Summary
Общесистемный анализ нескольких биомолекул имеет решающее значение для получения функционального и механистического понимания биологических процессов. Таким образом, описывается обширный протокол для высокой пропускной произвлечения липидов, метаболитов, белков и крахмала из одного образца, собранного из синхронной культуры chlamydomonas.
Abstract
Микроводоросли были в центре исследований для их применения в производстве дорогостоящих соединений, продуктов питания и топлива. Кроме того, они являются ценными фотосинтетическими моделями, облегчающими понимание основных клеточных процессов. Системные широкие исследования позволяют всесторонне и углубленное понимание молекулярных функций организмов. Тем не менее, несколько независимых образцов и протоколов необходимы для протеомики, липидоми и метаболомики исследований, вводящих более высокую погрешность и изменчивость. Здесь представлен надежный метод экстракции с высокой пропускной стоимостью для одновременной экстракции хлорофилла, липидов, метаболитов, белков и крахмала из одного образца зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Иллюстрированная экспериментальная установка предназначена для культур Chlamydomonas, синхронизированных с использованием 12 ч/12 ч световых/темных условий. Образцы были собраны в течение 24 h цикла клеток, чтобы продемонстрировать, что метаболиты, липиды и крахмал данных, полученных с помощью различных аналитических платформ хорошо соответствует. Кроме того, протеиновые образцы, собранные с использованием того же протокола экстракции, использовались для проведения детального анализа протеомики для оценки их качества и воспроизводимости. На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что иллюстрированный метод обеспечивает надежный и воспроизводимый подход к более глубокому пониманию различных биохимических путей и их функций с большей уверенностью как в базовых, так и на прикладных исследованиях.
Introduction
Микроводоросли являются богатым источником натуральных продуктов (например, топлива, питания человека и животных, косметики и фармакологических веществ). Проводятся многочисленные научно-исследовательские работы по повышению эффективностипроизводства продукции высокой стоимости из микроводорослей 1,2,3,4. Системное понимание метаболизма является предпосылкой для улучшения качества и урожайности натуральных продуктов5,6,7. С появлением функциональных геномных методов и усовершенствованных методов масс-спектрометрии одновременно можно контролировать тысячи генов, стенограмм, белков и метаболитов. Тем не менее, несколько образцов необходимы для углубленной протеомики, липидоми и метаболомики исследований, которые часто трудно достичь в одноклеточных организмов, особенно если время курс исследования должны быть выполнены. Кроме того, сбор и обработка различных выборочных аликвот в сочетании с различными протоколами для сбора весьма сложных омицических данных (т.е. протеомических, липидомных и метаболомик) вводит изменчивость, что делает интеграцию данных сложной задачей.
Chlamydomonas обеспечивает не только отличную микробную систему для исследования клеточных процессов, но и удобную модель для изучения координации клеточного цикла и метаболизма. Соответственно, сильная координация выражения транскриптов с клеточным циклом была показана с помощью транскриптома высокого разрешения, профилирующего синхронную культуру Chlamydomonas8. Около 80% проанализированных стенограмм продемонстрировали надежную периодичность втечение 24 ч клеточного цикла 8. Аналогичным образом, сухой вес, белки, хлорофилл, аминокислоты и жирные кислоты двух различных штаммов chlamydomonas было показано, коррелируют с делением клеток в исследовании, где отбор проб был выполнен каждые 4 ч9. Недавно сообщалось, что метаболит и липидная динамика клеточного сдвига основаны на конкретных фазах клеточного цикла10. Тонкие изменения в различных биомолекулах можно было контролировать с помощью надежного метил-терт-бутилового эфира (MTBE): метанол: метод извлечения на водной основе, который предлагает идеальную отправную точку для всестороннего многовариантного анализа10 , 11.
Представленный протокол направляет через воспроизводимую и эффективную стратегию10, для одновременной экстракции липидов, метаболитов, белков и крахмала из одного образца аликота, на время решена метаболомическая и липидомное исследование синхронно растущих культур Chlamydomonas. В дополнение к иллюстрированию надежных и воспроизводимых метаболических и липидомных данных10, здесь, качество протеомных образцов, полученных из того же гранулы также продемонстрировано.
Protocol
1. Прекультуры Chlamydomonas reinhardtii
- Подготовьте пре-культуры Chlamydomonas reinhardtii (напряжение дикого типа CC-1690 mt) путем переноса клеток из твердых пластин средней TAP в колбы Erlenmeyer с 200 мл HSM среднего12.
- Выращивайте предкультуры на вращающей шейкере при 24 градусах Цельсия при 100 мле-2-1 непрерывного света до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 2 х 106 клеток/мл.
2. Синхронизация хламидомонасных жидких культур в ферментерах
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, представленные в этом протоколе,такие как температура, свет и CO 2, специфичны для синхронизации штамма CC-1690 mt. Для того, чтобы развивать синхронизированную культуру с помощью другого штамма, необходимо проверить оптимальные условия.
- Передача предварительной культуры в систему ферментера (см. Дополнительную рисунок 1 для специального дизайна ферментера), подключенного к рециркуляционному кулеру для поддержания температуры, с восходящей фильтрованным CO2 (2%, v/v) и перемешивают с магнитный перемешивание бар в нижней части ферментера с постоянным возбуждением.
- Чтобы начать синхронизацию, установите ферментен в светло-темном режиме 12:12 ч, под 34 градусами По кс и 200 молесом-2-1 светом и убедитесь, что он содержит 500 мл культуры в среде HSM с плотностью клеток 1 х 106 ячеек/мл.
- В конце 24 ч цикла, повторно разбавить культуру до 1 х 106 клеток / мл со свежим испарителем HSM с минимальным ими возмущения с помощью трубки системы в сочетании с перистальтические насосы, что позволяет сначала насос а также определенное количество культуры, а затем насос а затем насоса в автоклав-стерилизованная среда.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы перистальтическим насокам, прививки шприцы могут быть использованы для вывода культуры, в то время как необходимый объем свежей среды могут быть добавлены непосредственно в ферментера в стерильных условиях. - Повторите шаг 2,3 три раза, чтобы получить синхронизированные культуры на4-й день прививки.
- Для того, чтобы проверить синхронность клеток, урожай образцов с интервалом каждые 2 ч и измерить плотность клеток и объем клеток с помощью клеточного счетчика и размер анализатора (см. Таблица материалов). В зависимости от плотности клеток, разбавить образцы между 1:10 до 1:100 и измерить в диапазоне размеров 30 - 1900 мкм3.
3. Сбор клеток Хламидомонас
- Этикетка 15 мл конические центрифуги труб и подготовить dewar заполнены жидким азотом.
- Образцы урожая с использованием шприца (50 см3)через внутреннюю стеклянную трубку ферментера. Распределите образец по коническим центрифугным трубам, которые должны содержать 10-15 х 106 ячеек. Обратите внимание на объем, передаваемый на каждую трубку, и измерьте плотность клеток и размер ячейки каждой временной точки с помощью анализаля клеток и размера (см. Таблица Материалов)
- Пелле клетки центрифугации в течение 5 мин при 4000 х г. Затем отбросьте супернатант, заморозьте гранулы в жидком азоте, а затем храните при -80 градусов по Цельсию.
4. Подготовка экстракции буферов и экстракции хлорофилла, липидов и метаболитов
ВНИМАНИЕ: Метанол (MeOH) и MTBE являются легковоспламеняющимися и могут вызвать раздражение дыхательных путей, глаз или кожи при длительном воздействии и/или контакте. Пожалуйста, обработайте их тщательно только в дым капоте и использовать соответствующие процедуры безопасности во время извлечения (лабораторное пальто, защитные очки, перчатки и т.д.).
-
Добыча буфер 1
- В объемную колбу объемом 100 мл добавьте 75 мл МТБЕ, 25 мл MeOH (класс UHPLC) и гомогенизируют (3:1, vol/vol).
- Добавьте следующее решение внутренних стандартов: 50 л кортикостерона (1 мг/мл в MeOH), 50 Л Л 1,2-дигептадеканоил-СН-глицеро-3-фосфохолин (17:0 PC) (1 мг/мл в классе ХПЛК), 25 л D-Sorbitol-1-13C (1 мг/мл в воде UHPLC класса).
- Перенесите буфер извлечения в чистую стеклянную бутылку и предварительно охладите раствор при -20 градусов, 1 ч перед использованием. Используйте свежеприготовленный раствор для извлечения. Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 2 недель.
-
Добыча буфер 2
- В объемную колбу объемом 100 мл добавьте 75 мл воды класса UHPLC и 25 мл сорта MeOH UHPLC и гомогенизируют.
- Перенесите буфер извлечения в чистую стеклянную бутылку. Используйте свежий раствор для извлечения. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель.
5. Извлечение хлорофилла, липидов и метаболитов
- Упорядочить трубки, с клетками гранулы (содержащие 10-15 х 106 клеток), в жидком азоте.
- Отрежь яточные гранулы в каждой трубке с 1 мл предварительно охлажденных (-20 градусов по Цельсию) Извлечения буфер 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг быстро, чтобы избежать испарения буфера извлечения низкой вязкости. После добавления буфера извлечения 1, поддерживать трубки при комнатной температуре. - Vortex до тех пор, пока клетки хорошо гомогенизированы в смеси экстракции и aliquot смесь в 2 мл микроцентрифуговой трубки.
- Сножайте культуры с помощью звуковой ванны (см. Таблица материалов) в ледяной охлажденной воде в течение 10 минут.
- Инкубировать все образцы на орбитальной шейкере при 1000 об/мин в течение 60 мин при 4 градусах Цельсия.
- Чтобы вызвать фазовое разделение, добавьте 650 злителка извлечения буфера 2.
- Вихрь кратко следуют центрифугации на 20000 х г в течение 5 мин при 4 кв. C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага, есть разделение жидких фаз и твердых гранул в нижней части трубки. Обработать трубки с осторожностью, чтобы избежать смешивания двух жидких фаз. Верхняя фаза MTBE содержит липиды и хлорофилла, в то время как нижняя фаза содержит полярные и полуполярные метаболиты. Осажденные гранулы на дне содержат белки, крахмал и другие нерастворимые молекулы.
6. Алицитирование фракций
- Передача 500 л верхней фазы MTBE (липидов) в прописную трубку 1,5 мл. Сухие образцы с помощью вакуумного концентратора (см. Таблицаматериалов) и хранить при -80 градусов по Цельсию до измерения.
- Удалите оставшуюся фазу MTBE с помощью пипетки объемом 200 л.
- Передача 650 л нижней фазы (полярные и полуполярные метаболиты) в новую маркированную трубку. Сухие образцы с помощью вакуумного концентратора (см. Таблицаматериалов) и хранить при -80 градусов по Цельсию до измерения.
- Удалите оставшуюся нижнюю фазу, снимая избыточный объем.
- Заморозить твердые гранулы в жидком азоте и хранить при -80 градусах Цельсия до дальнейшей добычи.
7. Определение полярных метаболитов (первичных метаболитов)
- Приостановить высушенные гранулы полярной фазы (шаг 6.3) в метоксиамино-гидрохлорид/пиридин раствор для метоксимизации групп углерода.
- Нагрейте образцы при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 90 мин.
- Дериватизировать образцы с N-метил-N-триметилзилтрифлократидамид (MSTFA) в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию, как описано ранее13.
- Используйте газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией во времени полета (GC-TOF-MS) для анализа первичных метаболитов. Используемые параметры градиента были в соответствии с ранее описанным протоколом14.
8. Определение неполярных метаболитов (липиды)
- Повторноприостановить высушенные гранулы неполярной фазы (шаг 6.1) в смеси ацетонитрила:изопропанола (7:3, v:v).
- Центрифуга на 20000 х г и отдельно на обратной фазе C8 колонки (100 мм х 2,1 мм х 1,7 мм частиц), используя систему UPLC (см. Таблица материалов). Двумя мобильными фазами были вода с 1% 1 М ацетат аммония, 0,1% уксусной кислоты (буфер A), и ацетонитрил: изопропанол (7:3), содержащий 1% 1 M ацетат аммония, 0,1% уксусной кислоты (Буфер B).
- Используйте параметры градиента в соответствии с ранее описанным протоколом14.
9. Определение содержания хлорофилла
- Смешайте 100 зл mtBE-фазы (шаг 6.1) с 900 зл и 90% метанола для метода пустой, а также экспериментальных образцов.
- Измерьте абсорбцию с помощью спектрофотометра на длине волны 665 нм и 652 нм, чтобы различать хлорофилл а и хлорофилл b.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поглощение должно варьироваться от 0,1 до 1 для действительного расчета концентрации. При необходимости разбавить образцы. - Рассчитайте содержание хлорофилла и b, а также общее содержание хлорофилла в соответствии со следующими формулами.
Chla 16.82A665 - 9.28A652
Chlb 36.92A652 - 16.54A665
Хлаб ю 0,28А665 й 27,64А652
ПРИМЕЧАНИЕ: Формулы были описаны Бар-Нун и Охад15.
10. Извлечение и определение содержания белка, пищеварение и анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Для повторной приостановки белка, гранулы мочевины / thiourea буфер (6 M мочевины, 2 M thioureaand протеазы и ингибиторы фосфатазы) был использован с изменениями в протоколе ранее описанные16. Тем не менее, любой буфер выбора может быть использован для повторного протеина.
- Приготовьте белковый буфер, используя следующие концентрации: 6 M мочевины и 2 M тиуреа.
- Растворите гранулы (шаг 6,5) в 200 кЛ белкового буфера (10,1).
- Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 30 мин, затем центрифугацию при температуре 20000 х г в течение 5 мин.
- Перенесите супернатант, содержащий белки, в новую трубку.
- Определить концентрацию белка Брэдфорд анализ17.
- Digest 50 мкг белка в растворе с протоколом выбора. Здесь используйте следующий протокол.
- Уменьшите 50 мкг образцов белка с помощью 5 мМ DTT в течение 30 мин, а затем алкилирование с помощью 10 мМ йодоацетамида в течение 30 минут при комнатной температуре в темное время суток.
- Добавить трипсин / Lys-C Mix на 25:1 белка: коэффициент протеазы (w /w), смешать и инкубировать в течение 3 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Разбавить образцы шесть складок с помощью 50 мм TrisHCl (pH 8) и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию.
- Прекратите пищеварение путем добавления трифтороацетической кислоты (TFA) до конечной концентрации 0,5-1%.
- После пищеварения, выполнять опреснения пептидов до масс-спектрометрии с помощью C18 этап советы и увядшие переваренные пептиды18.
- Сосредоточьте образцы на почти сухость, оставляя 2-5 л раствора в вакуумном концентраторе (см. Таблица Материалов)без нагрева.
- Приостанавливайте пробы в погрузочном буфере (5% ацетонитрила, 0,5% для мической кислоты) и проанализируйте пептидные смеси с помощью масс-спектрометра высокого разрешения (см. ТаблицаМатериалов), подключенного к системе nano-UPLC.
- Разделите пептиды с помощью системы UPLC (см. Таблица Материалов) на 20 см обратной фазе заряженной поверхности гибрида (CSH) колонки (см. Таблицаматериалов) с внутренним диаметром 75 мкм и размером частицы 1,7 мкм.
- Загрузите 4 л образца и протяните через 90 мин градиента при скорости потока 300 нл/мин.
- Установите градиент. Используйте частичные настройки петли-оффлайн с изократическим градиентом, установленным на уровне 3% буфера B (99,9% ацетонитрила и 0,1% для модной кислоты), удерживаемых в течение 14 минут, прежде чем цикл будет перенесен в онлайн-позицию с столбцом, после чего градиент увеличивается линейно в течение 50 мин, до 20% буфер B достигается.
- В течение следующих 15 минут, увеличить концентрацию буфера B до 30%. Затем в следующие 15 минут, увеличить буфер B до 40%, до достижения 90% от буфера B после еще 4 мин. Выполните шаг стирки, которая необходима для очистки колонки, на 400 нл/мин и удерживайте еще 10 мин (см. таблицу 1 для детального градиента условиях).
- Наконец, установите обратно систему на скорость потока 300 nL/min и концентрацию 3% буфера B в течение 1 мин. Равновесие столбца в течение 15 минут до вводился следующий образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список идентифицированных белков после анализа LCMS/MS представлен в таблице 2.
11. Извлечение и определение содержания крахмала
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения общего содержания белка и крахмала, твердые гранулы были извлечены в двухэтапной процедуре, как описано ранее10.
- Добавьте 500 кЛ 80% (v/v) этанола в клеточную гранулу (шаг 6.5) и инкубировать в течение 10 минут при 80 градусах Цельсия.
- Центрифуга при температуре 4000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем растворить гранулы в 250 л стерильной воды с последующим добавлением 250 л 100 мМ ацетата натрия.
- Гидролизуем крахмал путем нагрева 3 ч при 99 градусах По Цельсию. Переварить растворенный крахмал в глюкозу мономеров на ночь, добавив ферментную смесь из амилозы (4,2 единицы на образец) и -amyloglucosidase (10 единиц на образец). Инкубировать трубки при 37 градусах Цельсия на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации, образцы могут быть заморожены при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких дней, или при -80 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев, до измерения глюкозы. - Центрифуге переваренный экстракт на 20000 х г в течение 5 мин и собирать супернатант. Растворите супернатант (с полугодовыми мономерами глюкозы) в 100 мМ HEPES-буфера (pH 7), который содержит 5 мМ МГКл2,60 мг/мл АТп, 36 мг/мл НАДП и глюкозу-6-фосфат-дегидрогеназы (1 единица на образец).
- Для того, чтобы проанализировать содержание крахмала, сначала измерьте базовое абсорбцию на уровне 340 нм. Затем добавьте гексокиназу (1 единица на образец), чтобы начать реакцию. Наконец, измерьте увеличение NADPH-H (с указанием уровня крахмала, переваренных в глюкозу) на 340 нм с 96-наилучшим считывателем пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разница максимального значения в 340 нм (не должна превышать линейный диапазон 1) и базовый эквивалент концентрации глюкозы переваренных крахмала. Кривая глюкозы должна быть сделана, чтобы определить концентрацию глюкозы в нмоль глюкозы на мл.
Representative Results
Chlamydomonas reinhardtii Синхронизация культуры CC-1690
Чтобы продемонстрировать репрезентативные результаты данного протокола, мы представляем пример многоомичных данных, полученных после сбора и извлечения образцов из синхронизированных культур Chlamydomonas reinhardtii 10. Синхронные культуры Chlamydomonas состоят из клеток, принадлежащих к единой фазе роста в определенный момент времени. Культуры Chlamydomonas были синхронизированы на 12 h/12 h свет/темный цикл, 34 c с интенсивностью света 200 s-1и концентрация CO2 2%, v/v, описано как оптимальная концентрация для напряжения CC-1690 mt» 10 . Эти условия были ранее оптимизированы и проверены с использованием различных параметров клеточного цикла10. На рисунке 1 отображается распределение размеров ячеек, измеренное с помощью Coulter Counter в различных временных точках синхронизированных культур. Сдвиг в объеме клетки можно наблюдать, как клетки растут в размерах на протяжении всей фазы света, а затем освобождение дочерних клеток, начиная с конца световой фазы от 10 ч. После того, как все дочерние клетки освобождены, сдвиг в объеме клетки можно наблюдать, как недавно выпустила дочерние клетки удаляются, чтобы начать следующий цикл 10 (Рисунок 1).
Сбор проб, обработка и -добыча
Быстрая сбор проб осуществляется с использованием центрифугации, и после отбрасывания супернатанта гранулы могут храниться при -80 градусов до извлечения. Как описано выше (шаг 5), извлечения MTBE приводит в трех различных фазах: а) органическая фаза была использована для измерения липидов, а также уровни хлорофилла (коэффициент нормализации), б) полярная фаза была собрана для измерения метаболитов на GCMS в то время как, в) гранулы были использованы для измерения содержания крахмала и белков. Обзор распределения различных этапов и их занятости иллюстрируется на рисунке 2.
Полярные и неполярные метаболиты
На основе анализа GCMS полярной фракции, 65 метаболитов были аннотированы, покрывая аминокислоты, нуклеиновые кислоты, промежуточные гликолиза, глюконеогенеза, трикарбоксиловатового кислотного цикла, пентоза фосфата пути и полиаминов(рисунок 3A). Анализ LCMS нейтральной фазы, содержащей липиды, привел к выявлению 204 различных видов липидов, охватывающих различные классы липидов, а именно фосфатидилглицерол, фосфатидилатаноламин, сульфокиновозил диацилглицерол, monogalactosyldiacylglycerols, digalactosyldiacylycerols, diacylgceryltrimethylhomoserine, жирные кислоты, диацилглыцериды и триацилгллицериды. Для визуализации глобальных сдвигов в метаболитах и липидах в клеточном цикле был использован анализ основных компонентов (PCA). PCA отображает разделение светлых и темных фаз как для метаболомики, так и для липидомных данных. Кроме того, полуциклический (частично открытый круг) можно заметить для обоих данных(рисунок 3C,D). Частичное зазор в круговой схеме объясняется тем фактом, что образцы на 24 ч клеточного цикла были собраны в темное время суток в отличие от образцов, собранных в начале клеточного цикла после 0,25 ч воздействия света (Рисунок 3C ,D).
Анализ белков и крахмала
Для изучения качества белковых гранул, полученных в результате извлечения MTBE, для протеомического анализа было использовано 6 образцов. Качество данных протеомики, полученных путем переваривания 50 мкг белка/образца, было изучено с помощью вычислительного инструмента контроля качества -Proteomics контроль качества (PTX-C)19, что свидетельствует о воспроизводимых и высокое качество протеомики данных, полученных из все репликации(Дополнительная диаграмма 1). Молекулярное функциональное покрытие белков было исследовано с помощью REVIGO20. Обзор функционального обогащения 2463 идентифицированных белков (см. Таблицу2), представлен на рисунке 4A. Остальные гранулы после извлечения белка был использован для воспроизводимой количественной оценки крахмала, о чем свидетельствует низкое стандартное отклонение среди различных репликантов(рисунок 4B).
Рисунок 1: Иллюстративный пример изменений объема клеток на различных этапах клеточного цикла в Chlamydomonas reinhardtii. X-ось, представляющая объем ячейки, в то время как y-оси, представляющая число клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Иллюстрированный рабочий процесс для занятости различных фаз во время многономических извлечения клеточных гранул. Цифра была повторно использована у Juppner, J.et al. 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентатный пример метаболитов и липидов, выявленных с помощью описанного протокола. (A) Метаболит классов, определенных анализом GCMS. (B) Липидные виды, принадлежащие к различным классам, выявленные в анализе LCMS. (C) Принцип анализа компонентов уровня метаболита через 24 ч клеточного цикла. (D) Принцип анализа компонентов липидов через 24 h клеточного цикла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативный пример данных о белках и крахмале. A) Молекулярное функциональное обогащение белков, выявленных с помощью анализа LCMS, карты дерева, составленной с использованием РЕВИГО 20 B) репрезентативных данных крахмала, отображающих воспроизводимость протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Индивидуальный дизайн системы ферментера для температуры и аэрации контролируемый синхронный рост культур Chlamydomonas. Цифра была повторно использована у Juppner, J.et al. 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная диаграмма 2: Представительный результат для качества данных протеомики. Тепловая карта построена с помощью вычислительного инструмента PTX-C19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Время (мин) | % Буфер B в буфер A | |
| От 0 до 15 мин | Линейный градиент от 0 до 3% | Буфер A: 0,1% для модной кислоты в воде класса UPLC |
| от 15 до 75 мин | Линейный градиент от 3% до 30% | Буфер B: 0,1% для меновой кислоты в 60% UPLC класса ацетонитрила |
| от 75 до 90 мин | Линейный градиент от 30% до 40% | Скорость потока 300 нл/мин |
| от 90 до 94 мин | Линейный градиент от 40% до 90% | Объем инъекций 4 Зл |
| от 94 до 104 мин | мыть ежеколонку с 90% | |
| от 105 до 120 мин | Равновесие колонны в течение 15 мин при 3% |
Таблица 1: жидкая хроматография пептидных образцов, градиентные параметры.
Таблица 2: Список белков, выявленных после анализа LCMS/MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
В этой статье мы проиллюстрировали надежный и очень применимый протокол извлечения для комплексной липидоми, метаболомики, крахмала и протеомики анализа из одной гранулы из 10-15 х 106 клеток. Метод был успешно внедрен в нескольких исследованиях для широкого спектра клеток и тканей10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Здесь мы представили пошаговый конвейер для многоомичного анализа различных биомолекул из одного образца, собранного из культуры Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt).
Протокол обеспечивает надежный и воспроизводимый подход к обработке нескольких образцов одновременно, для анализа различных биомолекул. Вместе с тем необходимо принять ряд важных мер, с тем чтобы свести к минимуму технические различия. Во-первых, сбор клеток должен проводиться как можно быстрее при сохранении единых условий для всех собранных образцов для сохранения биологического состояния клеток. Хотя мы использовали центрифугирование для сбора клеток, альтернативные стратегии сбора урожая могут быть использованы для сбора образцов. Тем не менее, важно отметить, что различные стратегии уборки, как известно, влияют на метаболическое состояние клеток37 следовательно, последовательный подход к уборке должны быть использованы для всех экспериментальных образцов. Во-вторых, важно избегать высыхания верхней неполярной фазы, содержащей хлорофилл, так как это может влиять на уровни растворенного хлорофилла в растворителе, влияющих на коэффициент нормализации образцов. Наконец, следует позаботиться при удалении оставшейся полярной фазы, чтобы получить белок и крахмал гранулы, чтобы избежать нарушения гранулы, которые могут влиять на содержание крахмала и белка.
Тем самым представленный протокол экстракции предлагает несколько преимуществ для анализа данных с несколькими омиками. Помимо минимизации требуемого количества образцов аликвот, это также уменьшает различия между аналитическими результатами, полученными для различных биомолекул. Это позволяет прямо сравнивать результаты, полученные из первичных метаболитов, липидов и протеомных данных. Аналогичным образом, одновременная добыча нескольких сложных классов позволяет последовательно и единообразно стратегии нормализации различных наборов данных. Это особенно применимо, если нормализация трудно достичь с помощью сухого или свежего веса38 или номер ячейки.
Протокол может быть реализован для регулярного скрининга сложного биологического образца. Эти целостные метаболомические, липидомные и протеомные наборы данных могут предоставить исчерпывающую информацию о систематических изменениях в обмене веществ. Кроме того, данные, полученные в результате анализа протеомики, дают представление о количественных (изобилии) и качественных (модификациях) изменениях в белках по отношению к метаболитам. Таким образом, интеграция данных омики может выявить углубленную информацию об изменениях, вызванных генетическими или биотическими и/или абиотические возмущения биологической системы. Таким образом, выяснение молекулярных изменений конкретных метаболических путей или клеточных процессов. Аналогичным образом, эти высокопроизводительные данные могут позволить идентификацию целей для метаболической инженерии и уточнить или проверить прогнозы из генома масштаба метаболических моделей37,39.
Disclosures
Авторы не раскрытии информации.
Acknowledgments
Мы очень благодарны Гудруну Вольтеру и Анне Михаэлису за отличную техническую помощь. Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Giavalisco за их помощь. Мы благодарны Обществу Макса Планка за финансирование исследований и FAPESP для стипендий L A Giraldi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
- Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
- Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
- Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
- Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).
- Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).
- Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
- Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
- Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
- Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
- Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).
- Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800 (2011).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).
- Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
- Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
