
Merk: etter inkubasjons kan prøvene fryses ved-20 ° c for noen dager, eller ved-80 ° c i flere måneder, før glukosemålinger. - Sentrifuger den fordøyd ekstrakt på 20000 x g i 5 min og samle supernatanten. Oppløse supernatanten (med stivelse-avledet glukose monomerer) i 100 mM av HEPES-buffer (pH 7) som inneholder 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP og glukose-6-fosfat-dehydrogenase (1 enhet per prøve).
- For å analysere stivelse innhold, først måle Baseline absorbansen på 340 NM. Deretter legger heksokinase (1 enhet per prøve) for å starte reaksjonen. Endelig måle økningen av NADPH + H+ (indikerer nivået av stivelse fordøyd til glukose) ved 340 NM med en 96-brønn plate leser.
Merk: forskjellen på den maksimale verdien på 340 NM (bør ikke overstige den lineære rekkevidden av 1) og Baseline tilsvarer glukose konsentrasjonen av fordøyd stivelse. En glukose kurve bør gjøres for å bestemme glukose konsentrasjonen i nmol glukose per mL.
Representative Results
Chlamydomonas reinhardtii CC-1690 kultur synkronisering
For å demonstrere representative resultater for den gitte protokollen, presenterer vi eksempel multi-omics data innhentet etter høsting og utvinning av prøver fra synkroniserte Chlamydomonas reinhardtii kulturer10. Synkroniserte kulturer av Chlamydomonas består av celler som tilhører en ensartet vekstfase på et spesifikt tidspunkt. Den Chlamydomonas kulturer ble synkronisert ved 12 h/12 h lys/mørk syklus, 34 ° c med lys intensiteten av 200 mikromol · m-2· s-1 og co2 konsentrasjon OF2%, v/v, beskrevet som optimal konsentrasjon for belastning CC-1690 Mt +10 . Disse forholdene hadde tidligere blitt optimalisert og validert ved hjelp av ulike celle syklusparametre10. Figur 1 viser celle størrelsesfordeling målt med Coulter teller på forskjellige tidspunkter i synkroniserte kulturer. Et skifte i celle volumet kan observeres når cellene vokser i størrelse gjennom lys fasen, etterfulgt av utgivelsen av datter celler som starter ved slutten av lys fasen fra 10 timer. Når alle datter cellene er utgitt, kan skifte i celle volumet observeres som nylig utgitte datter celler er disponert for å begynne neste syklus 10 (figur 1).
Sample-høsting,-håndtering og-ekstraksjon
Rask høsting av prøver er utført ved hjelp av sentrifugering og etter å kaste supernatanten, kan pellets lagres ved-80 ° c til ekstraksjon. Som beskrevet ovenfor (trinn 5), MTBE utvinning resultater i tre forskjellige faser: a) organiske fase ble brukt til å måle lipider samt klorofyll nivåer (normalisering faktor), b) Polar fase ble samlet for å måle metabolitter på GCMS mens, c) pellet ble brukt å måle stivelse innhold og proteiner. En oversikt over fordelingen av ulike faser og deres ansettelse er illustrert i figur 2.
Polar og ikke-polare metabolitter
Basert på GCMS analyse av Polar fraksjonen, 65 metabolitter ble kommentert, dekker aminosyrer, nukleinsyre syrer, mellom produkter av Glykolysen, Glukoneogenesen, tricarboxylic syre syklus, pentose fosfat sti og polyaminer (figur 3a). Den LCMS analyse av nøytral fase inneholder lipider førte til identifisering av 204 distinkte lipid arter som dekker ulike lipid klasser nemlig phosphatidylglycerols, phosphatidylethanolamine, sulfoquinovosyl diacylglycerols, monogalactosyldiacylglycerols, digalactosyldiacylglycerols, diacylglyceryltrimethylhomoserine, fettsyrer, diacylglycerides og triacylglycerides. For å visualisere de globale endringene i metabolitter og lipider på tvers av cellesyklusen, ble hovedkomponent analyse (PCA) brukt. PCA viser en separasjon av lyse og mørke faser for både Plantemetabolomikk og lipidomic data. Videre kan en semi-syklisk (delvis åpen sirkel) bli lagt merke til for begge data (figur 3c, D). Den delvise gapet i sirkulær mønster er tilskrevet det faktum at prøvene ved 24 h av cellesyklusen ble samlet inn under mørke i motsetning til prøvene samlet i begynnelsen av celle syklus etter 0,25 h av eksponering for lys (figur 3c , D).
Protein-og stivelse analyse
For å undersøke kvaliteten på protein pellet oppnådd som følge av MTBE ekstraksjon, 6 prøver ble brukt for Proteomikk analyse. Kvaliteten på Proteomikk data innhentet ved å fordøye 50 μg protein/prøve, ble undersøkt ved hjelp av et beregningsverktøy for kvalitetskontroll-Proteomikk kvalitetskontroll (PTXQC)19, som indikerer reproduserbarhet og høy kvalitet på Proteomikk data innhentet fra alle replikeres (supplerende figur 1). Den molekylære funksjonelle dekningen av proteiner ble undersøkt ved hjelp av REVIGO20. En oversikt over funksjonell berikelse av 2463 identifiserte proteiner (se tabell 2), er presentert i figur 4a. De resterende pellet etter protein ekstraksjon ble brukt for reproduserbar kvantifisering av stivelse som indikert av lavt standardavvik blant ulike replikerer (figur 4b).
Figur 1: illustrerende eksempel på endringer i celle volumet på tvers av ulike faser av cellesyklusen i Chlamydomonas reinhardtii. X-aksen som representerer celle volumet, mens y-aksen representerer celle tallet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: illustrert arbeidsflyt for ansettelse av ulike faser under multi-omics utvinning celle pellets. Figuren har blitt gjenbrukt fra Juppner, J.et al. 10. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representativt eksempel på metabolitter og lipider identifisert ved hjelp av den beskrevne protokollen. (A) metabolitten klasser IDENTIFISERT av GCMS analyse. (B) lipid arter som tilhører ulike klasser IDENTIFISERT av LCMS analyse. (C) prinsippet komponent analyse av metabolitten nivåer over 24 h celle syklus. (D) prinsippet komponent analyse av lipider over 24 h celle syklus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representativt eksempel på protein og stivelse data. A) molekylær funksjonell berikelse av proteiner identifisert ved hjelp av LCMS analyse, treemap trukket med REVIGO 20 B) representant stivelse data viser reproduserbarhet av protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: tilpasset design av fermenter system for temperatur og lufting kontrollert synkron vekst av Chlamydomonas kulturer. Figuren har blitt gjenbrukt fra Juppner, J.et al. 10. please Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: representativt utfall for Proteomikk datakvalitet. Heatmap plottet ved hjelp av beregningsorientert PTXQC verktøyet19. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
| Klokkeslett (min) | % Buffer B til buffer A | |
| 0 til 15 min | Lineær gradering fra 0 to3% | Buffer A: 0,1% maursyre syre i UPLC grade vann |
| 15 til 75 min | Lineær gradering fra 3% til 30% | Buffer B: 0,1% maursyre syre i 60% UPLC klasse acetonitril |
| 75 til 90 min | Lineær gradering fra 30% til 40% | Strømningshastighet 300 nL/min |
| 90 til 94 min | Lineær gradering fra 40% til 90% | Injeksjonsvolum 4 μL |
| 94 to104 min | vask kolonne med 90% | |
| 105 til 120 min | Likevekt kolonnen i 15 minutter ved 3% |
Tabell 1: flytende kromatografi av peptid prøver, graderings parametre.
Tabell 2: liste over proteiner som er identifisert etter LCMS/MS-analyse. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
I denne artikkelen, illustrerte vi en robust og svært gjeldende utvinnings protokoll for omfattende lipidomics, Plantemetabolomikk, stivelse og Proteomikk analyse fra en enkelt pellets på 10-15 x 106 celler. Metoden er implementert i flere studier for et bredt spekter av celler og vev10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Her presenterte vi en trinnvis rørledning for multi-omics analyse av forskjellige biomolekyler fra en enkelt prøve høstet fra Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 Mt +) kultur.
Protokollen gir en robust og reproduserbar tilnærming til å behandle flere prøver på en gang, for analyse av ulike biomolekyler. Imidlertid bør en rekke kritiske skritt bli tatt vare på for å minimere den tekniske varianten. For det første bør høsting av cellene gjøres så raskt som mulig og samtidig opprettholde de ensartede forhold for alle høstet prøver for å bevare den biologiske tilstanden i cellene. Selv om vi brukte sentrifugering å høste cellene, alternative høsting strategier kan brukes til høsting av prøvene. Det er imidlertid viktig å merke seg at ulike høsting strategier er kjent for å påvirke metabolske tilstanden i cellene37 derfor må konsekvent høsting tilnærming brukes for alle eksperimentelle prøver. Dernest er det viktig å unngå tørking av øvre ikke-Polar fase inneholder klorofyll, siden dette kan påvirke nivåene av oppløst klorofyll i løsningsmidlet påvirker normalisering faktor for prøvene. Til slutt, forsiktighet bør utvises mens du fjerner den gjenværende Polar fase for å få protein og stivelse pellet, for å unngå å forstyrre pellet som kan påvirke stivelse og proteininnhold.
Dermed presenteres utvinnings protokoll tilbyr flere fordeler for fler omics dataanalyse. I tillegg til å minimere antall prøve alikvoter som kreves, reduserer det også variasjonen mellom de analytiske resultatene som oppnås for ulike biomolekyler. Dette tillater direkte sammenligning av resultatene innhentet fra de primære metabolitter, lipider og Proteomikk data. Tilsvarende tillater samtidig ekstraksjon av flere sammensatte klasser konsistent og ensartet normalisering strategi av de ulike datasettene. Dette er spesielt aktuelt hvis normalisering er vanskelig å oppnå ved hjelp av tørr eller frisk vekt38 eller celle nummer.
Protokollen kan implementeres for rutinemessig screening av en kompleks biologisk prøve. Disse holistiske metabolomic, lipidomic og Proteomikk datasettene kan tilby omfattende informasjon om systematiske endringer i metabolismen. I tillegg data innhentet fra Proteomikk analyse, gir innsikt i kvantitative (overflod) og kvalitative (modifikasjoner) endringer i proteiner i forhold til metabolitter. Derfor, integrere omics data kunne avsløre inne-dybden opplysninger på endre fremkalt av genetisk eller biotiske og/eller abiotiske forstyrrelser av en Biological system. Dermed Elucidating molekylære endringer av spesifikke metabolske trasé eller cellulære prosesser. På samme måte, disse høy-gjennomstrømming data kan tillate identifisering av mål for metabolsk engineering og avgrense eller test spådommer fra Genova-skala metabolske modeller37,39.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Vi er svært takknemlige for Gudrun Wolter og Änne Michaelis for utmerket teknisk assistanse. Vi vil gjerne takke alle medlemmene av Giavalisco-laboratoriet for deres hjelp. Vi er takknemlige til Max Planck Society for finansiering av forskning og FAPESP for fellesskap av L A Giraldi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
- Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
- Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
- Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
- Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).
- Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).
- Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
- Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
- Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
- Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
- Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).
- Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800 (2011).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).
- Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
- Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
