Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Voorbereiding van neutraal geladen, pH-responsieve polymere nanodeeltjes voor cytosolische siRNA levering

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/59549

Summary

Methoden ter voorbereiding en karakterisering van de fysisch-chemische eigenschappen en bioactiviteit van neutraal geladen, pH-responsieve siRNA nanodeeltjes worden gepresenteerd. De criteria voor succesvolle siRNA nanomedicines zoals grootte, morfologie, oppervlaktelast, siRNA lading, en gen het silencing worden besproken.

Abstract

Het succes van siRNA als een gerichte moleculaire geneeskunde is afhankelijk van zijn efficiënte cytosolische levering aan cellen binnen het weefsel van pathologie. Klinisch succes voor de behandeling van eerder ' undruggable ' leverziekte doelen met siRNA is bereikt. Nochtans, vergt de efficiënte levering van de tumor siRNA extra farmacokinetische ontwerpoverwegingen, met inbegrip van lange omlooptijd, ontwijking van ontruimings organen (b.v., lever en nieren), en tumor penetratie en behoud. Hier beschrijven we de voorbereiding en in vitro fysisch-chemische/biologische karakterisering van polymere nanodeeltjes ontworpen voor een efficiënte siRNA levering, met name voor niet-lever weefsels zoals tumoren. De siRNA nanodeeltjes worden bereid door elektrostatische teint van siRNA en de diblok copolymeer poly (ethyleenglycol-b-[2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat-co-butyl METHYLMETHACRYLAAT]) (peg-DB) om poly-complexen te vormen ( polyplexes) waar siRNA is afgezonderd binnen de polyplex kern en PEG vormt een hydrofiele, neutraal geladen Corona. Bovendien, de DB blok wordt membraan-lytische als blaasjes van de endolysosomal pathway breng (< pH 6,8), triggering endosomale ontsnappen en cytosolische levering van siRNA. De methodes om de fysisch-chemische kenmerken van siRNA nanodeeltjes zoals grootte, oppervlaktelast, deeltjes morfologie, en siRNA lading te kenmerken worden beschreven. Bioactiviteit van siRNA nanodeeltjes wordt gemeten met behulp van Luciferase als een model gen in een snelle en high-throughput gen silencing assay. Ontwerpen die deze eerste tests passeren (zoals PEG-DB-gebaseerde polyplexes) worden geschikt geacht voor de vertaling van preklinische dierstudies de beoordeling van de levering van siRNA aan tumoren of andere sites van pathologie.

Introduction

Omdat siRNAs de vertaling van eiwitten uit mRNA sequenties remt, kunnen ze theoretisch gebruikt worden voor alle bekende pathologieën1,2,3,4,5. Echter, het gebruik van siRNA in de geneeskunde wordt beperkt door de ruim slechte farmacokinetische profiel van siRNA moleculen6,7. Wanneer intraveneus geïnjecteerd, siRNAs worden snel gewist door de nieren en/of afgebroken door nucleasen8,9. Door zijn grote omvang en negatieve lading kan siRNA geen cellen binnengaan of ontsnappen aan de endolysosomal route om toegang te krijgen tot het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) dat zich bevindt in de cytosol10,11,12, 13. Zo heeft uitgebreide inspanning gericht op het ontwerp en de uitvoering van siRNA Delivery Strategies14. Deze inspanning heeft zich grotendeels gericht op de ontwikkeling van lipiden-en polymeer-gebaseerde nanodeeltjes die pakket siRNA, te beschermen tegen ontruiming en degradatie in vivo, en initiëren cellulaire opname en endosomale ontsnappen door ioniserende, kationische amine groepen. Veel pre-klinische successen zijn gemeld en meest recentelijk, de eerste klinische succes is gemeld voor nanodeeltjes op basis van lever siRNA levering aan erfelijke transthyretine-gemedieerde (hATTR) Amyloïdose15te behandelen.

Er zijn vele kanker-veroorzakende genen die momenteel "undruggable" door conventionele farmacologie (d.w.z., kleine molecule drugs) zijn, motiverend het ontwerp van polymere siRNA nanodeeltjes (si-NPs) om kanker16te behandelen. Er zijn echter een aparte set van design parameters die moeten worden overwogen voor niet-lever siRNA levering. Het leveringssysteem moet de kationische last van polyplex beschermen die samenstelling binnen de systemische omloop17,18,19veroorzaakt. Voor de levering van tumoren, in het bijzonder, si-NP stabiliteit is essentieel voor een lange circulatie te begiftigen en dus een verhoogde accumulatie binnen tumoren via de verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect20,21. Bovendien, controle over si-NP grootte is essentieel, aangezien alleen nanodeeltjes ongeveer 20-200 nm diameter in grootte hefboom EPR22, en kleinere si-NPs (~ 20-50 nm diameter) vertonen verbeterde tumor penetratie over grotere grootte nanodeeltjes en microparticles23.

Om deze extra ontwerp beperkingen aan te pakken voor systemische tumor levering van siRNA na intraveneuze toediening, neutraal geladen, pH-responsieve si-NPs zijn ontwikkeld (Figuur 1)24. Deze si-NPs zijn PEGylated, of recentst, Zwitterionated25, voor neutrale oppervlaktelast en weerstand tegen eiwit adsorptie en opsonization in omloop. Aangezien zij zich niet uitsluitend op kationische karakter kunnen baseren om intracellulaire levering te drijven, is de uiterst efficiënte endosomale vlucht noodzakelijk voor het bereiken van het krachtige gen silencing. Dienovereenkomstig, de kern van deze si-NPs is samengesteld uit een zeer endosomolytic kern die inert is op extracellulaire pH (7,4), maar die wordt geactiveerd in een switch-achtige wijze in de aangezuurde voorwaarden van de endolysosomal pathway [pH 6,8 (vroege endosomes) – 5,0 ( lysosomen)]. Ten slotte, een mengsel van kationische en hydrofobe inhoud binnen de kern van Si-NPs bieden zowel elektrostatische en van der Waals stabilisatie krachten, verbetering van de stabiliteit van de si-NPs in het bloed in vergelijking met louter kationische systemen.

De integratie van vele functies in een relatief eenvoudig ontwerp is mogelijk met behulp van omkeerbare toevoeging-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) gecontroleerde polymerisatie om polymeren te produceren met complexe architectuur en nauwkeurige samenstelling. Om si-NPs met neutrale oppervlaktelast, pH-ontvankelijkheid, en NP stabiliteit te produceren, wordt het vlot gebruikt om poly (ethyleenglycol-b-[2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat-co-butyl METHYLMETHACRYLAAT]) (peg-DB te synthetiseren; Figuur 1a). PEG-DB is elektrostatisch gecomplexeerd met siRNA, het vormen van Si-NPs met een PEG Corona en DB/siRNA core (Figuur 1b). PEG vormt een inerte, neutraal geladen hydrofiele laag op de si-NP Corona. Het DB blok bestaat uit een 50:50 Molar ratio van 2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat (DMAEMA) en butyl methylmethacrylaat (BMA). Kationische DMAEMA elektrostatisch complexen negatief-geladen siRNA. BMA Self-Associates binnen de NP core door van der Waals interacties, toenemende NP stabiliteit. Samen, DMAEMA en BMA geven pH-afhankelijke lipide bilayer-lytische gedrag aan de DB polymeer blok. Op extracellulaire pH, de DB blok is afgezonderd aan de si-NP kern en is inert voor lipide bilayers. Onder zure omstandigheden, zoals die binnen de endolysosomal pathway, ioniseer DMAEMA binnen de DB blok vergemakkelijkt de Proton spons effect, waar endosomale buffering leidt tot osmotische zwelling en scheuren26. Daarnaast hydrofobe BMA delen binnen de DB blok actief te integreren in en lyse lipide bilayers, wat resulteert in krachtige endosomolysis. Aldus, is siRNA complex met PEG-DB om si-NPs te vormen die neutraal-geladen en hoogst stabiel bij extracellulaire pH zijn maar die lipide bilayers bij zure pH verstoren, verzekerend cytosolische levering van de siRNA lading.

Hierin worden beschreven de experimentele procedures voor de productie van Si-NPs van PEG-DB. Methoden om de fysisch-chemische parameters en bioactiviteit van Si-NPs te karakteriseren worden gepresenteerd en besproken. Om snel te beoordelen si-NP bioactiviteit, Luciferase wordt gebruikt als een model gen voor knock-out studies. Firefly Luciferase is het eiwit dat verantwoordelijk is voor de ' Glow ' van vuurvliegjes27. Dienovereenkomstig, zoogdiercellen transfected met de Firefly Luciferase gen produceren een bioluminescent ' Glow ' die kunnen worden gevangen met behulp van een luminometer om het niveau van Luciferase expressie te kwantificeren. Hier gebruiken we Luciferase om de bioactiviteit van Si-NPs te beoordelen door het leveren van siRNA tegen Luciferase en het kwantificeren van de overeenkomstige reductie in bioluminescentie in Luciferase cellen vergeleken met cellen die een scrambled siRNA ontvangen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding en karakterisering van Si-NPs

  1. si-NP voorbereiding
    1. Los polymeer in 10 mM citroenzuur buffer (pH 4,0) op 3,33 mg/mL. Polymeer kan eerst worden opgelost op 10x concentratie in ethanol om de ontbinding te garanderen.
      Opmerking: polymeer kan worden opgelost bij lagere concentraties, maar het gebruik bij concentraties boven 3,33 mg/mL kan homogene NP-vorming voorkomen.
    2. Voeg siRNA (50 μM in diH2O) toe om te resulteren in N+:P- ratio van 10. Meng polymeer-en siRNA oplossingen grondig door pipetten en laat incuberen gedurende 30 minuten. De N+:P- ratio vertegenwoordigt het aantal positief geladen amine-groepen op het polymeer tot het aantal negatief geladen fosfaatgroepen op de siRNA en wordt berekend volgens de onderstaande formule:
      Equation
      waar, mol Pol is de maal hoeveelheid polymeer, RU amine is het aantal herhalende eenheden van positief geladen aminen per polymeer, mol siRNA is de maal hoeveelheid siRNA, en BP siRNA is het aantal basisparen per siRNA molecuul.
    3. Voeg een 5-voudige overmaat van 10 mM fosfaatbuffer (pH 8,0) toe en meng voorzichtig door de buis te pipetteren of te omkeren. Om te bevestigen dat de uiteindelijke pH neutraal is (~ 7.2-7,5), Pipetteer 10 l van Si-NP-oplossing op pH-teststrips.
      Opmerking: citroenzuur en fosfaat buffers worden bereid volgens de Millipore Sigma buffer Reference Center Charts.
  2. Fysisch-chemische karakterisering van Si-NPs
  3. Noteer de grootte en het oppervlak van de resulterende si-NPs met Dynamische lichtverstrooiing (DISTRIBUTIELIJSTEN). Bereid een voorbeeld van DISTRIBUTIELIJSTEN voor door 1 mL si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) te filteren tot en met 0,45 μm-filters voor porie-grootte in een vierkante kwarts-of polystyreen Cuvette. Record grootte en oppervlakte heffing metingen met behulp van een DL-instrument volgens de specificaties van de fabrikant.
    1. Bevestig de grootte en de morfologie van Si-NPs door Imaging-analyse met behulp van Transmission Electron microscopie (TEM).
      1. Voeg 5 l van Si-NP-oplossing toe op 1 mg/mL tot TEM-rasters en incubeer voor 60 s. dep droog voor 3 s.
      2. Voeg 5 l van 3% uranyl acetaat oplossing toe en incubeer voor 20 s. dep droog voor 3 s. droge roosters 's nachts onder uitdroging.
      3. Beeld rasters volgens het protocol dat is vastgesteld voor de specifieke Microscoop die moet worden gebruikt.
    2. Karakteriseren de lading van siRNA in si-NPs bij diverse N+:P- verhoudingen gebruikend agarose gel vertraging.
      1. Om 2% agarose gel te veroorzaken, voeg 2 g van elektroforese rang agarose poeder aan 100 mL van 1x TAE (tris-acetate-EDTA) buffer bij pH 8,0 toe. Beweeg om agarose op te schorten. Hitte die in microgolf wordt blootgelegd tot al agarose wordt opgelost (1-3 min).
      2. Eenmaal gekoeld, voeg 5 l van ethidium bromide (10 mg/mL in H2O), en meng goed. Giet agarose in een gel lade en plaats kam om putten te produceren, laten drogen voor 30 min. zorgvuldig verwijderen kam te verlaten achter het laden van putten, en vul de gel lade om de Max te vullen lijn met 1x TAE buffer.
      3. Genereer si-NPs (volgens de bovenstaande procedure) op 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20 en 40 N+:P- ratio's. Plaats 2 l hoeveelheid ladings kleurstof (geen SDS en verminderende agenten) op paraffine film voor elke si-NP formulering. Meng 10 l van Si-NP oplossing met beladings vloeistof op paraffine folie door pipet.
      4. Voeg si-NP/loading Dye oplossingen toe aan agarose gel Wells. Looppas voltagebron bij 100 V voor 35 min (of tot de steekproeven 80% van gel lengte hebben doorkruist).
      5. Visualiseer siRNA bands op een UV-transilluminator volgens de specificaties van de fabrikant.

2. bepaling van de in vitro bioactiviteit van Si-NPs

  1. Knock-out van het model Gene Luciferase
    1. Genereer Luciferase si-NPs (volgens de bovenstaande procedure) met behulp van Luciferase siRNA en scrambled si-NPs met behulp van een scrambled siRNA sequentie als een controle. Formualte beide si-NPs op dezelfde laatste N+:P- ratio en op de optimale ratio geïdentificeerd door agarose gel retardatie studies. Voorbeeld siRNA sequenties zijn opgenomen in de tabel van materialen.
    2. Zaad Luciferase-uitdrukken van cellen [MDA-MB-231/Luciferase (BSD) stabiele cellen] in 96-goed zwart-ommuurde platen op een dichtheid van 2.000 cellen per put. Laat zich 's nachts in volle media (DMEM, 10% FBS) in een incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid).
    3. Verdun si-NPs in volledige serum media voor een definitief volume van 100 l per put en siRNA concentratie van 100 nM. Behandel de cellen voor 24 uur met si-NPs.
    4. Verwijder na 24 uur behandelingen en vervang media met volledige serum media met 150 μg/mL D-Luciferin. Incubeer cellen voor 5 min voor het meten van luminescentie op een plaat lezer of in vivo optisch beeldsysteem volgens de specificaties van de fabrikant.
    5. Vervang luciferin-bevattende media met verse, volledige serum media, en incubeer 24 h meer. Herhaal de bovenstaande stap, het verwijderen van media en het vervangen met volledige serum media met 150 μg/mL D-Luciferin, gevolgd door een 5 min incubatie voorafgaand aan het meten van luminescentie op de 48 h timepoint.
    6. Voor longitudinale studies, handhaaf cellen onder steriele omstandigheden terwijl het meten van luminescentie. Doorgaan met de cultuur in verse, volledige media tussen metingen na vervanging van luciferin-bevattende.
      Nota: de aangewezen siRNA concentratie zal met verschillende si-NPs en siRNA molecules variëren. Bij gebruik van neutraal geladen polyplexes met een endosomolytic kern (bijv. PEG-DB), 100 nM wordt meestal goed verdragen door de cellen en produceert > 75% Luciferase knock-out. De massa ratio van PEG-DB te siRNA op 10 N+:P- ratio en 100 nm siRNA behandelingen (uitgaande van 26 bp siRNA) is 23,3, dat wil zeggen, voeg 23,3 ng van Peg-DB voor elke 1,0 ng van siRNA. Bijvoorbeeld, voeg 1,16 l van 3,33 mg/mL polymeer voor 166,5 ng van siRNA om een goed te behandelen op 100 nM in een 96-well plaat (100 mL media volume per well).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enkele essentiële kenmerken van effectieve si-NPs voor in vivo siRNA levering zijn de juiste grootte (~ 20-200 nm diameter), siRNA verpakking, en Gene silencing bioactiviteit. Hoewel dit niet een uitputtende lijst (zoals besproken in de discussie), moeten deze fundamentele kenmerken worden bevestigd voordat overweegt verder testen van een formulering.

Figuur 2 illustreert de karakterisering van Si-NP grootte en oppervlakte lading bij de formulering. DISTRIBUTIELIJSTEN en TEM worden gebruikt als complementaire methoden om si-NP grootte (beide), polydispersie (DL'S), en de morfologie (TEM) te observeren. DISTRIBUTIELIJSTEN tonen aan dat si-NP 1 een gemiddelde diameter heeft van 35 nm, unimodaal verdeling aangegeven door de aanwezigheid van een enkele piek, en een lage polysprei ding aangegeven door een relatief smalle piekbreedte (Figuur 2a). TEM metingen bevestigen de grootte meting van DISTRIBUTIELIJSTEN, suggereren de aanwezigheid van een uniforme populatie van Si-NPs, en onthullen de sferische morfologie van de si-NPs (figuur 2c). DISTRIBUTIELIJSTEN en TEM metingen van Si-NP 2 blijkt dat het ongewenste grootte (> 200 nm diameter) van de gemiddelde diameter 1.500 nm, een multimodale en polydispersie populatie, en aggregaten in oplossing, die geen afzonderlijke deeltjes morfologie (Figuur 2b, D ). Zowel si-NPs 1 als 2 display neutrale oppervlaktelast, aangegeven door near-zero gemiddelde Zeta potentiële waarden (figuur 2e).

Het laden van efficiency van siRNA in si-NPs wordt gekenmerkt gebruikend een agarose test van de gel vertraging. Un-complexed siRNA migreert door de agarose gel en wordt gevisualiseerd (als gevolg van binding van ethidium bromide) op de gel bodem. Wanneer siRNA met het polymeer wordt gecomplexeerd om si-NPs te vormen, wordt de migratie door agarose gel belemmerd en siRNA wordt gevisualiseerd bij de gel bovenkant (of waar het in putten werd geladen). Voor PEG-DB-based si-NPs, verhoogt de teint met het verhogen van N+:P- ratio's tot volledige teint wordt bereikt op ~ 10-20 N+:P- ratio (Figuur 3).

Luciferase wordt gebruikt als een model gen voor de snelle beoordeling van Si-NP gen silencing bioactiviteit. Bioluminescentie metingen via een plaat lezer of in vivo optisch Imaging systeem zorgen voor de snelle, hoge-throughput kwantificering van Luciferase eiwitexpressie in goed-plaat formaat. Deze techniek is aanzienlijk sneller, goedkoper en minder omslachtig dan het analyseren van Gene silencing door middel van traditionele moleculaire analyses zoals PCR (genexpressie) en Western Blot (eiwitexpressie). Door deze methode, Luciferase-expressing cellen worden behandeld met Luciferase si-NPs en scrambled si-NPs (als een controle), en% Luciferase activiteit wordt berekend door het vergelijken van luminescentie signaal naar onbehandelde cellen. Bioactieve Luciferase si-NPs zal vertonen aanzienlijk verminderd% Luciferase activiteit in vergelijking rechtstreeks met scrambled si-NP controle, zoals kan worden gezien voor si-NP 1 in Figuur 4. In tegenstelling, Luciferase si-NPs die niet verminderen% Luciferase activiteit in vergelijking met scrambled si-NP controle (zoals si-NP 2) worden niet beschouwd als bioactieve (Figuur 4). Vaak 48 h is de tijd van maximale gen silencing (Figuur 4), maar we hebben waargenomen significante gen silencing op tijdpunten variërend van 24 uur tot 240 h post-behandeling.

Figure 1
Figuur 1. Polymeerchemie en si-NP schema. (A) chemische samenstelling van Peg-DB diblok copolymeer die si-NPs componeert en neutrale oppervlaktelading (peg-blok) en pH-responsief gedrag (DB-blok) begiftigt. (B) zelf-assemblage van Si-NPs. Bij pH 4,0, is het blok van DB in water oplosbaar omdat de DMAEMA tertiaire aminen hoogst geprotoneerd zijn. De positief geladen DB blok elektrostatisch complexen negatief geladen siRNA moleculen. De pH wordt vervolgens aangepast aan ~ 7,4 door de toevoeging van 5x pH 8,0 fosfaatbuffer, wat resulteert in de "hydrophobization" van DB blok en de vastlegging van siRNA en DB in de kern van Si-NPs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. DISTRIBUTIELIJSTEN en TEM karakterisering van Si-NP grootte, oppervlakte lading, en de morfologie. (A, C) si-NP 1 vertegenwoordigt een eenvormige steekproef met aangewezen grootte (~ 50-100 nm diameter), terwijl (B, D) si-NP 2 ongewenst, groot en polydispersie aggregaten heeft gevormd. (E) zowel si-NPs display bijna neutraal oppervlak lading (zeta potentieel). Foutbalken geven standaardfout weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Agarose de vertragings analyse van het gel om si-NP siRNA ladings efficiency te beoordelen. De verdwijning van siRNA banden aan de gel bodem duidt op de teint van siRNA aan polymeer. Polymeer-complexe siRNA is niet in staat om te migreren door de gel en is dus gevisualiseerd op de top van de gel in de buurt van de laad putten. Naarmate de N+:P- ratio wordt verhoogd, siRNA teint stijgt, zoals aangegeven door een verminderde intensiteit van de siRNA band op de gel bodem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. Si-NP-gemedieerde knock-out van het model Gene Luciferase in Luciferase MDA-MB-231 cellen. Luciferase activiteit op (a) 24 h en (B) 48 h post-behandeling met ofwel scrambled si-NPS of Luciferase si-NPS op 10 N+:P- ratio en 100 nm siRNA dosis. % Luciferase activiteit wordt berekend door het luminescentie signaal van behandelings steekproeven (scrambled en Luciferase) door het luminescentie signaal van onbehandelde cellen te verdelen. NB: si-NP 1 is een effectieve formulering met Gene silencing bioactiviteit, terwijl si-NP 2 een formulering vertegenwoordigt zonder gen-silencing bioactiviteit. (*) duidt op een statistisch significant verschil (p < 0,05) ten opzichte van de gecodeerde groep voor een formulering op een gegeven timepoint. Foutbalken geven standaardfout weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De si-NPs hier beschreven worden gevormd door elektrostatische vereniging van anionische siRNA en kationische polymeren in polyion complexen (polyplexes). Elektrostatische complexen van siRNA en het kationische DB blok van PEG-DB polymeren wordt vergemakkelijkt door het mengen bij lage pH (4,0). Bij pH 4,0, is DMAEMA hoogst geprotoneerd, en bijgevolg wordt het DB blok hoogst geladen. Dit zorgt ervoor dat de polymeren oplossen als unimers in oplossing in tegenstelling tot de vorming van micellen en dat DB complexen efficiënt met siRNA. Vervolgens wordt de pH van de oplossing aangepast aan de neutrale (pH 7,4), waardoor ' hydrophobization ' van het DB blok, micel vorming, en Entrapment van de complexe siRNA binnen de kern van de resulterende polyplexes. Deze polyplexes zijn zodanig ontworpen dat PEG vormt een hydrofiele, inerte schelp rond de DB/siRNA kern, wat resulteert in neutrale oppervlaktelast die nodig is voor systemische toediening. De polymeerchemie en het proces van polyplex formatie worden beschreven in Figuur 1.

Strenge fysisch-chemische karakterisering van Si-NPs is essentieel om te bepalen of formuleringen geschikt zijn voor het verplaatsen naar biologische tests. Grootte, oppervlaktelast, en deeltjes vorm/morfologie zijn alle belangrijke parameters die de biologische prestaties kunnen beïnvloeden. Voor systemische levering aan tumoren, si-NP grootte moet vallen tussen de 20-200 nm diameter22, en de meeste recente studies suggereren 20-50 nm diameter deeltjes zijn ideaal23. De oppervlaktelast moet neutraal of licht negatief zijn om de adsorptie van eiwitten en opsonization28te minimaliseren. De studies hebben de verbinding tussen deeltjes vorm en farmacokinetiek/deeltjes ontruiming onderzocht, die deeltjes met hoge aspectverhouding voorstellen zijn wenselijk over sferische deeltjes29,30,31. Echter, tot op heden sferische deeltjes zijn nog steeds het meest gebruikt, en om onze kennis, zijn de enige deeltjes vorm te zijn vertaald naar de menselijke studies in de oncologie.

Het is belangrijk op te merken dat de uniforme en consistente vorming van polyplexes, zoals de si-NPs hier gepresenteerd, is afhankelijk van een reeks van fysico-chemische parameters. We hebben empirisch gevonden dat polyplex concentratie, pH van de oplossing, en de verhouding van polymeer tot siRNA (N+:P- ratio) alle drastische impact polyplex vorming. In onze handen, siRNA concentratie heeft geen grote invloed op polyplex vorming, maar het gebruik van polymeer concentraties van meer dan 3,33 mg/mL resulteert in de vorming van grote aggregaten en inconsistente polyplex grootte. Aangezien deze si-NPs zijn pH-responsieve, een verscheidenheid van problemen kunnen ontstaan wanneer de uiteindelijke pH van Si-NP oplossingen is te zuur (< pH 7,2). Twee manieren om deze complicaties te voorkomen zijn om polymeren lyophilize in pure diH2O, zodat er geen zouten te veranderen buffer samenstelling bij ontbinding en opnieuw te maken buffers vaak om de "drifting" van de buffer pH te voorkomen in de tijd. Om voorzichtig te zijn, moet de pH van buffers worden bevestigd elke keer voor het maken van Si-NPs, en de uiteindelijke pH van Si-NP oplossingen moet altijd worden geverifieerd. Ten slotte, de N+:P- ratio van Si-NPs effecten siRNA laden efficiëntie en polyplex fysico-chemische parameters. Er bestaat meestal een ideale N+:P- ratio waarbij alle siRNA is geladen, maar er is niet een overvloed van un-gecomplexeerde polymeer die afzonderlijke populaties van micellen vormen en verhoogt de chemo graad. Voor de hier gepresenteerde si-NPs is N+:P- 10-20 het bereik waarin optimale consistentie en prestaties zijn waargenomen.

Luciferase reporter Cell Lines worden hier gebruikt voor de snelle en high-throughput analyse van Si-NP bioactiviteit. Luciferase reporter Cell Lines moeten worden gegenereerd of gekocht voordat bioactiviteit analyse, waarbij een initiële investering in tijd en kosten. Echter, het gebruik van de Luciferase reporter cellen te beoordelen gen silencing is sneller, meer vatbaar voor high-throughput analyse, en goedkoper in de tijd dan het uitvoeren van RT-PCR (om mRNA expressie te meten) of westerse blots (om eiwitexpressie te meten). Bijvoorbeeld, het meten van luminescentie in deze assay duurt meestal slechts een paar minuten in tegenstelling tot de hele dag of multi-dag processen die nodig zijn om RT-PCR of Western blots uit te voeren. Bovendien kunnen luminescentie metingen worden uitgevoerd op goed-platen, waardoor de gelijktijdige kwantificering van vele monsters (tot 96-goed platen zijn gebruikt door de auteurs). Ten slotte, D-Luciferin is de enige reagens die nodig zijn boven en buiten de typische cel cultuur reagentia, waardoor de methode veel betaalbaarder dan RT-PCR of Western Blot. Opgemerkt moet worden echter, dat de Luciferase reporter cel assay is beperkt tot slechts de beoordeling van gen silencing van het model gen Luciferase en kan niet worden gebruikt om gen silencing van andere "therapeutische genen" van belang te meten. Aldus, verwijzen de auteurs lezers naar verscheidene studies waar RT-PCR en/of westelijke vlek is gebruikt om gen het silencing van therapeutische genen van belang24,32,33,34te beoordelen.

Naast de bioactiviteit, moeten onderzoekers idealiter overwegen een uitgebreid gamma van in vitro biologische tests om si-NP prestaties te karakteriseren. De hierboven beschreven Luciferase assay kan ook gebruikt worden om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen door het luminescentie signaal van gecodeerde si-NP behandelde cellen te vergelijken met onbehandelde cellen. Aangezien siRNA een niet-richtende opeenvolging is, kan om het even welke verandering in luminescentie aan niet-specifieke invloed van Si-NPs op de levensvatbaarheid van de cel worden toegeschreven, en dit effect is typisch afhankelijk van de polymeerchemie en het Kies bedrag. Technieken in flow Cytometry en fluorescerende microscopie kunnen gebruikt worden om de cel opname van Si-NPs te beoordelen met behulp van fluorescerend gelabelde siRNAs, polymeren of beide. Daarnaast kunnen moleculaire technieken zoals stam-lus PCR en Argonaut 2 Immunoprecipitation gebruikt worden om de intracellulaire siRNA niveaus nauwkeurig te meten. Aangezien siRNA is alleen bioactieve indien geleverd aan de cytosol, waar het wordt geladen in RISC, si-NPs moet trigger endosomale Escape of siRNA eenmaal intern door de cel. Tests gebruikt om experimenteel te meten endosomale ontsnappen onder de rode bloedcel hemolyse assay (in detail beschreven door Evans et al.35), fluorescerende beeldvorming van de colokalisatie van fluorescerende gelabeld si-NP Cargo en LysoTracker36, en meest recent, TL-beeldvorming van de aanwerving van galectin 8 tot geperforeerde endosomale blaasjes37,38. Het verzamelen van gegevens en het synthetiseren van de resultaten van in vitro experimenten voor de levensvatbaarheid van cellen, cel opname, endosomale ontsnappen, en bioactiviteit bieden de onderzoeker complementaire stukjes informatie van waaruit interpretaties te trekken en Garner mechanistische inzicht in de si-NP (in) effectiviteit.

Kortom, nanodeeltjes in staat om efficiënt te leveren siRNA hebben een enorm potentieel om de ziekte te behandelen. Bijvoorbeeld, in de oncologie, veel genen die kanker progressie veroorzaken, resistentie tegen therapie, en metastase zijn ' undruggable ' door de conventionele farmacologie, maar kan worden behandeld met behulp van siRNA. Echter, voorwaarde voor het gebruik ervan in dierlijke modellen van de ziekte, siRNA nanomedicines (hier aangeduid als si-NPs) vereisen uitgebreide fysisch-chemische en biologische karakterisering om zowel hun veiligheid en effectiviteit te waarborgen. Hiertoe zijn hierin methoden beschreven om si-NPs in vitro te produceren en te karakteriseren, waardoor de si-NPs kan worden beoordeeld op geschiktheid om naar dierstudies te gaan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs onthullen geen mogelijke belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs zijn dankbaar drs. Craig Duvall en Rebecca Cook voor toegang tot gegevens en Lab middelen voor het uitvoeren van dit onderzoek. De auteurs zijn dankbaar voor de Vanderbilt Instituut voor Nanoscale Science and Engineering (VINSe) voor de toegang tot DISTRIBUTIELIJSTEN en TEM (NSF EPS 1004083) instrumenten. De auteurs zijn dankbaar voor de National Science Foundation voor de ondersteuning van de Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). De auteurs zijn dankbaar voor de nationale instituten van de gezondheid voor financiële steun (NIH R01 EB019409). De auteurs zijn dankbaar voor het ministerie van defensie conregressie gericht medisch onderzoekprogramma voor financiële ondersteuning (DOD CDMRP OR130302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm pore-size syringe filters Thermo Fisher Scientific F25133 17 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test strips Millipore Sigma P4786
10x TAE buffer Thermo Fisher Scientific/Invitrogen AM9869
6-7.7 pH test strips Millipore Sigma P3536
96-well black walled plates Corning 3603 Tissue-culture treated
Agarose Powder Thermo Fisher Scientific/Invitrogen 16500
Citric acid monohydrate Millipore Sigma C1909
dibasic sodium phosphate dihydrate Millipore Sigma 71643
D-luciferin Thermo Fisher Scientific 88294 Monopotassium Salt
DMEM Gibco 11995065 High glucose and pyruvate
Ethanol Millipore Sigma 459836
ethidium bromide Thermo Fisher Scientific/Invitrogen 15585011
FBS Gibco 26140079
loading dye Thermo Fisher Scientific/Invitrogen R0611
Luciferase siRNA IDT N/A Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells GenTarget Inc SC059-Bsd Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrate Millipore Sigma S9638
Scarmbled siRNA IDT N/A Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettes Fisher Scientific 14-955-129 4.5 mL capacity
TEM grids Ted Pella, Inc. 1GC50 PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804
uranyl acetate Polysciences, Inc. 21447-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
  3. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
  4. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
  5. Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
  6. Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
  7. Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
  8. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
  9. Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
  10. Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
  11. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
  13. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
  14. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  15. Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
  16. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
  17. Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
  18. Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
  19. Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
  20. Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
  21. Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
  22. Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
  23. Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
  24. Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
  25. Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
  26. Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
  27. de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
  28. Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
  29. Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
  30. Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
  31. Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
  32. Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
  33. Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
  34. Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
  35. Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
  36. Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
  37. Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
  38. Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).

Tags

Biotechniek kwestie 147 de interferentie van RNA Endosomale vlucht Endosomolysis pH-ontvankelijk nanotechnologie polymere nanodeeltjes biomedische techniek drug levering kanker
Voorbereiding van neutraal geladen, pH-responsieve polymere nanodeeltjes voor cytosolische siRNA levering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hendershot, J., Smith, A. E.,More

Hendershot, J., Smith, A. E., Werfel, T. A. Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery. J. Vis. Exp. (147), e59549, doi:10.3791/59549 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter