Summary
طرق لاعداد وتوصيف الخواص الفيزيائية الكيميائية والنشاط الحيوي من المضادة للحمض المشحون ، وقدمت الأس الهيدروجيني المستجيبة لل النانويه. وتناقش معايير نجاح siRNA ادويه النانويه مثل الحجم ، والتشكل ، وتهمه السطح ، والتحميل siRNA ، وإسكات الجينات.
Abstract
يعتمد نجاح siRNA كدواء جزيئي مستهدف علي تسليم السيتوسيوليك الفعال إلى الخلايا داخل انسجه الامراض. تم تحقيق النجاح السريري لعلاج الأهداف التي كانت في السابق "غير قابله للتوصيل" للامراض الكبدية مع siRNA. ومع ذلك ، فان الولادة الفعالة سيرنا تتطلب اعتبارات التصميم الدوائية الاضافيه ، بما في ذلك وقت التداول الطويل ، والتهرب من أجهزه التخليص (علي سبيل المثال، الكبد والكلي) ، واختراق الورم والاحتفاظ به. هنا ، ونحن وصف الاعداد وفي المختبر الفيزيائية/البيولوجية توصيف الجسيمات النانويه البوليمريه المصممة لكفاءة التسليم siRNA ، وخاصه إلى الانسجه غير الكبدية مثل الأورام. ويتم اعداد جسيمات نانويه siRNA بواسطة المعقدة الكهربائية من siRNA و diblock كوبوليمر بولي (الاثيلين جلايكول-b-[2-(ديميثيلامينو) ايثيل ميثريلات-المشترك بوتيل ميثاكريلات]) (PEG-DB) لتشكيل المجمعات polyion ( بوليبليكسيس) حيث يتم عزل siRNA داخل النواة polyplex و PEG يشكل الإكليل المائي ، المحايدة المشحونة. وعلاوة علي ذلك ، فان كتله DB يصبح غشاء-lytic كما حويصلات من المسار endolysosomal (< pH 6.8) ، مما اثار الهروب الباطني والتسليم عصاري خلوي من sirna. طرق لتوصيف الخصائص الفيزيائية الكيميائية من الجسيمات النانويه siRNA مثل الحجم ، والشحن السطحي ، وتشكل الجزيئات ، و siRNA التحميل موصوفه. يتم قياس النشاط الحيوي لجسيمات نانويه sirna باستخدام لوسيفيراز كجين نموذج في الجينات السريعة والعالية الانتاجيه إسكات الفحص. وتعتبر التصاميم التي تمر هذه الاختبارات الاوليه (مثل بوليبليكسيس القائم علي الوتد DB) مناسبه للترجمة إلى الدراسات الحيوانية قبل السريرية تقييم تسليم siRNA إلى الأورام أو مواقع أخرى من علم الامراض.
Introduction
لان سيرناس تمنع ترجمه البروتينات من تسلسلات mrna ، فانها يمكن نظريا ان تستخدم للمخدرات جميع الامراض المعروفة1،2،3،4،5. ومع ذلك ، فان استخدام sirna في الطب محدود من قبل الشخصية الدوائية الفقيرة بشكل شامل من جزيئات sirna6،7. عند حقنها عن طريق الوريد ، يتم مسح سيرناس بسرعة من خلال الكلي و/أو المتدهورة من قبل نوكليسيس8،9. نظرا لحجمه الكبير والشحنة السالبة ، لا يمكن ل sirna إدخال الخلايا أو الهروب من المسار endolysosomal للوصول إلى مجمع إسكات الناجمة عن الجيش النيبالي الريبي (risc) الذي يقيم في عصارة10،11،12، 13-الآن التالي ، فقد ركزت الجهود المكثفة علي تصميم وتنفيذ استراتيجيات التسليم في سيرنا14. وقد ركز هذا الجهد إلى حد كبير علي تطوير المواد النانويه المستندة إلى الدهون والبوليمر التي حزمه sirna ، حمايته من التطهير والتدهور في الجسم المجري ، والبدء في امتصاص الخلوية والهروب الباطني من خلال مجموعات الأمين موجب المؤين. وقد تم الإبلاغ عن العديد من النجاحات قبل السريرية ومؤخرا, وقد تم الإبلاغ عن النجاح السريرية الاولي ل جسيمات متناهي المستندة إلى الولادة سيرنا الكبدية لعلاج وراثي transthyretin-توسط (حطاب) الداء النشواني15.
هناك العديد من الجينات المسببة للسرطان التي هي حاليا "غير قابله للتوصيل" من قبل الصيدلة التقليدية (اي ، المخدرات جزيء صغير) ، وتحفيز تصميم النانويه سيرنا البوليمر (si-NPs) لعلاج السرطان16. ومع ذلك ، هناك مجموعه منفصلة من معلمات التصميم التي يجب النظر فيها للتسليم غير الكبدي سيرنا. يجب ان نظام التسليم حماية المسؤول موجب من polyplex الذي يسبب التراص داخل الدورة الدموية الجهازية17,18,19. لولادة الورم ، علي وجه التحديد ، si-NP الاستقرار أمر ضروري لمنح الدورة الدموية الطويلة ، التالي زيادة تراكم داخل الأورام عن طريق نفاذيه معززه والاحتفاظ (الثوري) تاثير20،21. وعلاوة علي ذلك ، السيطرة علي حجم si-NP أمر ضروري لان الجسيمات النانويه فقط حوالي 20-200 nm القطر في حجم الرافعة المالية الثورية22، وأصغر Si-NPs (~ 20-50 nm القطر) معرض تحسين تغلغل الورم علي جسيمات نانويه أكبر حجما الجسيمات المجهرية23.
لمعالجه هذه القيود تصميم اضافيه لولادة الورم الجهازية من siRNA بعد الاداره الوريدية ، وقد وضعت المحايدة ، والاستجابة لدرجه الحموضة si-NPs (الشكل 1)24. هذه si-NPs هي PEGylated ، أو في الاونه الاخيره ، Zwitterionated25، لتهمه سطح محايد ومقاومه لامتصاص البروتين والانحلال في الدورة الدموية. نظرا لأنها لا يمكن ان تعتمد فقط علي الطابع موجب لدفع التسليم داخل الخلايا ، الهروب الباطنية فعاله للغاية أمر حتمي لتحقيق إسكات الجينات قويه. وبناء علي ذلك ، فان جوهر هذه si-NPs يتكون من نواه التنظير الباطني للغاية التي هي خاملة في الأس الهيدروجيني خارج الخلية (7.4) ، ولكن الذي يتم تشغيله بطريقه تشبه التبديل في الظروف المحمضة للمسار اندوليسومال [pH 6.8 (التنظير المبكر) – 5.0 ( lysosomes)]. وأخيرا ، فان مزيجا من المحتوي الموجب والمسعور داخل النواة الاساسيه لل si-NPs يوفر كلا من قوات تثبيت الاستقرار الكهروستاتيكية والكهربائية ، مما يحسن استقرار القوه الخاصة بالدم مقارنه بالنظم المجردة.
التكامل بين العديد من الوظائف في تصميم بسيط نسبيا هو ممكن باستخدام العكس بالاضافه إلى تجزئه سلسله نقل (طوف) التي تسيطر عليها البلمره لإنتاج البوليمرات مع الهندسة المعمارية المعقدة وتكوين دقيق. لإنتاج si-NPs مع تهمه سطح محايد ، الأس الهيدروجيني الاستجابة ، والاستقرار NP ، ويستخدم الطوافة لتوليف بولي (الاثيلين جلايكول-b-[2-(ديميثيلامينو) ايثيل ميثاكريليت-المشترك بوتيل ميثاكريلات]) (PEG-DB ؛ الشكل 1 (ا). PEG-DB هو بالكهرباء المعقدة مع siRNA ، وتشكيل si-NPs مع الكورونا شماعة و DB/siRNA الاساسيه (الشكل 1B). PEG تشكل طبقه مائية خاملة ومشحونة بالتحييد علي كورونا si-NP. كتله DB يتكون من 50:50 المولي نسبه 2-(ديميثيلامينو) ايثيل ميثلات (DMAEMA) وبوتيل ميثاكريليت (النقد الخاص). الموجبة DMAEMA المجمعات بالكهرباء سلبيا مشحونة siRNA. الشركاء الذاتيين لمؤسسه نقد البحرين داخل النواة NP بواسطة التفاعلات فان دير فالس ، وزيادة الاستقرار NP. معا ، DMAEMA والنقد الخاص نقل السلوك الدهني المعتمد علي الأس الهيدروجيني إلى كتله البوليمر DB. في الأس الهيدروجيني خارج الخلية ، يتم عزل كتله DB إلى النواة si-NP وخاملة إلى الطبقات الدهنية. في ظل الظروف الحمضية ، مثل تلك الموجودة في المسار اندوليسومال ، DMAEMA المؤين داخل كتله DB يسهل تاثير الإسفنج البروتون ، حيث يؤدي التخزين المؤقت الباطني إلى تورم اوموتيك وتمزق26. بالاضافه إلى ذلك ، فان الجماليات المائية التي تسبب رهاب الماء داخل كتله DB تدمج بشكل فعال في الطبقات الدهنية الشحمية ، مما يؤدي إلى انحلال التنظير الباطني القوي. وهكذا ، يتم معقده siRNA مع PEG-DB لتشكيل si-NPs التي هي محايده-مشحونة ومستقره للغاية في درجه الحموضة خارج الخلية ولكن الذي يعطل الطبقات الدهنية في الحموضة الحمضية ، وضمان التسليم السيتووليك من حموله siRNA.
وهنا وصفت الإجراءات التجريبية لإنتاج si-NPs من PEG-DB. يتم عرض ومناقشه طرق توصيف المعلمات الفيزيائية الكيميائية والنشاط الحيوي ل si-NPs. [أين وردر تو] سريعا قيمت [س-نب] [بيوكتيفيتي], استعملت [لوسيفيتاز] كمورثه نموذجيه ل [كالجن] دراسات. اليراع Luciferase هو البروتين المسؤول عن ' توهج ' من الحشرات27. وبناء علي ذلك ، فان الخلايا الثديية التي تمر بالجينات الملتقطة لليراع الضوئي تنتج توهجا "متوهجا" يمكن الإمساك به باستخدام مقياس الاناره لقياس مستويات تعبير لوسيفيرياز. هنا ، ونحن نستخدم Luciferase لتقييم النشاط الحيوي لل si-NPs من خلال تقديم siRNA ضد Luciferase وتحديد كميه الانخفاض المقابلة في التلالؤ الإحيائي في الخلايا التعبير Luciferase مقارنه بالخلايا التي تتلقي siRNA تدافعت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-اعداد وتوصيف المصادر الكترونيه
- اعداد si-NP
- تذوب البوليمر في 10 ملم العازلة حامض الستريك (pH 4.0) في 3.33 mg/mL. البوليمر يمكن أولا ان يذوب في تركيز 10x في الايثانول لضمان انحلال.
ملاحظه: يمكن أذابه البوليمر عند تركيزات اقل ، ولكن استخدام التركيزات فوق 3.33 mg/mL يمكن ان يمنع تشكيل NP متجانسة. - أضافه siRNA (50 μM في diH2O) ليؤدي إلىN +:P- نسبه 10. مزيج البوليمر والحلول siRNA تماما عن طريق الأنابيب والسماح لاحتضان لمده 30 دقيقه. وN +:P- نسبه يمثل عدد من مجموعات أمين المشحونة إيجابيا علي البوليمر إلى عدد من مجموعات الفوسفات المشحونة سلبا علي sirna ويتم حسابه من قبل الصيغة أدناه:
حيث ، مول Pol هو المبلغ المولي من البوليمر ، RU أمين هو عدد من تكرار وحدات من الأمينات مشحونة إيجابيا لكل البوليمر ، مول siRNA هو المبلغ المولي من siRNA ، و bp siRNA هو عدد من أزواج قاعده لكل جزيء siRNA. - أضافه 5 اضعاف الزائدة من 10 ملم العازلة الفوسفات (pH 8.0) وتخلط برفق اما عن طريق الأنابيب أو عكس الأنبوب. للتاكد من ان درجه الحموضة النهائية محايده (~ 7.2-7.5) ، ماصه 10 μL من محلول si-NP علي شرائط اختبار درجه الحموضة.
ملاحظه: يتم اعداد المخازن المؤقتة حمض الستريك والفوسفات وفقا لمخططات مركز المرجع العازلة ميليبور سيغما.
- تذوب البوليمر في 10 ملم العازلة حامض الستريك (pH 4.0) في 3.33 mg/mL. البوليمر يمكن أولا ان يذوب في تركيز 10x في الايثانول لضمان انحلال.
- الخواص الفيزيائية الكيميائية لل si-NPs
- تسجيل حجم وشحن السطح من الناتجة si-NPs باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS). اعداد عينه DLS عن طريق تصفيه 1 مل من si-NPs (0.1-1.0 mg/mL) من خلال مرشحات الحقنه المسام حجم 0.45 μm في الكوارتز مربع أو البوليسترين cuvette. حجم السجل وقياسات الشحن السطحي باستخدام أداه DLS وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- تاكيد حجم وتشكل si-NPs عن طريق تحليل التصوير باستخدام المجهر الكترون انتقال (TEM).
- أضافه 5 μL من si-NP الحل في 1 مغ/مل إلى شبكات TEM واحتضان ل 60 s. لطخه جافه لمده 3 ليالي.
- أضف 5 ميكرولتر من محلول خلات اليورانيل 3% وحضن لمده 20 ثانيه. لطخه جافه لمده 3 ليالي. الشبكات الجافة بين عشيه وضحيها تحت التجفيف.
- شبكات الصور وفقا للبروتوكول الذي تم إنشاؤه لاستخدام المجهر المحدد.
- تميز تحميل sirna في si-NPs في مختلف N +:P-النسب باستخدام التخلف هلام الاغاروز.
- لإنتاج 2 ٪ هلام اجنشا ، أضافه 2 غرام من الكهربائي الصف اجنشا مسحوق إلى 100 مل من 1x تاي (تريس-خلات-أدتا) العازلة في pH 8.0. أثاره لتعليق اجثار. الحرارة التي تم كشفها في الميكروويف حتى يتم حل جميع اجنشا (1-3 دقيقه).
- مره واحده تبريد ، أضافه 5 μL من بروميد ايثيديوم (10 ملغ/مل في ح2س) ، وتخلط جيدا. يسكب الخليط في صينية الهلام ويوضع المشط لإنتاج الآبار ، ويترك ليجف لمده 30 دقيقه. أزاله المشط بعناية لترك خلف الآبار التحميل ، وملء صينية هلام إلى خط التعبئة ماكس مع 1x العازلة تاي.
- توليد si-NPs (وفقا للاجراء أعلاه) في 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, و 40N +:P-النسب . ضع 2 μl القسامات من صبغ التحميل (لا SDS والحد من وكلاء) علي الفيلم البارافين لكل صياغة si-NP. مزيج 10 μL من si-NP الحل مع صبغ التحميل علي الفيلم البارافين بواسطة ماصه.
- أضافه si-NP/تحميل حلول صبغ لآبار هلام اجبرزت. تشغيل مصدر الجهد في 100 V لمده 35 دقيقه (أو حتى اجتازت العينات 80 ٪ من طول هلام).
- تصور عصابات siRNA علي مصباح الاشعه فوق البنفسجية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- تاكيد حجم وتشكل si-NPs عن طريق تحليل التصوير باستخدام المجهر الكترون انتقال (TEM).
2-تحديد النشاط البيولوجي الأنبوبي لل si-NPs
- ضربه قاضيه من نموذج الجينات لوسيفيراز
- توليد لوسيفيراز si-nps (وفقا للاجراء أعلاه) باستخدام لوسيفيراز sirna وتدافعت si-nps باستخدام تسلسل sirna تدافعت كعنصر تحكم. Formوالدو علي حد سواء si-NPs في نفس النهائيN +:P- نسبه وعلي النسبة المثلي التي حددتها الدراسات التخلف هلام الاغاروز. يتم تضمين تسلسلات siRNA المثال في جدول المواد.
- البذور luciferase-التعبير عن الخلايا [MDA-ميغابايت-231/Luciferase (Bsd) خلايا مستقره] في 96-حسنا لوحات الجدران السوداء في كثافة 2,000 خلايا لكل بئر. السماح بالتزام بين عشيه وضحيها في وسائل الاعلام الكاملة (DMEM ، 10 ٪ المنفذة) في حاضنه (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، 95 ٪ الرطوبة).
- تمييع si-NPs في وسائل الاعلام المصل الكامل لحجم النهائي من 100 μL لكل بئر و siRNA تركيز 100 nM. علاج الخلايا لمده 24 ساعة مع si-NPs.
- بعد 24 ساعة ، وأزاله العلاجات واستبدال وسائل الاعلام مع المصل كامل الوسائط التي تحتوي علي 150 ميكروغرام/مل D-luciferin. احتضان الخلايا لمده 5 دقائق قبل قياس التلالؤ علي قارئ لوحه أو في نظام التصوير الضوئي الجسم البصري وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- استبدل وسائل الاعلام المحتوية علي luciferin بوسائل الاعلام الطازجة والكاملة ، واحتضان 24 ساعة اضافيه. كرر الخطوة أعلاه ، وأزاله وسائل الاعلام واستبدال مع وسائل الاعلام المصل الكامل التي تحتوي علي 150 ميكروغرام/مل D-luciferin ، تليها حضانة 5 دقائق قبل قياس التلالؤ في 48 h timepoint.
- للدراسات الطولية ، والحفاظ علي خلايا تحت ظروف معقمه في حين قياس التلالؤ. الاستمرار في الثقافة في وسائل الاعلام الطازجة والكاملة بين القياسات بعد استبدال التي تحتوي علي luciferin.
ملاحظه: سيختلف تركيز siRNA المناسبة مع مختلفه si-NPs وجزيئات siRNA. عند استخدام بوليبليكسيس ذات الرسوم المحايدة مع نواه التنظير الداخلي (علي سبيل المثال ، PEG-DB) ، 100 nM هو عاده جيد التحمل من قبل الخلايا وتنتج > 75 ٪ الضربة القاضية. نسبه كتله من PEG-DB إلى siRNA في 10 N +:P- نسبه و 100 NM العلاجات sirna (علي افتراض 26 bp sirna) هو 23.3 ، اي ، أضافه 23.3 NG من PEG-DB لكل 1.0 ng من sirna. علي سبيل المثال ، أضافه 1.16 μL من 3.33 mg/mL البوليمر ل 166.5 ng من siRNA لعلاج بئر واحده في 100 nM في لوحه 96-حسنا (100 حجم وسائل الاعلام mL في بئر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعض الخصائص الاساسيه لفعالية si-NPs لفي الجسم الحيوي التسليم siRNA هي الحجم المناسب (~ 20-200 nm القطر) ، siRNA التعبئة والتغليف ، والجينات إسكات النشاط الحيوي. وفي حين ان هذه القائمة ليست شامله (كما تناولتها المناقشة) ، فانه ينبغي تاكيد هذه الخصائص الاساسيه قبل النظر في اجراء مزيد من الاختبارات للصيغة.
ويوضح الشكل 2 توصيف الحجم SI-NP والشحنة السطحية عند التركيب. وتستخدم DLS و TEM كاساليب تكميليه لمراقبه حجم si-NP (علي حد سواء) ، والتشتت (DLS) ، والمورفولوجية (TEM). وتبين قياسات DLS ان si-NP 1 لديها متوسط قطر 35 نانومتر ، والتوزيع الأحادي الأحادي المشار اليه بوجود ذروه واحده ، والمشتتات المنخفضة المشار اليها بعرض ذروه ضيقه نسبيا (الشكل 2A). القياسات TEM تؤكد قياس حجم من DLS ، وتشير إلى وجود السكان موحده من si-NPs ، وتكشف عن المورفولوجية كرويه من si-NPs (الشكل 2C). DLS و TEM القياسات من si-NP 2 تكشف ان لديها حجم غير مرغوب فيه (> 200 نانومتر قطر) من متوسط قطر 1,500 نانومتر ، والمتعددة الوسائط والسكان متعددة التفريق ، والمجاميع في الحل ، وتشكيل لا تشكل الجسيمات متميزة (الشكل 2B، D ). كل من si-NPs 1 و 2 عرض تهمه سطح محايد ، المشار اليها بالقرب من الصفر يعني القيم المحتملة زيتا (الشكل 2E).
وتتميز كفاءه التحميل من sirna في si-NPs باستخدام فحص التخلف هلام الاغاروز. الأمم المتحدة المعقدة سيرنا تهاجر من خلال هلام الاغاروزها وتصور (بسبب ربط بروميد ايثيديوم) في أسفل هلام. عندما يتم المعقدة sirna مع البوليمر لتشكيل si-NPs ، يتم عرقله الهجرة من خلال هلام الاغاروز ويتم تصور sirna في اعلي هلام (أو حيث تم تحميله في الآبار). النسبة لقاعده الارتباط الذاتي المستندة إلى الوتد-DB ، تزداد التعقيدات مع زيادة عدد ال:P-النسب حتى يتحقق التعقيد الكامل في ~ 10-20 n +:P- نسبه (الشكل3).
ويستخدم luciferase كنموذج الجينات للتقييم السريع للجينات si-NP إسكات النشاط الحيوي. القياسات التلالؤ عن طريق قارئ لوحه أو في نظام التصوير الضوئي المجرية تسمح للقياس الكمي السريع ، عاليه الانتاجيه من التعبير البروتين لوسيفيراز في شكل لوحه جيدا. هذا الأسلوب هو أسرع بكثير, أرخص, واقل إرهاقا من تحليل الجينات إسكات من خلال التحليلات الجزيئية التقليدية مثل PCR (التعبير الجيني) ولطخه الغربية (التعبير البروتين). بهذه الطريقة ، يتم التعامل مع الخلايا لوسيفيراز-التعبير مع لوسيفيراز si-nps وتدافعت si-nps (كعنصر تحكم) ، ويتم احتساب النشاط لوسيفيراز ٪ عن طريق مقارنه اشاره التلالؤ إلى الخلايا غير المعالجة. النشطة بيولوجيا لوسيفيراز si-NPs سيحمل انخفاضا كبيرا% لوسيفيراز النشاط بالمقارنة مباشره إلى التحكم التدافع si-np ، كما يمكن ان ينظر إلى si-np 1 في الشكل 4. في المقابل ، لا تعتبر لوسيفيراز si-NPs التي لا تقلل من نسبه النشاط لوسيفيراز بالمقارنة مع سيطرة si-np المخفوقة (مثل si-np 2) النشطة بيولوجيا (الشكل 4). في كثير من الأحيان 48 h هو الوقت الأقصى إسكات الجينات (الشكل 4) ، ولكن لاحظنا إسكات الجينات كبيره في نقاط زمنيه تتراوح بين 24 h إلى 240 h بعد العلاج.
الشكل 1 كيمياء البوليمر و si-NP التخطيطي. (ا) التركيب الكيميائي ل peg-DB diblock كوبوليمر التي يؤلف si-NPs و يمنح تهمه سطح محايد (كتله PEG) والسلوك استجابه pH (DB كتله). (ب) التجميع الذاتي لل Si-NPs. في pH 4.0 ، كتله DB هو للذوبان في الماء لان الأمينات DMAEMA الثالثية هي protonated للغاية. كتله DB المشحونة بشكل إيجابي بالكهرباء المجمعات المشحونة سلبيا جزيئات سيرنا. ثم يتم تعديل درجه الحموضة إلى ~ 7.4 باضافه 5x pH 8.0 الفوسفات العازلة ، مما ادي إلى "هيدروفوبيزيشن" من كتله DB وتنحيه من siRNA و DB داخل النواة من si-NPs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 DLS و TEM توصيف الحجم si-NP ، تهمه السطح ، والمورفولوجية. (A ، C) SI-np 1 يمثل عينه موحده مع الحجم المناسب (~ 50-100 nm القطر) ، في حين ان (B ، D) si-NP 2 قد شكلت المجاميع غير مرغوب فيه ، كبيره ومتعددة التشتت. (ه) تعرض كل من Si-NPs شحنه سطحيه شبه محايده (إمكانات زيتا). تمثل أشرطه الخطا خطا قياسيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 Agarose هلام التخلف مقايسة لتقييم si-NP سيرنا تحميل الكفاءة. اختفاء عصابات siRNA في أسفل هلام تشير إلى التعقيد من siRNA إلى البوليمر. البوليمر المركب siRNA غير قادر علي الهجرة من خلال هلام التالي تصور في الأعلى من هلام بالقرب من ابار التحميل. كما N +:P- زيادة نسبه ، المعقدة sirna يزيد ، كما هو مبين من شده انخفاض الفرقة sirna في أسفل هلام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 [س-نب-توسط] [كسد] من النموذج مورثه [لوسيفياسي] في [لوسيفيتاز] [MDA-مب-231] خلايا. النشاط لوسيفيراز في (ا) 24 h و (ب) 48 h بعد العلاج مع اما تدافعت si-nps أو لوسيفيراز si-nps في10 N +:P- نسبه و 100 nM الجرعة sirna. % يتم احتساب النشاط luciferase عن طريق تقسيم اشاره التلالؤ من عينات العلاج (المخفوقة و luciferase) بواسطة اشاره التلالؤ من الخلايا غير المعالجة. ملاحظه: [س-نب] 1 يمثل صيغه فعاله مع مورثه يسكت [بيوكتيفيتي], حيث ان [س-نب] 2 يمثل صيغه دون مورثه يسكت [بيوكتيفيتي]. (*) يشير إلى فرق كبير إحصائيا (p < 0.05) مقارنه بالمجموعة المخفوقة للحصول علي تركيبه في وقت معين. تمثل أشرطه الخطا خطا قياسيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تشكيل si-NPs الموصوفة هنا من قبل جمعيه كهرباء من البوليمرات انييوني سيرنا و موجب في مجمعات polyion (بوليبليكسيس). يتم تسهيل المعقدة إلكتروستاتي من sirna وكتله db موجب من البوليمرات PEG-db عن طريق الاختلاط في انخفاض درجه الحموضة (4.0). في pH 4.0 ، DMAEMA هو protonated للغاية ، التالي كتله DB مشحونة للغاية. وهذا يضمن ان البوليمرات تذوب كالاحاديات في الحل بدلا من تشكيل مذيلات وان المجمعات DB بكفاءة مع sirna. وفي وقت لاحق ، يتم تعديل درجه الحموضة من المحلول إلى محايد (pH 7.4) ، مما تسبب في ' هيدروفوبيزاتيون ' من كتله DB ، وتشكيل micelle ، والفخ من siRNA المعقدة داخل لب بوليبليكسيس الناتجة. وقد صممت هذه بوليبليكسيس بحيث PEG تشكل هيدروفيليك ، قذيفة خاملة حول الاساسيه DB/siRNA ، مما ادي إلى تهمه سطح محايده التي هي ضرورية للاداره الجهازية. وترد الكيمياء البوليمر وعمليه تشكيل polyplex في الشكل 1.
والتوصيف الفيزيائي الكيميائي الدقيق لهذه الاسلحه ضروري لتحديد ما إذا كانت التركيبات مناسبه للانتقال إلى الاختبار البيولوجي. الحجم ، وتهمه السطح ، وشكل الجسيمات/المورفولوجية هي جميع المعلمات الهامه التي يمكن ان تؤثر علي الأداء البيولوجي. لإيصال الجهازية إلى الأورام ، وينبغي ان ينخفض حجم si-NP بين 20-200 nm القطر22، وتشير معظم الدراسات الاخيره 20-50 nm جزيئات قطر هي مثاليه23. يجب ان تكون الشحنة السطحية محايده أو سالبه قليلا للتقليل من امتصاص البروتين والانحلال البصري28. وقد حققت الدراسات في العلاقة بين شكل الجسيمات والدوائية/أزاله الجسيمات ، مما يوحي الجسيمات مع ارتفاع نسبه الارتفاع مرغوب فيه علي جزيئات كرويه29،30،31. ومع ذلك ، حتى الآن جزيئات كرويه لا تزال الأكثر شيوعا ، وعلي حد علمنا ، هي شكل الجسيمات الوحيدة التي ترجمت إلى الدراسات البشرية في مجال الأورام.
ومن المهم ان نلاحظ ان التشكيل الموحد والمتسق للبوليبليكسيس ، مثل سي-NPs المعروضة هنا ، يعتمد علي مجموعه من المعلمات الفيزيائية الكيميائية. لقد وجدنا تجريبيا ان تركيز polyplex ، pH من الحل ، ونسبه البوليمر إلى siRNA (N +:P- نسبه) جميع تاثير جذري تشكيل polyplex. في ايدينا ، لا يكون تركيز siRNA تاثير كبير علي تشكيل polyplex ، ولكن باستخدام تركيزات البوليمر تزيد عن 3.33 مغ/مل النتائج في تشكيل المجاميع الكبيرة وغير متناسقة حجم polyplex. كما ان هذه si-NPs هي درجه الحموضة المستجيبة ، يمكن ان تنشا مجموعه متنوعة من المشاكل عندما الأس الهيدروجيني النهائي للحلول si-NP حمضيه جدا (< pH 7.2). طريقتان لمنع هذه المضاعفات هي بتجميد البوليمرات في diH نقيه2س بحيث لا توجد أملاح لتغيير تكوين العازلة عند انحلال وأعاده جعل المخازن المؤقتة في كثير من الأحيان لمنع "الانجراف" من درجه الحموضة العازلة مع مرور الوقت. لتوخي الحذر ، يجب تاكيد درجه الحموضة من المخازن المؤقتة في كل مره قبل اتخاذ si-NPs ، وينبغي دائما التحقق من الأس الهيدروجيني النهائي للحلول si-NP. وأخيرا ، فان +:P- نسبه الآثار Si-NPs التاثيرات سيرنا التحميل الكفاءة والمعلمات بوليبليكس الفيزيائية. هناك عاده وجود المثاليN +:P- نسبه الذي يتم تحميل جميع sirna ولكن ليس هناك وفره من البوليمر الأمم المتحدة المعقدة التي تشكل السكان منفصلة من مذيلات ويزيد من السمية الخلوية. بالنسبة لل si-NPs المعروضة هنا ،N +:P- 10-20 هو النطاق الذي لوحظ الاتساق الأمثل والأداء.
وتستخدم خطوط الخلية مراسل luciferase هنا للتحليل السريع والانتاجيه العالية للنشاط الحيوي si-NP. يجب إنشاء أو شراء خطوط الخلايا المراسلة luciferase قبل البدء في تحليل النشاط الحيوي ، التالي تتطلب الاستثمار الاولي في الوقت والنفقات. ومع ذلك ، فان استخدام الخلايا المراسلة لوسيفيراز لتقييم إسكات الجينات هو أسرع ، أكثر قابليه للتحليل عاليه الانتاجيه ، وأرخص مع مرور الوقت من أداء RT-PCR (لقياس التعبير mrna) أو بقع الغربية (لقياس التعبير البروتين). علي سبيل المثال ، قياس التلالؤ في هذا الفحص عاده ما يستغرق بضع دقائق فقط بدلا من العمليات طوال اليوم أو متعددة الأيام اللازمة لأداء RT-PCR أو blots الغربية. وعلاوة علي ذلك ، يمكن اجراء قياسات التلالؤ علي لوحات جيدا ، مما يسمح للقياس الكمي في وقت واحد من العديد من العينات (تصل إلى لوحات 96 وقد استخدمت من قبل المؤلفين). وأخيرا ، D-luciferin هو الكاشف الوحيد المطلوب أعلاه وخارجها النمطية الكواشف ثقافة الخلية ، مما يجعل الطريقة أكثر بكثير بأسعار معقولة من RT-PCR أو لطخه الغربية. هو سوفت كنت لاحظت مهما, ان ال [لوسيتاز] مراسله خليه فحص يكون حصرت إلى فقط يقيم مورثه يسكت من النموذج مورثه [لوسيتاز] ويستطيع لا يكون استعملت ان يقيس مورثه يسكت من أخرى "مورثات علاجيه" من فائده. وهكذا ، يحيل المؤلفون القراء إلى عده دراسات حيث تم استخدام RT-PCR و/أو لطخه الغربية لتقييم الجينات إسكات الجينات العلاجية من الفائدة24،32،33،34.
بالاضافه إلى النشاط الحيوي ، يجب علي الباحثين النظر بشكل مثالي في سلسله شامله من الاختبارات البيولوجية في المختبر لتوصيف أداء si-NP. ويمكن أيضا ان تستخدم المقايسة لوسيفيراز الموصوفة أعلاه لتقييم سلامه الخلية عن طريق مقارنه اشاره التلالؤ من الخلايا المعالجة si-NP المخفوقة إلى الخلايا غير المعالجة. وبما ان siRNA هو تسلسل غير مستهدف ، فان اي تغيير في التلالؤ يمكن ان يعزي إلى تاثير غير محدد لل si-NPs علي صلاحيه الخلية ، وهذا التاثير يعتمد عاده علي كيمياء البوليمر والكمية المولية. ويمكن استخدام التقنيات في التدفق الخلوي والمجهر الفلورسنت لتقييم امتصاص الخلية من si-NPs باستخدام فلوريسسينتلي المسمي سيرناس ، والبوليمرات ، أو كليهما. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام التقنيات الجزيئية مثل الجذعية حلقه PCR و ارجونوت 2 ايمونوبريسيبيتيشن لقياس بدقه مستويات siRNA داخل الخلايا. منذ siRNA هو النشطة بيولوجيا فقط إذا تم تسليمها إلى cytosol ، حيث يتم تحميله في RISC ، يجب ان تؤدي si-NPs الهروب الباطني من siRNA مره واحده التي استوعبتها الخلية. وتشمل المقايسات المستخدمة لقياس التجربة الباطنية الهروب من الدم الأحمر فحص الانحلال الدموي (وصفها بالتفصيل من قبل ايفانز وآخرون35) ، والتصوير الفلوري لفلوريسسينتلي المسمية SI-NP البضائع و LysoTracker36، و في الاونه الاخيره ، والتصوير الفلوري لتجنيد galectin 8 إلى ثقب الحويصلات الباطنية37،38. جمع البيانات وتوليف النتائج من التجارب في المختبر لسلامه الخلية ، وامتصاص الخلايا ، والهروب الباطني ، والنشاط الحيوي توفر الباحث القطع التكميلية من المعلومات التي لرسم التفسيرات وحشد الميكانيكية البصيرة حول si-NP (في) فعاليه.
وباختصار ، فان الجسيمات النانويه القادرة علي إيصال المرض بكفاءة هائله لديها إمكانيات كبيره لعلاج الامراض. علي سبيل المثال ، في علم الأورام ، العديد من الجينات التي تسبب تقدم السرطان ، ومقاومه العلاج ، والانبثاث هي ' غير قابل للتوصيل ' من قبل الصيدلة التقليدية ولكن يمكن علاجها باستخدام siRNA. ومع ذلك ، فان الشرط الأساسي لاستخدامها في النماذج الحيوانية من الامراض ، siRNA ادويه النانويه (المشار اليها هنا باسم si-NPs) تتطلب الفيزيائية الكيميائية والبيولوجية واسعه النطاق لضمان سلامتها وفعاليتها. وتحقيقا لهذه الغاية ، وصفت في هذه الوثيقة أساليب لإنتاج وتوصيف سي-NPs في المختبر ، والتي يمكن تقييمها لمدي ملاءمتها للمضي قدما في الدراسات الحيوانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يكشف أصحاب البلاغ عن اي تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم لكل من السيد كريغ دوفال والسيدة ريبيكا كوك للوصول إلى البيانات وموارد المختبر لاجراء هذا البحث. ويعرب المؤلفون عن امتنانهم لمعهد فانديبلت للعلوم والهندسة الهندسية (VINSE) للوصول إلى أدوات DLS و TEM (NSF EPS 1004083). ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للمؤسسة الوطنية للعلوم لدعم برنامج زمالات البحوث العليا (NSF # 1445197). ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للمعاهد الوطنية للصحة علي الدعم المالي (المعاهد القومية للصحة R01 EB019409). ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم لبرنامج وزاره الدفاع للبحوث الطبية الموجهة من أجل الدعم المالي (OR130302 CDMRP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
