Summary
Es werden Methoden zur Vorbereitung und Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Bioaktivität von neutral aufgeladenen, pH-responsiven siRNA-Nanopartikeln vorgestellt. Es werden Kriterien für erfolgreiche siRNA-Nanomedizine wie Größe, Morphologie, Oberflächenaufladung, siRNA-Ladung und Gen-Schweigung diskutiert.
Abstract
Der Erfolg von siRNA als zielgerichteter molekularer Medizin hängt von der effizienten zytosolischen Zufuhr an Zellen im Gewebe der Pathologie ab. Der klinische Erfolg bei der Behandlung von bisher "untrüglichen" Lebererkrankungen mit siRNA wurde erzielt. Eine effiziente TumorsiRNA-Zufuhr erfordert jedoch zusätzliche pharmakokinetische Gestaltungsüberlegungen, darunter lange Umlaufzeiten, Ausweichorgane (z.B . Leber und Nieren) sowie Tumordurchdringung und-bindung. Hier beschreiben wir die Zubereitung und in vitro physicochemical/biologische Charakterisierung von polymerischen Nanopartikeln, die für eine effiziente SiRNA-Lieferung, insbesondere für nicht-epatische Gewebe wie Tumoren, entwickelt wurden. Die siRNA-Nanopartikel werden durch elektrostatische Komplexe von siRNA und dem DBlock-Copolymer-Poly (Ethylen-Glykol-b-[2-(Dimethylamino) Meylmethacrylate-Co-Butylmethacrylat]) (PEG-DB) zu Polyionen hergestellt. In der Lage, sich in der Lage zu befinden, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage zu sein. Darüber hinaus wird der DB-Block als Vesikel des endolysosomalen Pfades (< pH 6.8), was endosomale Escape-und zytosolische Lieferung von siRNA auslöst. Es werden Methoden beschrieben, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften von siRNA-Nanopartikeln wie Größe, Oberflächenaufladung, Partikelmorphologie und siRNA-Belastung zu charakterisieren. Die Bioaktivität von siRNA-Nanopartikeln wird mittels Luciferase als Modell-Gen in einem schnellen und hochdurchgehenden Gen-Schweigungsanfall gemessen. Entwürfe, die diese ersten Tests bestehen (wie PEG-DB-basierte Polyplexe), gelten als geeignet für die Übersetzung in präklinische Tierstudien, die die Lieferung von siRNA an Tumoren oder andere Orte der Pathologie bewerten.
Introduction
Da siRNAs die Übersetzung von Proteinen aus mRNA-Sequenzen hemmen, können sie theoretisch verwendet werden, um alle bekannten Pathologien1,2, 3,4,5zumedikamentös zu machen. Der Einsatz von siRNA in der Medizin wird jedoch durch das umfassend schlechte pharmakokinetische Profil von siRNA-Molekülen 6,7begrenzt. Wenn sie intravenös injiziert werden, werden siRNAs schnell durch die Nieren und/oder durch Nukleasen8,9abgebaut. Aufgrund seiner großen Größe und negativen Ladung kann siRNAnichtin die Zellen eindringen oder dem endolysosomalen Weg entkommen, um auf den RNA-induzierten Stillstandskomplex (RISC) zuzugreifen, der im Cytosol 10,11, 12, 13. November So konzentriert sich der umfangreiche Aufwand auf die Konzeption und Umsetzung von siRNA-Lieferstrategien 14. Diese Bemühungen konzentrierten sich weitgehend auf die Entwicklung von lipid-und polymerbasierten Nanopartikeln, die siRNA verpacken, vor Räumung und Degradierung in vivo schützen und durch ionisierbare, kationelle Aminengruppen eine zelluläre Aufnahme und endosomale Flucht auslösen. Es wurden viele präklinische Erfolge gemeldet und zuletzt wurde der erste klinische Erfolg für die nanopartikel-basierte Leberlieferungen zur Behandlung der erblichen Transthyrein-vermittelten (hATTR) Amyloidose 15 gemeldet.
Es gibt viele krebserregende Gene, die derzeit von der konventionellen Pharmakologie "nicht rugdfähig" sind (z.B. kleine Molekülmedikamente), die das Design von polymerischen siRNA-Nanopartikeln (si-NPs) zur Behandlung von Krebs16 motivieren. Es gibt jedoch einen separaten Satz von Konstruktionsparametern, die für die nicht-hepatische siRNA-Lieferung berücksichtigt werden müssen. Das Liefersystem muss die kationische Ladung des Polyplex abschirmen, die eine Agglutination innerhalb der systemischen Zirkulation 17,18,19verursacht. Für die Tumorzufuhr ist insbesondere die si-NP Stabilität unerlässlich, um eine lange Zirkulation und damit eine erhöhte Akkumulation innerhalb von Tumoren durch die verbesserte Durchlässigkeit undRetentionseffekt (EPR) 20,21zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Kontrolle über die Größe von si-NP unerlässlich, da nur Nanopartikel mit einer Größe von etwa 20 – 200 nm Durchmesser EPR22und kleinere si-NPs (~ 20 – 50 nm Durchmesser) eine verbesserte Tumordurchdringung gegenüber größeren Nanopartikeln aufweisen und Mikropartikel23.
Um diesen zusätzlichen Konstruktionseinschränkungen für die systemische Tumorzustellung von siRNA nach intravenöser Verabreichung gerecht zu werden, wurden neutral aufgeladene, pH-reaktionsfähige si-NPs entwickelt (Abbildung 1)24. Diese si-NPs sind PEGylatierte,oder zuletzt Zwitterionierte 25, für neutrale Oberflächenaufladung und Resistenz gegen Proteinadsorption und Opsonisierung im Umlauf. Da sie sich nicht allein auf den kationischen Charakter verlassen können, um die intrazelluläre Lieferung voranzutreiben, ist ein äußerst effizientes endosomales Escape-Escape-Gebot, um eine starke Genverstallung zu erreichen. Dementsprechend besteht der Kern dieser si-NPs aus einem hochendosomolytischen Kern, der bei extrazellulärem pH-Wert (7,4) inert ist, aber in schalterlicher Weise unter den sauren Bedingungen des endolysosomalen Weges [pH 6.8 (frühe Endosomen) – 5.0 ausgelöst wird ( Lysosomen)]. Schließlich sorgt eine Mischung aus kationischem und hydrophobischem Gehalt im Kern der si-NPs für elektrostatische und van der Waals-Stabilisierungskräfte, die die Stabilität der si-NPs im Blut im Vergleich zu rein kationischen Systemen verbessern.
Die Integration vieler Funktionen in ein relativ einfaches Design ist durch die reversible Addition-Fragmentierungskette Transfer (RAFT) zur Herstellung von Polymeren mit komplexer Architektur und präziser Komposition möglich. Zur Herstellung von Si-NPs mit neutraler Oberflächenaufladung, pH-Reaktionsfähigkeit und NP-Stabilität wird RAFT verwendet, um Poly (Ethylen-Glykol-b-[2-(Dimethylamino) Ethylmethacrylate--Butylmethacrylat] zu synthetisieren. Abbildung 1A). PEG-DB ist elektrostatisch mit siRNA vervollbbar und bildet si-NPs mit einem PEG-Korona und DB/siRNA-Kern (Abbildung 1B). PEG bildet eine inerte, neutral geladene hydrophile Schicht auf der si-NP Corona. Der DB-Block besteht aus einem 50:50-molaren Verhältnis von 2-(Dimethylamino) Ethylmethacrylat (DMAEMA) und Butylmethacrylat (BMA). Die ationische DMAEMA umsetzt elektrostatisch die negativ geladene siRNA. BMA Selbst-assoziierte innerhalb der NP-Kern von van der Waals Interaktionen, die Erhöhung der NP-Stabilität. Gemeinsam vermitteln DMAEMA und BMA pH-abhängiges Lipidbilayer-lytisches Verhalten an den DB-Polymerblock. Bei extrazellulärem pH wird der DB-Block an den si-NP-Kern geklebt und ist inert auf Lipidbilayers. Unter sauren Bedingungen, wie zum Beispiel innerhalb des Endolysosomalpfads, erleichtert die ionisierbare DMAEMA innerhalb des DB-Blocks den Protonenschwamm-Effekt, bei dem die endosomale Pufferungzuosmotischer Schwellung und Bruch 26 führt. Darüber hinaus integrieren sich hydrophobe BMA-Moieanlagen innerhalb des DB-Blocks aktiv in und lysen Lipidbilayers, was zu einer starken Endosomolyse führt. So wird siRNA mit PEG-DB zu si-NPs Komplexiert, die neutral aufgeladen und bei extrazellulärem pH-Wert hochstabil sind, aber die Lipidbilayer bei saurem pH-Wert stören und so eine zytosolische Lieferung der siRNA-Nutzlast gewährleisten.
Hierin werden die experimentellen Verfahren beschrieben, um si-NPs von PEG-DB zu produzieren. Es werden Methoden zur Charakterisierung der physikalisch-chemischen Parameter und der Bioaktivität von si-NPs vorgestellt und diskutiert. Um die si-NP-Bioaktivität schnell zu bewerten, wird Luciferase als Modell-Gen für Knockdown-Studien eingesetzt. Firefly Luciferase ist das Protein, das für das "Glühen" der Glühwürmchen 27 verantwortlich ist. Entsprechend erzeugen Säugetierzellen, die mit dem firefly luciferase-Gen transferiert werden, ein biolumineszierendes "Glühen", das mit einem Leuchtometer erfasst werden kann, um die Werte der Luciferase-Expression zu quantifizieren. Hier verwenden wir Luciferase, um die Bioaktivität von si-NPs zu bewerten, indem wir siRNA gegen Luciferase liefern und die entsprechende Reduktion der Biolumineszenz in Luziferase-Ausdruckszellen im Vergleich zu Zellen quantifizieren, die eine Rührei siRNA erhalten.
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Protocol
1. Vorbereitung und Charakterisierung von si-NPs
- si-NP Vorbereitung
- Polymere in 10 mM-Zitronensäure-Puffer (pH 4.0) bei 3,33 mg/mL auflösen. Polymer kann zunächst bei 10x Konzentration in Ethanol aufgelöst werden, um die Auflösung zu gewährleisten.
NOTE: Polymer kann in niedrigeren Konzentrationen aufgelöst werden, aber der Einsatz in Konzentrationen über 3,33 mg/mL kann eine homogene NP-Bildung verhindern. - Fügen Sie siRNA (50 μM in diH2 O)hinzu, um N+:P- Verhältnis von 10 zu ergeben. Polymer-und siRNA-Lösungen gründlich durch Pipettieren mischen und 30 min inkubieren lassen. Das N+:P- Verhältnis stellt die Anzahl der positiv geladenen Amminegruppen auf dem Polymer zur Anzahl der negativ geladenen Phosphatgruppen auf der siRNA dar und wird durch die folgende Formel berechnet:
Wo, mol Pol ist die molare Menge an Polymer, RU amine ist die Zahl der sich wiederholenden Einheiten von positiv geladenen Aminen pro Polymer, mol siRNA ist die molare Menge siRNA, und bp siRNA ist die Zahl der Basenpaare pro siRNA-Molekül. - Fügen Sie einen 5-fach überschuss von 10 mM Phosphatpuffer (pH 8.0) hinzu und mischen Sie sanft entweder durch Pipetting oder Umkehrung der Röhre. Um zu bestätigen, dass der endgültige pH-Wert neutral ist (~ 7,2-7,5), pipette 10 μL si-NP-Lösung auf pH-Teststreifen.
NOTE: Zitronensäure und Phosphatpuffer werden nach den Millipore Sigma Buffer Reference Center Charts zubereitet.
- Polymere in 10 mM-Zitronensäure-Puffer (pH 4.0) bei 3,33 mg/mL auflösen. Polymer kann zunächst bei 10x Konzentration in Ethanol aufgelöst werden, um die Auflösung zu gewährleisten.
- Physikalisch-chemische Charakterisierung von si-NPs
- Zeichnen Sie die Größe und Oberflächenaufladung der resultierenden Si-NPs mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) auf. Bereiten Sie eine DLS-Probe vor, indem Sie 1 mL si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) durch 0,45 μm Porengröße Spritzenfilter in einen quadratischen Quarz oder eine Polystyrren-Cuvette filtern. Rekordgröße und Flächenlademessungen mit einem DLS-Instrument nach Herstellerangaben.
- Bestätigen Sie die Größe und Morphologie von si-NPs durch die bildgebende Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
- 5 μL si-NP-Lösung bei 1 mg/mL zu TEM-Gittern hinzufügen und für 60 s inkubieren.
- 5 μL von 3% Uranyl-Acetatlösung hinzufügen und für 20 s inkubieren. Für 3 s trocken schlagen. Trockene Netze über Nacht unter Trocknung.
- Bildgitter nach dem Protokoll, das für das jeweilige Mikroskop eingerichtet wurde.
- Charakterisieren Sie die Belastung von siRNA in si-NPs an verschiedenen N+:P- Verhältnissen mit Agarose Gel-Retarung.
- Um 2% Acharose zu erzeugen, fügen Sie 2 g Elektrophorese-Ature-Pulver zu 100 ml 1x TAE (Tris-Acetate-EDTA) Puffer bei pH 8.0 hinzu. Rühren, um agentstanden. Hitze, die von Mikrowelle bedeckt ist, bis alle Acharose aufgelöst sind (1-3 min).
- Nach dem Abkühlen 5 μL Ethidiumbromid (10 mg/mL in H2 O)hinzufügen und gut vermischen. Gießen Sie den Awant in ein Gel-Tablett und legen Sie den Kamm, um Brunnen zu produzieren, so dass der Kamm 30 Minuten lang trocknen kann. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm, um Brunnen zu hinterlassen, und füllen Sie das Gel-Tablett bis zur maximalen Fülllinie mit 1x TAE-Puffer.
- Generieren Sie si-NPs (nach dem oben genannten Verfahren) bei 0,1,2,5,7,10,20,Und 40 N+:P- Verhältnisse. 2 μL Aliquots von Ladefarbstoff (keine SDS und Reduktionsmittel) auf Paraffinfolie für jede si-NP-Formulierung legen. Mischen Sie 10 μL si-NP Lösung mit Ladefarbe auf Paraffin-Film per Pipette.
- Fügen Sie si-NP/Ladefarbfarblösungen zu agarose Gelbrunnen hinzu. Führen Sie die Spannungsquelle bei 100 V für 35 min aus (oder bis die Proben 80% der Gel-Länge durchlaufen haben).
- Visualisieren siRNA-Bands auf einem UV-Transilluminator nach Herstellerangaben.
- Bestätigen Sie die Größe und Morphologie von si-NPs durch die bildgebende Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
2. Bestimmung der In-vitro-Bioaktivität von si-NPs
- Knockdown des Modell-Gens luciferase
- Generieren Sie luciferase si-NPs (nach dem oben genannten Verfahren) mit luciferase siRNA und Rührei si-NPs mit einer Rührei siRNA-Sequenz als Steuerung. Formualte sowohl si-NPs bei der gleichen endgültigen N+:P- Verhältnis und bei der optimalen Quote, die durch agarose Gel-Rastungsstudien identifiziert wird. Beispiel siRNA-Sequenzen sind in der Materialtabelleenthalten.
- Saatgutluziferase-Ausdruckzellen [MDA-MB-23olleinhalbLuciferase (Bsd) stabile Zellen] in 96-gut schwarz-wandigen Platten mit einer Dichte von 2.000 Zellen pro Brunnen. In einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2,95% Luftfeuchtigkeit) über Nacht in vollen Medien (DMEM, 10% FBS) einbleiben lassen.
- Für einen Endvolumen von 100 μL pro Brunnen und siRNA-Konzentration von 100 nM verdünnen Sie si-NPs in Voll-Serum-Medien. Zellen für 24 Stunden mit si-NPs behandeln.
- Nach 24 Uhr die Behandlungen entfernen und die Medien durch ein vollständiges Serummedium ersetzen, das 150 μg/mL D-luciferin enthält. Inkubieren Sie Zellen für 5 Minuten, bevor Sie die Lumineszenz auf einem Plattenleser oder in vivo optisches Bildgebungssystem nach den Vorgaben des Herstellers messen.
- Ersetzen Sie luciferin-haltige Medien durch frische, vollständige Serummedien und Inkubat 24 Stunden mehr. Wiederholen Sie den Schritt oben, entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie durch volle Serummedien mit 150 μg/mL D-luciferin, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation vor der Messung der Lumineszenz am 48-h-Zeitraffer.
- Bei Längsschnittstudien die Zellen unter sterilen Bedingungen halten und dabei die Lumineszenz messen. Weiter die Kultur in frischen, vollen Medien zwischen Messungen nach dem Austausch von luciferin-enthalten.
Hinweis: Die entsprechende siRNA-Konzentration variiert mit verschiedenen si-NP-Molekülen und siRNA-Molekülen. Bei der Verwendung von neutral geladenen Polyplexen mit einem endosomolytischen Kern (z.B. PEG-DB) ist 100 nM von den Zellen typischerweise gut verträglich und produziert & gt;75% luciferase Knockdown. Das Massenverhältnis von PEG-DB zu siRNA bei 10 N+:P- Verhältnis und 100 nM siRNA-Behandlungen (unter der Annahme von 26 bp siRNA) beträgt 23,3, d.h. addieren 23,3 ng PEG-DB für jede 1,0 ng siRNA. Zum Beispiel 1,16 μL von 3,33 mg/mL Polymer für 166.5 ng siRNA hinzufügen, um einen gut bei 100 nM in einer 96-well-Platte (100 ml Medienvolumen pro Brunnen) zu behandeln.
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Representative Results
Einige wesentliche Merkmale der effektiven si-NPs für die In-vivo siRNA-Lieferung sind die richtige Größe (~ 20 – 200 nm Durchmesser), siRNA-Verpackungen und Gen-Schweigenden Bioaktivität. Obwohl es sich hierbei nicht um eine erschöpfende Liste handelt (wie in der Diskussion angesprochen), sollten diese grundlegenden Merkmale bestätigt werden, bevor eine weitere Prüfung einer Formulierung in Erwägung gezogen wird.
Abbildung 2 veranschaulicht die Charakterisierung von si-NP-Größe und Oberflächenaufladung bei der Formulierung. DLS und TEM werden als komplementäre Methoden verwendet, um si-NP-Größe (beide), Polydispersität (DLS) und Morphologie (TEM) zu beobachten. DLS-Messungen zeigen, dass si-NP 1 einen durchschnittlichen Durchmesser von 35 nm hat, eine unimodale Verteilung, die durch das Vorhandensein eines einzigen Peaks gekennzeichnet ist, und eine geringe Polydispersität, die durch eine relativ schmale Spitzenbreite angezeigt wird (Abbildung 2A). TEM-Messungen bestätigen die Größenmessung von DLS, deuten auf eine einheitliche Population von si-NPs hin und zeigen die sphärische Morphologie der si-NPs (Abbildung 2C). DLS und TEM-Messungen von si-NP 2 zeigen, dass es eine unerwünschte Größe (& gt;200 nm Durchmesser) von durchschnittlichem Durchmesser von 1.500 nm, einer multimodalen und polydispersen Population, und Aggregate in der Lösung hat, die keine eindeutige Partikelmorphologie bilden (Abbildung 2B, D ). Die beiden si-NPs 1 und 2 weisen eine neutrale Oberflächenaufladung auf, die durch nahezu null mittlere Zeta-Potenzialwerte angezeigt wird (Abbildung 2E).
Die Beladung der Effizienz von siRNA in si-NPs wird durch einen Atur-Gel-Remardierations-Test charakterisiert. Unvervollerte siRNA wandert durch das Agergrat-Gel und wird (durch Bindung von Ethidiumbromid) am Gel-Boden visualisiert. Wenn siRNA mit dem Polymer zu si-NPs vervollarbeitet wird, wird die Migration durch das Agarchgel behindert und siRNA wird an der Gelfelle visualisiert (oder wo es in Brunnen geladen wurde). Für PEG-DB-basierte si-NPs erhöht sich die Komplexität mit steigenden N+:P- Verhältnissen, bis die vollständige Komplexierung bei ~ 10-20 N+:P- Verhältnis erreicht ist (Abbildung3).
Luciferase wird als Modell-Gen für die schnelle Beurteilung der si-NP Gen-Schweige-Bioaktivität verwendet. Die Biolumineszenz-Messungen über einen Plattenleser oder im vivo-optischen Bildgebungssystem ermöglichen eine schnelle, hochdurchsatzfähige Quantifizierung des Luziferase-Proteinausdrucks im gutplattigen Format. Diese Technik ist wesentlich schneller, billiger und weniger belastend als die Analyse des Gen-Schweigens durch traditionelle molekulare Analysen wie PCR (Genexpression) und Western Blot (Proteinexpression). Auf diese Weise werden die Luciferase-Ausdruckzellen mit Luciferase-si-NPs und Rührung si-NPs (als Kontrolle) behandelt, und% Luciferase-Aktivität wird berechnet, indem Lumineszenzsignal mit unbehandelten Zellen verglichen wird. Bioaktive Luciferase-si-NPs werden im Vergleich zu Rührung si-NP eine signifikant verminderte% Luziferase-Aktivität aufweisen, wie bei si-NP 1 in Abbildung4 zu sehen ist. Im Gegensatz dazu werden Luciferase-si-NPs, die im Vergleich zur Rührei si-NP (wie si-NP 2) nicht% Luziferase-Aktivität reduzieren, nicht als bioaktiv angesehen (Abbildung4). Oft sind 48 Stunden die Zeit des maximalen Gen-Schweigens (Abbildung 4), aber wir haben signifikante Gen-Schweigung zu Zeitpunkten von 24 Stunden bis 240 Stunden nach der Behandlung beobachtet.
Bild 1. Polymerchemie und si-NP Schemata. (A) Chemische Zusammensetzung des PEG-DB-Diblock-Copolymers, das si-NPs zusammensetzt und eine neutrale Oberflächenladung (PEG-Block) und pH-rechendendes Verhalten (DB-Block) verleiht. B) Selbstmontage von si-NPs. Bei pH 4.0 ist DB Block wasserlöslich, da DMAEMA tertiäre Amine stark protoniert. Der positiv geladene DB Block vergleicht elektrostatisch negativ aufgeladene siRNA-Moleküle. Der pH-Wert wird dann durch den Zusatz von 5x pH 8,0 Phosphatpuffer auf ~ 7.4 eingestellt, was zu einer " Hydrophobization" von DB-Block und der Sequestration von siRNA und DB im Kern von si-NPs führt.
Bild 2. DLS und TEM-Charakterisierung der si-NP-Größe, Oberflächenaufladung und Morphologie. (A, C) si-NP 1 stellt eine gleichmäßige Probe mit entsprechender Größe (~ 50-100 nm Durchmesser) dar, während (B, D) si-NP 2 unerwünschte, große und polydisperse Aggregate gebildet hat. (E) Beide si-NPs weisen eine nahezu neutrale Oberflächenaufladung auf (Zeta-Potenzial). Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3. Agarose Gel Retardation Test zur Beurteilung si-NP siRNA-Belastungseffizienz. Das Verschwinden der siRNA-Bänder am Gel-Boden deutet auf eine Komplexierung von siRNA zu Polymer hin. Polymerkomplexe siRNA ist nicht in der Lage, durch das Gel zu wandern und wird so oben auf dem Gel in der Nähe der Ladebrunnen visualisiert. Da das N+:P- Verhältnis erhöht wird, erhöht sich die siRNA-Komponation, wie die verminderte Intensität des siRNA-Bandes am Gelboden zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 4. Si-NP-vermittelter Knockdown des Modell-Gens Luciferase in Luciferase MDA-MB-231 Zellen. Luciferase-Aktivität bei (A) 24 h und (B) 48 h Nachbehandlung mit entweder Rührung si-NPs oder luciferase si-NPs bei 10 N+:P- Verhältnis und 100 nM siRNA-Dosis. % Luziferase-Aktivität wird berechnet, indem das Lumineszenzsignal von Behandlungsproben (Rührei und Luziferase) durch das Lumineszenzsignal unbehandelter Zellen geteilt wird. NOTE: si-NP 1 stellt eine wirksame Formulierung mit Gen-Schweige-Bioaktivität dar, während si-NP 2 eine Formulierung ohne Genverstauensbioaktivität darstellt. (*) zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied (p < 0,05) im Vergleich zur Scramlamgruppe für eine Formulierung zu einem bestimmten Zeitpunkt an. Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die hier beschriebenen si-NPs werden durch die elektrostatische Assoziation von anionischen siRNA und kationischen Polymeren zu Polyionenkomplexen (Polyplexe) gebildet. Die elektrostatische Verkomplexung von siRNA und dem kationischen DB-Block von PEG-DB-Polymeren wird durch das Mischen mit niedrigem pH-Wert (4.0) erleichtert. Bei pH 4.0 ist DMAEMA hoch protoniert, und damit ist der DB-Block hoch aufgeladen. Damit wird sichergestellt, dass sich die Polymere als Eindringlinge in der Lösung auflösen und keine Mikellen bilden und DB-Komplexe mit siRNA effizient auflösen. Anschließend wird der pH-Wert der Lösung auf neutral (pH 7,4) eingestellt, was zu einer "Hydrophobiierung" des DB-Blocks, der Mizellbildung und der Verstrickung der vervollstänzerten siRNA in den Kern der resultierenden Polyplexe führt. Diese Polyplexe sind so konzipiert, dass PEG eine hydrophile, inerte Schale um den DB/siRNA-Kern bildet, was zu einer neutralen Oberflächenaufladung führt, die für die systemische Verwaltung notwendig ist. Die Polymerchemie und der Prozess der Polyplexbildung sind in Abbildung1 dargestellt.
Eine strenge physikalisch-chemische Charakterisierung von si-NPs ist entscheidend für die Bestimmung, ob Formulierungen geeignet sind, um in biologische Tests einzusteigen. Größe, Oberflächenaufladung und Partikelmoshape/Morphologie sind wichtige Parameter, die die biologische Leistungsfähigkeit beeinflussen können. Für die systemische Lieferung an Tumoren sollte die si-NP-Größe zwischen 20 – 200 nm Durchmesser22fallen, und jüngste Studien legen nahe, dass 20 – 50 nmDurchmesser Partikel ideal sind. Die Oberflächenaufladung sollte neutral oder leicht negativ sein, um die Proteinadsorption und Opsonisierung 28 zu minimieren. Studien haben den Zusammenhang zwischen Partikelform und Pharmakokinetiker/Partikelräumung untersucht, was darauf hindeutet, dass Partikelmithohem Seitenverhältnis über kugelförmige Partikel 29,30,31wünschenswert sind. Bis heute werden jedoch Wirbelpartikel am häufigsten eingesetzt und sind unseres Wissens die einzige Teilchenform, die in die Humanstudien in der Onkologie übersetzt wurde.
Es ist wichtig zu beachten, dass die gleichmäßige und gleichmäßige Bildung von Polyplexen, wie die hier vorgestellten si-NPs, von einer Reihe physikalisch-chemischer Parameter abhängt. Wir haben empirisch festgestellt, dass die Polyplexkonzentration, der pH-Wert der Lösung und das Verhältnis von Polymer zu siRNA (N+:P- Verhältnis) die Polyplexbildung drastisch beeinflussen. In unseren Händen hat die siRNA-Konzentration keinen großen Einfluss auf die Polyplexbildung, aber die Verwendung von Polymerkonzentrationen von mehr als 3,33 mg/mL führt zu einer Bildung von großen Aggregaten und einer inkonsistenten Polyplexgröße. Da diese si-NPs pH-ansprechbar sind, kann es zu einer Vielzahl von Problemen kommen, wenn der letzte pH-Wert von si-NP zu sauer ist (< pH 7.2). Zwei Möglichkeiten, diese Komplikationen zu verhindern, sind die Lyophili-Polymere in reinem diH2 O,so dass es keine Salze gibt, um die Pufferzusammensetzung bei der Auflösung zu ändern und Puffer häufig wieder herzustellen, um das "Abdriften" des PufferpH-Puffers im Laufe der Zeit zu verhindern. Um vorsichtig zu sein, sollte der pH-Wert der Puffer jedes Mal bestätigt werden, bevor si-NPs gemacht werden, und der endgültige pH-Wert von si-NP Lösungen sollte immer überprüft werden. Schließlich wirkt sich das N+:P- Verhältnis von si-NPs auf siRNA-Belastungseffizienz und polyplexphysikologische Parameter aus. Es gibt in der Regel einideales N +:P- Verhältnis, bei dem alle siRNA geladen wird, aber es gibt keine Überfülle von unkomplexem Polymer, das separate Populationen von Mikellen bildet und die Zytotoxizität erhöht. Für die hier vorgestellten si-NPs ist N+:P-10-20der Bereich, in dem optimale Konsistenz und Leistung eingehalten wurden.
Luciferase-Reporter-Zelllinien werden hier für die schnelle und hochdurchsatz-Analyse der si-NP-Bioaktivität eingesetzt. Luciferase-Reporter-Zelllinien müssen vor Beginn der Bioaktivitätsanalyse erzeugt oder gekauft werden, so dass eine erste Investition in Zeit und Kosten erforderlich ist. Allerdings ist der Einsatz der Luciferase-Reporterzellen zur Beurteilung des Gen-Schweigens schneller, zugänglicher für eine Hochdurchsatz-Analyse und im Laufe der Zeit billiger als die Durchführung von RT-PCR (zur Messung der mRNA-Expression) oder der westlichen Blots (zur Messung der Proteinexpression). Zum Beispiel dauert die Messung der Lumineszenz in diesem Test in der Regel nur wenige Minuten im Gegensatz zu Ganztages-oder Mehrtagesprozessen, die notwendig sind, um RT-PCR oder westliche Flecken durchzuführen. Darüber hinaus können Lumineszenz-Messungen auf gut Platten durchgeführt werden, was die gleichzeitige Quantifizierung vieler Proben ermöglicht (bis zu 96-Brunnenplatten wurden von den Autoren verwendet). Schließlich ist D-luciferin das einzige Reagenz, das über die typischen Zellkultur-Reagenzien hinaus benötigt wird, was die Methode deutlich erschwinglicher macht als RT-PCR oder Western Blot. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass der Luciferase-Reporterzellen-Assay nur auf die Beurteilung der Genverstauschung des Modells Gen-Luciferase beschränkt ist und nicht zur Messung des Gen-Schweigens anderer "therapeutischer Gene" von Interesse verwendet werden kann. So verweisen die Autoren die Leser auf mehrere Studien, in denen RT-PCR and/oder Western Blot verwendet wurde, um die Gen-Schweigung von therapeutischen Genen von Interesse 24,32,33,34 zu bewerten.
Neben der Bioaktivität sollten die Forscher idealerweise ein umfassendes Spektrum an In-vitro-biologischen Tests in Betracht ziehen, um die si-NP-Leistung zu charakterisieren. Der oben beschriebene Luciferase-Test kann auch zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit verwendet werden, indem das Lumineszenzsignal von Rührei si-NP behandelten Zellen mit unbehandelten Zellen verglichen wird. Da es sich bei der siRNA um eine berührungslose Sequenz handelt, kann jede Veränderung der Lumineszenz auf die unspezifischen Auswirkungen der si-NPs auf die Zelllebensfähigkeit zurückgeführt werden, und dieser Effekt hängt in der Regel von der Polymerchemie und der molaren Menge ab. Techniken in der Strömungszytometrie und der fluoreszierenden Mikroskopie können verwendet werden, um die Zellaufnahme von si-NPs anhand von fluoreszierbaren siRNAs, Polymeren oder beidem zu beurteilen. Darüber hinaus können molekulare Techniken wie Stem-Loop PCR und Argonaut 2 Immunsystem eingesetzt werden, um intrazelluläre siRNA-Werte präzise zu messen. Da siRNA nur bioaktiv ist, wenn es an das Zytosol geliefert wird, wo es in RISC geladen wird, müssen si-NPs eine endosomale Escape-Escape-Escape-Escape-Escape-Escape-Auszeit auslösen, sobald sie von der Zelle verinnerlicht ist. Assays zur experimentellen Messung der endosomalen Escape-Escape-Escape-Escape-Untersuchung (beschrieben von Evans et al. 35), fluoreszierende Abbildung der Kolokalisierung von fluoreszierend beschrifteten si-NP-Fracht und LysoTracker36, und Zuletzt war die fluoreszierende Abbildung der Rekrutierung von Galectin 8 zu gepunkteten endosomalen Bläschen 37,38. Das Sammeln von Daten und die Synthese der Ergebnisse aus In-vitro-Experimenten für Zelllebensfähigkeit, Zellaufnahme, endosomale Flucht und Bioaktivität liefern dem Forscher ergänzende Informationen, aus denen Interpretationen gezogen und mechanistisch zu gewinnen Einsicht über si-NP (in) Wirksamkeit.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Nanopartikel, die in der Lage sind, siRNA effizient zu liefern, ein enormes Potenzial zur Behandlung von Krankheiten haben. In der Onkologie beispielsweise sind viele Gene, die den Fortschrittsverlauf von Krebs, die Resistenz gegen die Therapie und die Metastasen verursachen, von der konventionellen Pharmakologie "nicht rugdfähig", könnten aber mit siRNA behandelt werden. Voraussetzung für den Einsatz in tierischen Krankheitsmodellen erfordern siRNA-Nanomedikine (hier si-NPs genannt) jedoch eine umfassende physikalisch-chemische und biologische Charakterisierung, um ihre Sicherheit und Wirksamkeit zu gewährleisten. Zu diesem Zweck wurden hier Methoden zur Herstellung und Charakterisierung von si-NPs in vitro beschrieben, mit denen die si-NPs auf Eignung hin in Tierstudien bewertet werden können.
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Disclosures
Die Autoren offenbaren keine möglichen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Craig Duvall und Rebecca Cook für den Zugang zu Daten und Laborressourcen für die Durchführung dieser Forschung. Die Autoren danken dem Vanderbilt Institute for Nanoscale Science and Engineering (VINSE) für den Zugang zu den Instrumenten DLS und TEM (NSF EPS 1004083). Die Autoren sind der National Science Foundation dankbar, dass sie das Graduate Research Fellowship Program (NSF#1445197) unterstützt hat. Die Autoren danken den National Institutes of Health für die finanzielle Unterstützung (NIH R01 EB019409). Die Autoren danken dem Programm "Department of Defense Congressionally Directed Medical Research" für finanzielle Unterstützung (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
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