Summary
Systemomfattande analys av flera biomolekyler är avgörande för att få funktionella och mekanistiska insikter i biologiska processer. Härmed beskrivs ett omfattande protokoll för hög genomströmning utvinning av lipider, metaboliter, proteiner och stärkelse från ett enda prov skördats från synkroniserade Chlamydomonas kultur.
Abstract
Mikroalger har varit i fokus för forskning för sina tillämpningar i produktionen av högt värde föreningar, mat och bränsle. Dessutom är de värdefulla fotosyntetiska modeller som underlättar förståelsen av de grundläggande cellulära processerna. Systemomfattande studier möjliggör omfattande och djupgående förståelse av organismernas molekylära funktioner. Emellertid, flera oberoende prover och protokoll krävs för proteomik, lipidomik och metabolomik studier införa högre fel och variation. En robust hög genomströmning extraktion metod för samtidig utvinning av klorofyll, lipider, metaboliter, proteiner och stärkelse från ett enda prov av den gröna Alga Chlamydomonas reinhardtii presenteras här. Den illustrerade experimentella installationen är för Chlamydomonas kulturer synkroniseras med 12 h/12 h ljus/mörker förhållanden. Prover samlades in över en 24 h cell cykel för att visa att de metaboliter, lipider och stärkelse data som erhållits med hjälp av olika analytiska plattformar är väl utformade. Dessutom användes protein prov som samlats in med samma extraktionsprotokoll för att utföra detaljerad proteomikanalys för att utvärdera deras kvalitet och reproducerbarhet. Baserat på data kan man dra slutsatsen att den illustrerade metoden ger en robust och reproducerbar metod för att främja förståelsen av olika biokemiska vägar och deras funktioner med större förtroende för både grundläggande och tillämpad forskning.
Introduction
Mikroalger är en rik källa av naturliga produkter (t. ex. bränslen, human-och djurfoder, kosmetika och farmakologiska ämnen). Ett stort antal forskningsinsatser görs för att effektivisera produktionen av produkter av hög värde från mikroalger1,2,3,4. System-nivå förståelse av metabolism är en förutsättning för att förbättra kvaliteten och avkastningen av naturliga produkter5,6,7. Med tillkomsten av funktionella genomiska tekniker och förbättrade masspektrometrimetoder kan tusentals gener, avskrifter, proteiner och metaboliter övervakas samtidigt. Emellertid, flera prover krävs för djupgående proteomik, lipidomik och metabolomik studier, som ofta är svåra att uppnå i encelliga organismer, särskilt om tid kurs studier ska utföras. Dessutom introducerar insamling och bearbetning av olika prov alikvoter i kombination med olika protokoll för att samla in de mycket komplexa omics-data (dvs. proteomik, lipidomic och metabolomics) variation, vilket gör integrationen av data a utmanande uppgift.
Chlamydomonas ger inte bara ett utmärkt mikrobiellt system för utredning av cellulära processer, men också en praktisk modell för att studera samordningen av cellcykeln och metabolism. Följaktligen har en stark samordning av transkriptioner uttryck med cell Cycle visats med högupplöst transkriptome profilering av synkroniserad kultur av Chlamydomonas8. Omkring 80% av de analyserade transkriptioner uppvisade robust periodicitet över en 24 h cell cykel8. Likaså visades torrvikt, proteiner, klorofyll, aminosyror och fettsyror av två olika stammar av Klamydomonas korrelera med celldelning i en studie där provtagning utfördes var 4 h9. Nyligen rapporterades det att metaboliten och lipiddynamiken i cell skiftet baserat på specifika faser av cellcykeln10. De subtila förändringarna i olika biomolekyler var möjliga att övervaka med hjälp av en robust metyltert-butylleter (MTBE): metanol: vattenbaserad extraktionsmetod, som erbjuder en idealisk utgångspunkt för omfattande multiomics-analys10 , 11.
Det presenterade protokollet vägleder genom en reproducerbar och effektiv strategi10, för samtidig utvinning av lipider, metaboliter, proteiner och stärkelse från ett enda prov alikvot, för tiden löst metabolomiska och lipidomikprofildata studie av synkrona växande Chlamydomonas kulturer. Förutom att illustrera de robusta och reproducerbara metaboliska och lipidomiska data10, här demonstreras också kvaliteten på de proteomiska proverna som erhålls från samma pellet.
Protocol
1. pre-kulturer av Chlamydomonas reinhardtii
- Förbered pre-kulturer av Chlamydomonas reinhardtii (stam Wild typ CC-1690 MT +) genom att överföra celler från fasta plattor av Tap medium till Erlenmeyer kolvar med 200 ml av HSM medium12.
- Odla pre-kulturer på en vridning shaker vid 24 ° c på 100 μmol · m-2· s-1 kontinuerligt ljus tills CELLTÄTHETEN når ~ 2 x 106 celler/ml.
2. synkronisering av Chlamydomonas flytande kulturer i fermenterare
Obs: parametrarna som presenteras i detta protokoll, såsom temperatur, ljus och CO2, är specifika för synkronisering av stammen CC-1690 MT +. För att utveckla en synkroniserad kultur med hjälp av en annan stam, är det nödvändigt att testa de optimala förhållandena.
- Överföra för kulturen till ett fermentersystem (se kompletterande figur 1 för den skräddarsydda fermenterings konstruktionen), ansluten till en recirkulerande kylare för att bibehålla temperaturen, med bubblande av filtrerad Co2 (2%, v/v) och rörs med en magnetisk rör bar på botten av fermenteraren med ständig agitation.
- För att initiera synkroniseringen, Ställ in fermenteraren vid ljus-mörk regim på 12:12 h, under 34 ° c och 200 μmol · m-2· s-1 ljus och se till att den innehåller 500 ml kultur i HSM medium med en celltäthet av 1 x 106 celler/ml.
- I slutet av 24 h cykel, återspäda kulturen till 1 x 106 celler/ml med färskt HSM medium med minimal störning genom att använda ett rörsystem i kombination med Peristaltiska pumpar, som gör det möjligt att först pumpa en distinkt mängd kultur ut och efteråt pumpa i autoklav-steriliserat medium.
Anmärkning: som ett alternativ till Peristaltiska pumpar, vaccinerande sprutor kan användas för att dra tillbaka kulturen, medan den begärda volymen av färskt medium kan tillsättas direkt i fermenteraren under sterila förhållanden. - Upprepa steg 2,3 tre gånger för att erhålla de synkroniserade kulturerna den 4: e dagen av inympningen.
- För att validera Synchrony av celler, skörd prover med ett intervall av varje 2 h och mäta celltäthet och cell volym med hjälp av en cell räknare och storlek Analyzer (se tabell över material). Beroende på celltäthet, späd proverna mellan 1:10 till 1:100 och mät i ett storleksintervall på 30 – 1900 μm3.
3. skörd Chlamydomonas celler
- Märk 15 mL koniska centrifugrör och Förbered en Dewar fylld med flytande kväve.
- Skörda prover med hjälp av en spruta (50 cm3) genom det inre glaset röret av fermenteraren. Fördela provet i koniska centrifugrör som bör innehålla 10-15 x 106 celler. Anteckna volymen som överförs till varje rör och mät CELLTÄTHETEN och cellstorleken för varje tidspunkt med hjälp av cell räknare och storleks analys (se tabell över material)
- Pelleten cellerna genom centrifugering för 5 min vid 4000 x g. Kassera sedan supernatanten, frys pellets i flytande kväve och senare förvara vid-80 ° c.
4. beredning av extraktionsbuffertar och extraktion av klorofyll, lipider och metaboliter
FÖRSIKTIGHET: metanol (MeOH) och MTBE är brandfarliga och kan orsaka irritation av andningsvägar, ögon eller hud vid långvarig exponering och/eller kontakt. Hantera dem noga endast i en draghuv och Använd lämpliga säkerhetsprocedurer under extraktionen (labbrock, skyddsglasögon, handskar etc.).
-
Extraktion buffert 1
- I en 100 mL mätkolv, tillsätt 75 mL MTBE, 25 mL MeOH (UHPLC-sort) och homogenisera (3:1, Vol/Vol).
- Tillsätt följande lösning för intern standard: 50 μL kortikosteron (1 mg/mL i MeOH), 50 μL 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-fosfokolin (17:0 st) (1 mg/mL i kloroform HPLC-kvalitet), 25 μL ampicillin (1 mg/mL i vatten UHPLC-sort) och 50 μL av D-sorbitol-1-13C (1 mg/mL i vatten UHPLC-klass).
- Överför extraktionsbufferten till en ren glas flaska och förkyl lösningen vid-20 ° c, 1 h före användning. Använd nyberedd lösning för extraktioner. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° c i upp till 2 veckor.
-
Extraktion buffert 2
- I en 100 mL mätkolv, tillsätt 75 mL vatten UHPLC-sort och 25 mL MeOH UHPLC-sort och homogenisera.
- Överför extraktionsbufferten till en ren glas flaska. Använd färsk lösning för extraktioner. Denna lösning kan förvaras i rumstemperatur i flera veckor.
5. extraktion av klorofyll, lipider och metaboliter
- Ordna rören, med cellpelleten (som innehåller 10-15 x 106 celler), i flytande kväve.
- Omsuspendera cellpelleten i varje tub med 1 mL förkyld (-20 ° c) extraktionsbuffert 1.
Anmärkning: utför detta steg snabbt för att undvika avdunstning av låg viskositet extraktion buffert. Efter tillsats av extraktionsbuffert 1, underhålla rören vid rumstemperatur. - Vortex tills cellerna är väl homogeniserade inom extraktion blandningen och alikvot blandningen i 2 mL microcentrifug röret.
- Sonikera kulturerna med hjälp av ultraljudsbehandling bad (se tabell över material) i iskylda vatten för 10 min.
- Inkubera alla prover på en orbitalskak vid 1000 rpm under 60 min vid 4 ° c.
- För att inducera fasseparation, tillsätt 650 μL extraktion buffert 2.
- Vortex kort följd av centrifugering på 20000 x g i 5 min vid 4 ° c.
Anmärkning: efter detta steg, det finns en separation av flytande faser och en solid pellet i botten av röret. Hantera rören med försiktighet för att undvika blandning av de två vätske faserna. Den översta MTBE-fasen innehåller lipider och klorofyll, medan den nedre fasen innehåller Polar och semipolära metaboliter. Den utfälld pelleten i botten innehåller proteiner, stärkelse och andra olösliga molekyler.
6. Ali citerar fraktioner
- Överför 500 μL av övre MTBE-fas (lipider) till en märkt 1,5 mL tub. Torka proverna med en vakuum koncentrator (se tabell över material) och förvara vid-80 ° c fram till mätningen.
- Ta bort den återstående MTBE-fasen med en 200 μL pipett.
- Överför 650 μL av den nedre fasen (Polar och semipolära metaboliter) till en ny märkt tub. Torka proverna med en vakuum koncentrator (se tabell över material) och förvara vid-80 ° c fram till mätningen.
- Ta bort den återstående nedre fasen genom att Pipettera av överskottsvolymen.
- Frys den fasta pelleten i flytande kväve och förvara vid-80 ° c tills ytterligare extraktion.
7. bestämning av polära metaboliter (primära metaboliter)
- Omsuspendera den torkade pelleten av Polar fasen (steg 6,3) i methoxyamine-hydroklorid/pyridinlösning för metoximisering av karbonylgrupper.
- Värm proverna vid 37 ° c i 90 min.
- Derivatize proverna med N-metyl-N-trimetylsilyltrifloracetamid (MSTFA) i 30 min vid 37 ° c som beskrivs tidigare13.
- Använd gaskromatografi kopplad till masspektrometri vid tidpunkten för flygning (GC-TOF-MS) för att analysera de primära metaboliterna. De gradientparametrar som användes var enligt det tidigare beskrivna protokoll14.
8. bestämning av icke-polära metaboliter (lipider)
- Återsuspendera den torkade pelleten av icke-polär fas (steg 6,1) i en blandning av acetonitril: isopropanol (7:3, v:v).
- Centrifugera vid 20000 x g och separera på en omvänd fas C8-kolonn (100 mm × 2,1 mm × 1,7 μm partiklar), med hjälp av ett UPLC-system (se tabell över material). De två rörliga faserna var vatten med 1% 1 M ammoniumacetat, 0,1% ättiksyra (buffert A) och acetonitril: isopropanol (7:3) innehållande 1% 1 M ammoniumacetat, 0,1% ättiksyra (buffert B).
- Använd övertoningsparametrarna enligt det tidigare beskrivna protokoll14.
9. bestämning av klorofyll innehåll
- Blanda 100 μL av MTBE-fasen (steg 6,1) med 900 μL av 90% metanol för en metod som är tom samt de experimentella proverna.
- Mät absorbansen med spektrofotometer med en våglängd på 665 nm och 652 Nm för att skilja mellan klorofyll a och klorofyll b.
Obs: absorptionen bör variera mellan 0,1 och 1 för giltig koncentrations beräkning. Späd proverna om det behövs. - Beräkna klorofyll a och b innehåll, och även den totala klorofyll innehållet enligt följande formler.
CHLa = 16.82 a665 – 9.28 a652
CHLb = 36.92 a652 – 16.54 a665
CHLa = b = 0,28 a665 + 27.64 a652
Notera: formlerna beskrevs av bomma för-nunna och Ohad15.
10. extraktion och bestämning av proteinhalten, matsmältningen och analysen
Anmärkning: för att Omsuspendera proteinet användes pellet urea/thiourea buffert (6 M urea, 2 M tioureaoch proteas och fosfatashämmare) med ändringar i protokollet som tidigare beskrivits16. Emellertid, någon buffert val kan användas för resuspension av proteiner.
- Bered proteinbufferten med hjälp av följande koncentrationer: 6 M urea och 2 M tiourea.
- Lös upp pelleten (steg 6,5) i 200 μL proteinbuffert (10,1).
- Inkubera proverna i rumstemperatur i 30 min, följt av centrifugering vid 20000 x g i 5 minuter.
- Överför supernatanten, som innehåller proteinerna, till ett nytt rör.
- Bestäm protein koncentrationen av Bradford assay17.
- Smälta 50 μg protein i lösningen med ett utmärkt protokoll. Här använder du följande protokoll.
- Minska 50 μg protein prov med 5 mM DTT i 30 minuter följt av alkylering med 10 mM iodoacetamid i 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Tillsätt trypsin/LYS-C mix på ett 25:1 protein: proteasförhållandet (w/w), blanda och inkubera i 3 h vid 37 ° c.
- Späd proverna sex veck med 50 mM TrisHCl (pH 8) och inkubera över natten vid 37 ° c.
- Avsluta matsmältningen genom att tillsätta trifluorättiksyra (TFA) till en slutlig koncentration på 0,5 – 1%.
- Efter matsmältningen, utföra avsaltning av peptiderna före masspektrometri med hjälp av C18 Stage tips och eluera de smält peptider18.
- Koncentrera proverna till nära torrhet och lämna 2-5 μL lösning i en vakuum koncentrator (se tabell över material) utan upphettning.
- Omsuspendera proverna i lastbuffert (5% acetonitril, 0,5% myrsyra) och analysera peptidblandningar av LC-MS/MS med hjälp av en högupplöst masspektrometer (se tabell över material) som är ansluten till ett nano-UPLC-system.
- Separera peptiderna med hjälp av UPLC-systemet (se tabell över material) på en 20 cm omvänd fas laddad yta hybrid (CSH) kolumn (se tabell över material) med en innerdiameter på 75 μm och en partikelstorlek på 1,7 μm.
- Fyll på 4 μL prov och Spring genom 90 min lutning med en flödeshastighet på 300 nL/min.
- Ställ in övertoningen. Använd partiell loop-offline inställningar med isokratiska gradient inställd på 3% av buffert B (99,9% acetonitril + 0,1% myrsyra) som hölls i 14 min innan slingan skiftas till online position med kolonnen, därefter lutningen ökas linjärt för 50 min, tills 20% buffert B har uppnåtts.
- Inom de närmaste 15 min, öka koncentrationen av buffert B till 30%. Sedan i följande 15 min, öka buffert B till 40%, innan de når 90% av buffert B efter ytterligare 4 min. utför tvättsteget, vilket krävs för att rengöra kolonnen, vid 400 nL/min och håll i ytterligare 10 min (se tabell 1 för detaljerad gradient villkor).
- Slutligen, ställa tillbaka systemet till en flödeshastighet av 300 nL/min och en koncentration av 3% buffert B inom 1 min. Equilibrate kolonnen för 15 min innan nästa prov injiceras.
Obs: en fullständig förteckning över identifierade proteiner efter LCMS/MS-analys presenteras i tabell 2.
11. extraktion och bestämning av stärkelsehalten
Anmärkning: för bestämning av total halt av protein och stärkelse extraherades den fasta pelleten i ett tvåstegsförfarande som beskrivits tidigare10.
- Tillsätt 500 μL av 80% (v/v) etanol till cellpelleten (steg 6,5) och inkubera i 10 minuter vid 80 ° c.
- Centrifugera vid 4000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Lös sedan pelleten i 250 μL sterilt vatten följt av tillsats av 250 μL 100 mM natriumacetat.
- Hydrolysera stärkelsen genom upphettning i 3 h vid 99 ° c. Smälta den upplösta stärkelsen till glukos monomerer över natten genom att tillsätta en Enzymblandning av α-amylas (4,2 enheter per prov) och α-amyloglukosidas (10 enheter per prov). Inkubera rören vid 37 ° c över natten.
Anmärkning: efter inkubering kan proverna frysas vid-20 ° c i några dagar, eller vid-80 ° c i flera månader, före glukos mätningar. - Centrifugera det smälta extraktet vid 20000 x g i 5 min och samla supernatanten. Lös upp supernatanten (med stärkelsebaserade glukomonomerer) i 100 mM HEPES-buffert (pH 7) som innehåller 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP och glukos-6-fosfat-dehydrogenas (1 enhet per prov).
- För att analysera stärkelsehalten, först mäta baslinjen absorbans vid 340 nm. Tillsätt sedan hexokinas (1 enhet per prov) för att påbörja reaktionen. Slutligen mäta ökningen av NADPH + H+ (indikerar nivå av stärkelse smälta till glukos) vid 340 nm med en 96-brunn plattan läsare.
Anmärkning: skillnaden i maximivärdet vid 340 nm (bör inte överstiga det linjära intervallet 1) och baslinjen motsvarar glukos koncentrationen av den smälta stärkelsen. En glukos kurva bör göras för att bestämma glukos koncentrationen i nmol av glukos per mL.
Representative Results
Mer från Chlamydomonas reinhardtii CC-1690 kultur synkronisering
För att visa de representativa resultaten för det givna protokollet presenterar vi exempel på multiomics-data som erhållits efter skörd och extraktion av prover från synkroniserade Chlamydomonas reinhardtii -kulturer10. Synkroniserade kulturer av Klamydomonas består av celler som tillhör en enhetlig tillväxtfas vid en viss tidpunkt. Den Chlamydomonas kulturer synkroniserades vid 12 h/12 h ljus/mörker cykel, 34 ° c med ljusintensitet på 200 μmol · m-2· s-1 och co2 koncentrationen of2%, v/v, beskrivs som optimal koncentration för stam CC-1690 MT +10 . Dessa villkor hade tidigare optimerats och validerats med hjälp av olika cell cykel parametrar10. Bild 1 visar cell storleksfördelning mätt med Coulter räknare vid skilda tidpunkter av synkroniserade kulturer. En förskjutning i cell volymen kan observeras när cellerna växer i storlek under ljus fasen, följt av frisläppandet av dotterceller som börjar vid slutet av ljus fasen från 10 timmar. När alla dotterceller släpps, kan Skift i cell volymen observeras som de nyutgivna dottercellerna är inställda på att börja nästa cykel 10 (figur 1).
Provtagning-skörd,-hantering och-extraktion
Snabb skörd av prover utförs med hjälp av centrifugering och efter kassering av supernatanten kan pelletsen förvaras vid-80 ° c till extraktion. Som beskrivits ovan (steg 5), MTBE extraktion resulterar i tre distinkta faser: a) organisk fas användes för att mäta lipider samt klorofyll nivåer (normaliserings faktor), b) Polar fasen samlades in för att mäta metaboliter på GCMS medan c) pelleten användes för att mäta stärkelseinnehåll och proteiner. En översikt över fördelningen av olika faser och deras anställning illustreras i figur 2.
Polära och icke-polära metaboliter
Baserat på GCMS-analys av Polar fraktionen, 65 metaboliter var kommenterade, som omfattar aminosyror, nukleinsyror, intermediärer av glykolys, gluconeogenes, trikarboxylsyracykeln Acid cykel, pentos fosfat väg och polyaminer (figur 3a). LCMS-analysen av neutral fas som innehåller lipider ledde till identifiering av 204 distinkta lipidarter som täcker olika lipidklasser nämligen fosfatidylglyceroler, fosfatidyletanolamin, sulfoquinovosyl diacylglycerols, monogalactosyldiacylglycerols, digalactosyldiacylglycerols, diacylglyceryltrimetylhomoserin, fettsyror, diacylglycerider och triacylglycerider. För att visualisera de globala förändringarna i metaboliter och lipider över cellcykeln användes huvudkomponent analys (PCA). PCA visar en separation av ljusa och mörka faser för både metabolomik och lipidomikprofildata data. Dessutom kan en semi-cyklisk (delvis öppen cirkel) märkas för båda data (figur 3c, D). Den partiella klyftan i det cirkulära mönstret tillskrivs det faktum att proverna vid 24 timmar av cellcykeln samlades in under mörker i motsats till de prover som samlats in i början av cellcykeln efter 0,25 h exponering för ljuset (figur 3c , D).
Protein-och stärkelse analys
För att undersöka kvaliteten på den proteinpellet som erhållits till följd av MTBE-extraktion användes 6 prover för proteomisk analys. Kvaliteten på proteomik-data som erhålls genom att smälta 50 μg protein/prov, undersöktes med hjälp av ett datoriserad kvalitetskontrollverktyg-proteomik Quality Control (PTXQC)19, vilket indikerar reproducerbar och hög kvalitet på proteomik data som erhållits från alla replikat (kompletterande figur 1). Den molekylära funktionella täckningen av proteiner undersöktes med REVIGO20. En översikt över funktionell berikning av de 2463 identifierade proteinerna (se tabell 2) presenteras i figur 4a. Den kvarvarande pelleten efter protein utvinning användes för reproducerbar kvantifiering av stärkelse enligt indikationen låg standardavvikelse mellan olika replikat (figur 4b).
Figur 1: belysande exempel på förändringar i cell volymen i olika faser av cellcykeln i Chlamydomonas reinhardtii. X-axeln som representerar cell volymen medan y-axeln representerar cellnumret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: illustrerat arbetsflöde för anställning av olika faser under multi-omics extraktion cell pellets. Figuren har återanvänts från Juppner, J.et al. 10. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativt exempel på metaboliter och lipider som identifierats med hjälp av det beskrivna protokollet. A) metaboliska klasser som identifierats genom GCMS-analys. B) lipidarter som tillhör olika klasser som identifierats genom LCMS-analys. (C) princip komponent analys av metaboliten nivåer över 24 h cell cykel. (D) princip komponent analys av lipider över 24 h cell cykel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativt exempel på protein-och stärkelse data. A) molekylär funktionell berikning av de proteiner som identifierats med hjälp av LCMS-analys, trädkarta som ritats med revigo 20 B) representativa stärkelse data som visar protokollets reproducerbarhet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: anpassad design av fermentersystemet för temperatur och luftning kontrollerad synkron tillväxt av Chlamydomonas kulturer. Figuren har återanvänts från Juppner, J.et al. 10. vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 2: representativt utfall för proteomik datakvalitet. Heatmap plottas med hjälp av Computational PTXQC verktyg19. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
| Tid (min) | % Buffert B för att buffra A | |
| 0 till 15 min | Linjär gradient från 0 TO3% | Buffert A: 0,1% myrsyra i vatten av UPLC-kvalitet |
| 15 till 75 min | Linjär gradient från 3% till 30% | Buffert B: 0,1% myrsyra i 60% UPLC-kvalitet acetonitril |
| 75 till 90 min | Linjär gradient från 30% till 40% | Flödeshastighet 300 nL/min |
| 90 till 94 min | Linjär gradient från 40% till 90% | Injektionsvolym 4 μL |
| 94 to104 min | tvättkolonnen med 90% | |
| 105 till 120 min | Equilibrate kolonnen i 15 min vid 3% |
Tabell 1: vätskekromatografi av peptidprover, gradientparametrar.
Tabell 2: förteckning över proteiner som identifierats efter LCMS/MS-analys. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
I denna artikel, vi illustrerade en robust och mycket tillämplig extraktion protokoll för omfattande lipidomik, metabolomics, stärkelse och proteomik analys från en enda pellet av 10-15 x 106 celler. Metoden har genomförts framgångsrikt i flera studier för ett brett spektrum av celler och vävnader10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Här presenterade vi en stegvis pipeline för multiomics-analys av olika biomolekyler från ett enda prov som skördats från Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 MT +)-kulturen.
Protokollet ger en robust och reproducerbar metod för att bearbeta flera prover på en gång, för analys av olika biomolekyler. Ett antal kritiska steg bör dock tas om hand för att minimera den tekniska variationen. För det första bör skörd av cellerna göras så snabbt som möjligt samtidigt som de enhetliga villkoren för alla skördade prover bibehålls för att bevara cellernas biologiska tillstånd. Även om vi använde centrifugering för att skörda cellerna, kan alternativa skörde strategier användas för skörd av proverna. Det är dock viktigt att notera att olika skörde strategier är kända för att påverka det metabola tillståndet i cellerna37 därför måste konsekvent avverknings metod användas för alla experimentella prover. För det andra är det viktigt att undvika uttorkning av den övre icke-polära fasen som innehåller klorofyll, eftersom detta kan påverka halterna av upplöst klorofyll i lösningsmedlet som påverkar normaliserings faktorn för proverna. Slutligen, försiktighet bör iakttas när du tar bort den återstående Polar fasen för att få protein och stärkelse pellets, för att undvika att störa pelleten som kan påverka stärkelse och proteinhalt.
Därmed presenteras Extraction Protocol erbjuder flera fördelar för flera omics dataanalys. Förutom att minimera antalet prov portioner som krävs, minskar också variationen mellan de analytiska resultat som erhålls för olika biomolekyler. Detta möjliggör direkt jämförelse av de resultat som erhålls från de primära metaboliterna, lipider och proteomiska data. På samma sätt möjliggör samtidig utvinning av flera sammansatta klasser konsekvent och enhetlig normaliserings strategi för de olika datauppsättningarna. Detta gäller särskilt om normalisering är svårt att uppnå med torr eller färsk vikt38 eller cell nummer.
Protokollet kan genomföras för rutinmässig screening av ett komplext biologiskt prov. Dessa holistiska metabolomic, lipidomikprofildata och proteomiska datauppsättningar kan erbjuda omfattande information om systematiska förändringar i metabolismen. Dessutom, de data som erhållits från proteomik analys, ger insikter i den kvantitativa (överflöd) och kvalitativa (ändringar) förändringar i proteiner i förhållande till metaboliterna. Att integrera data från omics kan därför avslöja fördjupad information om förändringar som induceras av genetiska eller biotiska och/eller abiotiska störningar i ett biologiskt system. Således, belysa molekylära förändringar av specifika metaboliska vägar eller cellulära processer. På samma sätt kan dessa data med högt dataflöde tillåta identifiering av mål för den metaboliska tekniken och förfina eller testa förutsägelser från genomskalningsmetaboliska modeller37,39.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Vi är mycket tacksamma mot Gudrun Wolter och Änne Michaelis för utmärkt teknisk assistans. Vi vill tacka alla medlemmar i Giavalisco Lab för deras hjälp. Vi är tacksamma till Max Planck Society för finansiering av forskning och FAPESP för gemenskap av L A Giraldi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
- Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
- Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
- Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
- Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).
- Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).
- Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
- Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
- Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
- Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
- Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).
- Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800 (2011).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).
- Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
- Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
