Summary
Sono presentati metodi per preparare e caratterizzare le proprietà fisico-chimiche e la bioattività delle nanoparticelle siRNA reattive al pH neutralmente caricate. Sono discussi i criteri per le nanomedicine siRNA di successo come le dimensioni, la morfologia, la carica superficiale, il carico di siRNA e il silenziamento genico.
Abstract
Il successo di siRNA come medicina molecolare mirata dipende dalla sua efficace somministrazione citosolica alle cellule all'interno del tessuto della patologia. È stato raggiunto il successo clinico per il trattamento degli obiettivi di malattia epatica precedentemente "non ondulabili" con siRNA. Tuttavia, efficace somministrazione di siRNA tumorale richiede ulteriori considerazioni di progettazione farmacocinetica, tra cui lungo tempo di circolazione, l'evasione degli organi di clearance (ad esempio, fegato e reni), e la penetrazione del tumore e ritenzione. Qui descriviamo la preparazione e la caratterizzazione fisico-chimica/biologica in vitro di nanoparticelle polimeriche progettate per una consegna efficiente del siRNA, in particolare per i tessuti non epatici come i tumori. Le nanoparticelle di siRNA sono preparate con la complessazione elettrostatica di siRNA e il diblock Copolimero Poly (etilene glicole-b-[2-(dimethylamino) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB) per formare complessi poliionici ( polyplexes) dove siRNA è sequestrato all'interno del nucleo Polyplex e PEG forma una corona idrofila, neutralmente caricata. Inoltre, il blocco DB diventa membrana-Lisica come vescicole della via endolysosomiale acidificante (< pH 6,8), innescando la fuga endosomiale e la somministrazione citosolica di siRNA. Sono descritti i metodi per caratterizzare le caratteristiche fisico-chimiche delle nanoparticelle di siRNA, come la dimensione, la carica superficiale, la morfologia delle particelle e il caricamento del siRNA. La bioattività delle nanoparticelle di siRNA viene misurata utilizzando la luciferasi come gene modello in un saggio di silenziamento genico rapido e ad alto rendimento. I disegni che superano questi test iniziali (come i poliplexi basati su PEG-DB) sono considerati appropriati per la traduzione in studi preclinici sugli animali che valutano la somministrazione di siRNA a tumori o altri siti di patologia.
Introduction
Poiché i siRNA inibiscono la traduzione delle proteine dalle sequenze di mRNA, possono teoricamente essere usati per la droga tutte le patologie conosciute1,2,3,4,5. Tuttavia, l'uso di siRNA in medicina è limitato dal profilo farmacocinetico globalmente scarso delle molecole di siRNA6,7. Quando iniettato per via endovenosa, i siRNA vengono rapidamente cancellati attraverso i reni e/o degradati dalle nucleasi8,9. A causa delle sue grandi dimensioni e della carica negativa, siRNA non può entrare nelle cellule o sfuggire alla via endolysosomiale per accedere al complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) che risiede nel citosol10,11,12, 13. la Così, ampio sforzo si è concentrato sulla progettazione e l'attuazione delle strategie di consegna siRNA14. Questo sforzo si è concentrato principalmente sullo sviluppo di nanoparticelle a base lipidica e polimerica che confezionano siRNA, la proteggono dalla clearance e dalla degradazione in vivo, e avviano l'assorbimento cellulare e la fuga endosomiale attraverso gruppi ionizzabili di ammina cationica. Molti successi pre-clinici sono stati segnalati e, più recentemente, è stato riportato il primo successo clinico per la somministrazione di siRNA epatica basata su nanoparticelle per il trattamento dell'amiloidosi ereditaria da transthyretina (hATTR)15.
Ci sono molti geni che causano il cancro che sono attualmente "ondulabili" dalla farmacologia convenzionale (cioè farmaci di piccole molecole), motivando la progettazione di nanoparticelle polimerica siRNA (si-NPs) per il trattamento del cancro16. Tuttavia, ci sono un insieme separato di parametri di progettazione che devono essere considerati per la consegna non epatica siRNA. Il sistema di erogazione deve proteggere la carica cationica del Polyplex che provoca l'agglutinazione all'interno della circolazione sistemica17,18,19. Per la somministrazione del tumore, in particolare, la stabilità si-NP è essenziale per dotare la lunga circolazione e quindi un aumento dell'accumulo all'interno dei tumori tramite l'effetto di permeabilità e ritenzione potenziata (EPR)20,21. Inoltre, il controllo sulle dimensioni si-NP è essenziale poiché solo le nanoparticelle di circa 20 – 200 Nm di diametro in dimensioni sfruttano EPR22, e più piccoli si-NPS (~ 20 – 50 Nm di diametro) mostrano una migliore penetrazione del tumore su nanoparticelle di dimensioni maggiori e microparticelle23.
Per ovviare a questi vincoli di progettazione aggiuntivi per la somministrazione di tumore sistemico di siRNA dopo somministrazioni endovenose, sono stati sviluppati (Figura 1)24il pH-NPS reattivo. Questi si-NP sono pegilati, o più recentemente, Zwitterionated25, per la carica superficiale neutrale e la resistenza all'adsorbimento proteico e opsonizzazione in circolazione. Poiché non possono affidarsi esclusivamente al carattere cationico per guidare la consegna intracellulare, la fuga endosomiale estremamente efficiente è indispensabile per ottenere un potente silenziamento genico. Di conseguenza, il nucleo di questi si-NPs è composto da un nucleo altamente endosomolitico che è inerte a pH extracellulare (7,4), ma che viene innescato in modo simile a un interruttore nelle condizioni acidificate della via endolysosomiale [pH 6,8 (primi endosomi) – 5,0 ( lisosomi)]. Infine, una miscela di contenuto cationico e idrofobico all'interno del nucleo di si-NPs fornisce sia le forze di stabilizzazione elettrostatiche e Van der Waals, migliorando la stabilità del si-NP nel sangue rispetto ai sistemi semplicemente cationici.
L'integrazione di molte funzioni in un design relativamente semplice è possibile utilizzando la polimerizzazione controllata di trasferimento della catena di addizione reversibile (RAFT) per produrre polimeri con un'architettura complessa e una composizione precisa. Per produrre si-NPs con carica superficiale neutra, pH-reattività, e stabilità NP, zattera è usato per sintetizzare poli (etilene glicole-b-[2-(dimetilammonio) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). PEG-DB è elettrostaticamente complessato con siRNA, formando si-NPs con una corona PEG e DB/siRNA nucleo (Figura 1B). PEG forma uno strato idrofilo inerte e neutralmente caricato sulla corona si-NP. Il blocco DB è costituito da un rapporto molare 50:50 di 2-(dimethylamino) etil metacrilato (DMAEMA) e butile metacrilato (BMA). Cationic DMAEMA elettrostaticamente complessi siRNA caricato negativamente. BMA self-Associates all'interno del nucleo NP da Van der Waals interazioni, aumentando la stabilità NP. Insieme, DMAEMA e BMA impartiscono il comportamento lipidico-lisico del pH-dipendente al blocco polimerico DB. A pH extracellulare, il blocco DB viene sequestrato al nucleo si-NP ed è inerte ai bilayer lipidici. In condizioni acide, come quelle all'interno della via endolysosomiale, la DMAEMA ionizzabile all'interno del blocco DB facilita l'effetto della spugna protonica, dove il buffering endosomiale conduce al gonfiore osmotico e alla rottura26. Inoltre, le frazioni di BMA idrofobica all'interno del blocco DB si integrano attivamente e Lisano i bilayer lipidici, con conseguente potente endosomolisi. Pertanto, siRNA è complessato con PEG-DB per formare si-NPs che sono neutralmente caricati e altamente stabili a pH extracellulare ma che interrompono i bilayer lipidici a pH acido, assicurando la consegna citosolica del payload siRNA.
Qui sono descritte le procedure sperimentali per produrre si-NPs da PEG-DB. I metodi per caratterizzare i parametri fisico-chimici e la bioattività di si-NPs sono presentati e discussi. Al fine di valutare rapidamente la bioattività si-NP, la luciferasi viene utilizzata come gene modello per gli studi di knockdown. Firefly luciferase è la proteina responsabile del ' bagliore ' delle lucciole27. Di conseguenza, le cellule di mammiferi trasfusate con il gene lucciola luciferasi producono un "bagliore" bioluminescente che può essere catturato utilizzando un luminometro per quantificare i livelli di espressione di luciferasi. Qui, usiamo luciferase per valutare la bioattività di si-NP fornendo siRNA contro luciferase e quantificando la corrispondente riduzione della bioluminescenza nelle cellule che esprimono luciferasi rispetto alle cellule che ricevono un siRNA criptato.
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Protocol
1. preparazione e caratterizzazione di si-NPs
- preparazione si-NP
- Sciogliere il polimero in tampone di acido citrico da 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. Il polimero può prima essere sciolto con una concentrazione di 10 volte in etanolo per garantire la dissoluzione.
Nota: il polimero può essere disciolto a concentrazioni inferiori, ma l'uso a concentrazioni superiori a 3,33 mg/mL può impedire la formazione di NP omogenee. - Aggiungere siRNA (50 μM in diH2O) per determinare N+:P- rapporto di 10. Miscelare accuratamente le soluzioni di polimero e siRNA pipettando e lasciar Incubare per 30 minuti. Il rapporto N+:P rappresenta il numero di gruppi di ammine caricati positivamente sul polimero al numero di gruppi di fosfato caricati negativamente sul siRNA ed è calcolato dalla seguente formula:
dove, mol Pol è la quantità molare del polimero, l'ammina RU è il numero di unità ripetute di ammine cariche positivamente per polimero, mol siRNA è la quantità molare di siRNA, e BP siRNA è il numero di coppie di base per molecola siRNA. - Aggiungere 5 volte l'eccesso di tampone fosfato di 10 mM (pH 8,0) e mescolare delicatamente pipettando o invergendo il tubo. Per confermare che il pH finale è neutro (~ 7.2-7.5), Pipettare 10 μL di soluzione si-NP su strisce di prova di pH.
Nota: i tamponi di acido citrico e fosfato sono preparati secondo i grafici del centro di riferimento di Millipore Sigma buffer.
- Sciogliere il polimero in tampone di acido citrico da 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. Il polimero può prima essere sciolto con una concentrazione di 10 volte in etanolo per garantire la dissoluzione.
- Caratterizzazione fisochimica di si-NPs
- Registrare le dimensioni e la carica superficiale dei risultanti si-NPs usando la dispersione luminosa dinamica (DLS). Preparare un campione DLS filtrando 1 mL di si-NPs (0,1-1,0 mg/mL) attraverso filtri per siringa da 0,45 μm in una cuvetta quadrata in quarzo o polistirolo. Misura delle dimensioni e della carica superficiale utilizzando uno strumento DLS secondo le specifiche del produttore.
- Confermare le dimensioni e la morfologia di si-NPs mediante analisi di imaging mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
- Aggiungere 5 μL di soluzione si-NP a 1 mg/mL alle griglie TEM e incubare per 60 s. asciugare per 3 s.
- Aggiungere 5 μl di soluzione di acetato di uranile al 3% e incubare per 20 s. asciugare per 3 s. griglie a secco durante la notte sotto essiccamento.
- Griglie immagine secondo il protocollo stabilito per il microscopio specifico da utilizzare.
- Caratterizzare il carico di siRNA in si-NPS a vari N+:P- indici utilizzando il ritardo del gel di agarosio.
- Per produrre 2% gel di agarosio, aggiungere 2 g di polvere di agarosio di grado elettroforesi a 100 mL di 1 tampone TAE (tris-acetato-EDTA) a pH 8,0. Mescolare per sospendere l'agarosio. Calore scoperto nel forno a microonde fino a quando tutto l'agarosio è sciolto (1-3 min).
- Una volta raffreddato, aggiungere 5 μL di bromuro di etidium (10 mg/mL in H2O) e mescolare bene. Versare l'agarosio in un vassoio di gel e posizionare il pettine per produrre pozzi, lasciando asciugare per 30 minuti. rimuovere con cautela il pettine per lasciare dietro i pozzi di carico, e riempire il vassoio di gel alla linea di riempimento max con 1x tampone TAE.
- Generare si-NPs (secondo la procedura di cui sopra) a 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, e 40 N+:P- indici. Posizionare 2 μL di aliquote di colorante di carico (senza SDS e agenti riducenti) sulla pellicola di paraffina per ogni formulazione di si-NP. Miscelare 10 μL di soluzione si-NP con colorante di carico su pellicola di paraffina mediante pipetta.
- Aggiungere si-NP/caricare le soluzioni coloranti ai pozzi di gel di agarosio. Eseguire la tensione di alimentazione a 100 V per 35 min (o fino a quando i campioni sono attraversati 80% della lunghezza del gel).
- Visualizza le bande siRNA su un transilluminatore UV secondo le specifiche del produttore.
- Confermare le dimensioni e la morfologia di si-NPs mediante analisi di imaging mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
2. determinazione della bioattività in vitro di si-NP
- Knockdown del modello gene luciferasi
- Generare luciferasi si-NPS (secondo la procedura di cui sopra) utilizzando luciferasi siRNA e strapazzate si-NPS utilizzando una sequenza siRNA strapazzate come un controllo. Formualte sia si-NPs allo stesso finale N+:P- ratio e al rapporto ottimale identificato dagli studi di ritardo del gel di agarosio. Le sequenze siRNA di esempio sono incluse nella tabella dei materiali.
- Cellule che esprimono la luciferasi del seme [MDA-MB-231/luciferase (BSD) celle stabili] in 96-piastre a parete nera con una densità di 2.000 cellule per pozzo. Lasciar aderire durante la notte nei media completi (DMEM, 10% FBS) in un incubatore (37 ° c, 5% CO2, 95% di umidità).
- Diluire si-NPs in media sierica completa per un volume finale di 100 μL per pozzetto e la concentrazione di siRNA di 100 nM. Trattare le cellule per 24 h con si-NPs.
- Dopo 24 h, rimuovere i trattamenti e sostituire il supporto con un supporto siero pieno contenente 150 μg/mL D-luciferina. Incubare le cellule per 5 minuti prima di misurare la luminescenza su un lettore di piastre o un sistema di imaging ottico in vivo secondo le specifiche del produttore.
- Sostituire i supporti contenenti luciferina con supporti di siero freschi e pieni e incubare 24 ore in più. Ripetere il passaggio precedente, rimuovendo i supporti e sostituendo con un supporto siero pieno contenente 150 μg/mL D-luciferina, seguita da un'incubazione di 5 minuti prima di misurare la luminescenza al punto temporale 48 h.
- Per gli studi longitudinali, mantenere le cellule in condizioni sterili durante la misurazione della luminescenza. Continuare la coltura in media fresco e pieno tra le misurazioni dopo la sostituzione di luciferina-contenente.
Nota: la concentrazione appropriata di siRNA varierà con diverse molecole di si-NPs e siRNA. Quando si utilizzano poliplexi neutralmente caricati con un nucleo endosomolitico (ad esempio PEG-DB), 100 nM è tipicamente ben tollerato dalle cellule e produce > 75% di knockdown di luciferasi. Il rapporto di massa di PEG-DB a siRNA a 10 N+:P- ratio e 100 Nm siRNA trattamenti (assumendo 26 BP sirna) è 23,3, cioè, aggiungere 23,3 ng di PEG-DB per ogni 1,0 ng di siRNA. Ad esempio, aggiungere 1,16 μL di 3,33 mg/mL di polimero per 166,5 ng di siRNA per trattare un pozzo a 100 nM in una piastra 96-well (100 mL di volume media per pozzo).
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Representative Results
Alcune caratteristiche essenziali di efficace si-NPs per la consegna in vivo siRNA sono la dimensione corretta (~ 20 – 200 Nm di diametro), siRNA imballaggio, e la bioattività di silenziamento genico. Anche se questo non è un elenco esaustivo (come affrontato nella discussione), queste caratteristiche di base devono essere confermate prima di considerare ulteriori test di una formulazione.
La Figura 2 illustra la caratterizzazione delle dimensioni e della carica superficiale di si-NP al momento della formulazione. DLS e TEM sono utilizzati come metodi complementari per osservare le dimensioni del si-NP (entrambi), la polidispersità (DLS) e la morfologia (TEM). Le misurazioni DLS mostrano che si-NP 1 ha un diametro medio di 35 Nm, una distribuzione unimodale indicata dalla presenza di un singolo picco e una bassa polidispersione indicata da una larghezza di picco relativamente stretta (Figura 2a). Le misurazioni TEM confermano la misura delle dimensioni da DLS, suggeriscono la presenza di una popolazione uniforme di si-NPs, e rivelano la morfologia sferica del si-NPs (Figura 2C). Le misurazioni DLS e TEM di si-NP 2 rivelano che ha dimensioni indesiderabili (> 200 Nm di diametro) di diametro medio 1.500 Nm, una popolazione multimodale e polidispersi e aggregati in soluzione, che non formano una morfologia particellare distinta (Figura 2B, D ). Entrambi si-NPs 1 e 2 visualizzano la carica di superficie neutra, indicata da valori di potenziale Zeta medi quasi nulli (Figura 2e).
L'efficienza di carico di siRNA in si-NPs è caratterizzata dall'utilizzo di un saggio di Ritardamento del gel di agarosio. SiRNA non complessato migra attraverso il gel di agarosio ed è visualizzato (a causa del legame di etidium bromuro) al fondo del gel. Quando siRNA è complessato con il polimero per formare si-NPs, la migrazione attraverso il gel di agarosio è ostruita e siRNA viene visualizzato al top gel (o dove è stato caricato in pozzi). Per la si-NPs basata su PEG-DB, la complessazione aumenta con l'aumento di N+:P- rapporti fino a quando la complessazione completa è raggiunta a ~ 10-20 n+:P- ratio (Figura 3).
Luciferase è usato come gene modello per la rapida valutazione della bioattività di silenziamento genico si-NP. Le misurazioni della bioluminescenza tramite un lettore di piastre o un sistema di imaging ottico in vivo consentono la quantificazione rapida e ad alto rendimento dell'espressione proteica della luciferasi in formato ben piatto. Questa tecnica è considerevolmente più veloce, più economica e meno onerosa dell'analisi del silenziamento genico attraverso analisi molecolari tradizionali come PCR (espressione genica) e Western blot (espressione proteica). Con questo metodo, le cellule che esprimono luciferasi sono trattate con luciferasi si-NPS e si-NPS strapazzate (come un controllo), e l'attività% luciferasi è calcolata confrontando il segnale di luminescenza con le cellule non trattate. Bioactive luciferasi si-NPS esporrà significativamente diminuita% attività di luciferasi rispetto direttamente al controllo criptato si-NP, come si può vedere per si-NP 1 in Figura 4. Al contrario, luciferasi si-NP che non riducono% attività luciferasi rispetto al controllo criptato si (come si-NP 2) non sono considerati bioattivi (Figura 4). Spesso 48 h è il tempo del silenziamento genico massimo (Figura 4), ma abbiamo osservato un significativo silenziamento genico a punti temporali che vanno da 24 h a 240 h post-trattamento.
Figura 1. Chimica polimerica e schema si-NP. (A) composizione chimica del copolimero PEG-DB diblock che compone si-NPS e conferisce una carica superficiale neutra (blocco PEG) e un comportamento reattivo al pH (blocco DB). B) auto-assemblaggio di si-NP. A pH 4,0, il blocco DB è solubile in acqua perché le ammine terziarie DMAEMA sono altamente protonate. Il blocco DB caricato positivamente è un complesso elettrostatico di molecole siRNA caricate negativamente. Il pH viene quindi regolato a ~ 7,4 con l'aggiunta di 5x pH 8,0 fosfato buffer, con conseguente "idrofobization" di blocco DB e sequestro di siRNA e DB all'interno del nucleo di si-NPs. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Caratterizzazione DLS e TEM di dimensioni si-NP, carica superficiale e morfologia. (A, C) si-NP 1 rappresenta un campione uniforme con dimensioni appropriate (~ 50-100 Nm di diametro), mentre (B, D) si-NP 2 ha formato inerti indesiderabili, grandi e polidispersi. (E) entrambi si-NPS visualizzano una carica superficiale quasi neutra (potenziale Zeta). Le barre di errore rappresentano un errore standard. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3. Saggio di Ritardamento del gel di agarosio per valutare l'efficienza di carico di si-NP siRNA. La scomparsa delle bande siRNA sul fondo del gel indica la complessazione di siRNA in polimero. SiRNA complessato con polimeri non è in grado di migrare attraverso il gel e viene quindi visualizzato nella parte superiore del gel vicino ai pozzi di carico. Come il N+:P- rapporto è aumentato, siRNA complessazione aumenta, come indicato dalla diminuzione dell'intensità della banda siRNA al fondo del gel. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4. Knockdown si-NP-mediato del gene modello luciferase in luciferase MDA-MB-231 cellule. Attività di luciferasi a (a) 24 h e (B) 48 h post-trattamento con o si-NPS strapazzate o luciferasi si-NPS a 10 N+:P- rapporto e 100 Nm siRNA dose. % Attività di luciferasi è calcolata dividendo il segnale di luminescenza dei campioni di trattamento (strapazzate e luciferase) dal segnale di luminescenza delle cellule non trattate. Nota: si-NP 1 rappresenta una formulazione efficace con bioattività di silenziamento genico, mentre si-NP 2 rappresenta una formulazione senza silenziamento genico bioattività. (*) indica una differenza statisticamente significativa (p < 0,05) rispetto al gruppo criptato per una formulazione in un dato punto temporale. Le barre di errore rappresentano un errore standard. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
I si-NPs qui descritti sono formati da un'associazione elettrostatica di siRNA anionica e polimeri cationici in complessi poliioni (polyplexes). La complessazione elettrostatica di siRNA e il blocco DB cationico dei polimeri PEG-DB sono facilitati dalla miscelazione a basso pH (4,0). A pH 4,0, DMAEMA è altamente protonated, e di conseguenza il blocco DB è altamente carico. Questo assicura che i polimeri si dissolvano come unimers in soluzione al contrario di formare micelle e che i complessi DB in modo efficiente con siRNA. Successivamente, il pH della soluzione è regolato al neutro (pH 7,4), causando "idrofobizazione" del blocco DB, formazione di micella e intrappolamento del siRNA complessato all'interno del nucleo dei poliplexi risultanti. Questi polyplexes sono progettati in modo tale che PEG forma un guscio idrofilo, inerte intorno al nucleo DB/siRNA, con conseguente carica superficiale neutra che è necessaria per la somministrazione sistemica. La chimica polimerica e il processo di formazione Polyplex sono delineati nella Figura 1.
La caratterizzazione fisico-chimica rigorosa di si-NPs è essenziale per determinare se le formulazioni sono appropriate per passare a test biologici. Le dimensioni, la carica superficiale e la forma/morfologia delle particelle sono tutti parametri importanti che possono influire sulle prestazioni biologiche. Per la consegna sistemica ai tumori, la dimensione si-NP dovrebbe scendere tra 20 – 200 Nm di diametro22, e gli studi più recenti suggeriscono che le particelle di diametro 20 – 50 nm sono ideali23. La carica superficiale deve essere neutra o leggermente negativa per minimizzare l'adsorbimento proteico e l'opsonizzazione28. Gli studi hanno studiato la connessione tra la forma delle particelle e la farmacocinetica/clearance delle particelle, suggerendo che le particelle con proporzioni elevate sono desiderabili su particelle sferiche29,30,31. Tuttavia, fino ad oggi le particelle sferiche sono ancora più comunemente impiegate, e alla nostra conoscenza, sono l'unica forma di particella ad essere stata tradotta in studi umani in oncologia.
È importante notare che la formazione uniforme e coerente di poliplexi, come il si-NPs qui presentato, dipende da una serie di parametri fisico-chimici. Abbiamo riscontrato empiricamente che la concentrazione di POLIPLEX, il pH della soluzione e il rapporto tra polimero e siRNA (N+:P- ratio) influenzano drasticamente la formazione di POLIPLEX. Nelle nostre mani, la concentrazione di siRNA non ha un grande impatto sulla formazione Polyplex, ma utilizzando concentrazioni polimeriche superiori a 3,33 mg/mL provoca la formazione di grandi aggregati e la dimensione POLIPLEX incoerente. Poiché questi si-NP sono sensibili al pH, può insorgere una serie di problemi quando il pH finale delle soluzioni si-NP è troppo acido (< pH 7,2). Due modi per prevenire queste complicazioni sono di lisofilize polimeri in puro diH2O in modo che non ci sono sali per cambiare la composizione del buffer al momento della dissoluzione e di ri-fare i tamponi frequentemente per evitare la "deriva" di pH tampone nel tempo. Per essere cauti, il pH dei tamponi deve essere confermato ogni volta prima di fare si-NPs, e il pH finale delle soluzioni si-NP deve sempre essere verificato. Infine, il N+:P- rapporto di si-NPS impatti siRNA carico efficienza e parametri fisico-chimici Polyplex. Esiste in genere un ideale N+:P- ratio a cui tutti siRNA è caricato ma non c'è una sovrabbondanza di polimero non complessato che forma le popolazioni separate di micelle e aumenta la citotossicità. Per il si-NPs qui presentato, N+:P- 10-20 è la gamma in cui sono state osservate la consistenza e le prestazioni ottimali.
Le linee di cellule reporter di luciferase sono utilizzate qui per l'analisi rapida e ad alto rendimento della bioattività si-NP. Le linee di cellule reporter di luciferase devono essere generate o acquistate prima di iniziare l'analisi della bioattività, richiedendo quindi un investimento iniziale in termini di tempo e spese. Tuttavia, l'uso delle cellule reporter di luciferasi per valutare il silenziamento genico è più veloce, più suscettibile di analisi ad alto rendimento e più economico nel tempo rispetto all'esecuzione di RT-PCR (per misurare l'espressione di mRNA) o blot occidentali (per misurare l'espressione proteica). Per esempio, la misurazione della luminescenza in questo saggio richiede in genere solo pochi minuti in contrapposizione a processi di tutto il giorno o di più giorni necessari per eseguire RT-PCR o Western blots. Inoltre, le misurazioni della luminescenza possono essere condotte su piastre ben, permettendo la quantificazione simultanea di molti campioni (fino a 96 piastre di pozzo sono stati utilizzati dagli autori). Infine, D-luciferina è l'unico reagente necessario al di sopra e al di là dei reagenti tipici della coltura cellulare, rendendo il metodo molto più conveniente di RT-PCR o Western blot. Va notato tuttavia che il saggio delle cellule reporter di luciferasi si limita a valutare solo il silenziamento genico del modello di luciferasi genica e non può essere utilizzato per misurare il silenziamento genico di altri "geni terapeutici" di interesse. Così, gli autori riferiscono lettori a diversi studi in cui RT-PCR e/o Western blot è stato utilizzato per valutare il silenziamento genico dei geni terapeutici di interesse24,32,33,34.
Oltre alla bioattività, i ricercatori dovrebbero idealmente considerare una gamma completa di test biologici in vitro per caratterizzare le prestazioni di si-NP. Il saggio di luciferasi sopra descritto può anche essere utilizzato per valutare la vitalità delle cellule confrontando il segnale di luminescenza delle cellule trattate di si-NP strapazzate a cellule non trattate. Poiché il siRNA è una sequenza di non-targeting, qualsiasi cambiamento di luminescenza può essere attribuito all'impatto non specifico del si-NPs sulla vitalità delle cellule, e questo effetto dipende tipicamente dalla chimica polimerica e dalla quantità molare. Le tecniche nella citometria a flusso e nella microscopia fluorescente possono essere utilizzate per valutare l'assorbimento delle cellule di si-NPs utilizzando siRNA, polimeri o entrambi con l'etichetta fluorescente. Inoltre, le tecniche molecolari come la PCR a ciclo Stem e l'immunoprecipitazione Argonaut 2 possono essere utilizzate per misurare con precisione i livelli di siRNA intracellulare. Poiché siRNA è bioattivo solo se consegnato al citosol, dove viene caricato in RISC, si-NPs deve innescare la fuga endosomica di siRNA una volta internalizzata dalla cellula. I saggi usati per misurare sperimentalmente la fuga endosomiale includono il saggio emolisi dei globuli rossi (descritto in dettaglio da Evans et al.35), l'imaging fluorescente della colocalizzazione del carico si-NP a fluorescenza e il LysoTracker36, e più recentemente, l'imaging fluorescente del reclutamento di galectina 8 in vescicole endosomiali perforate37,38. Raccogliere dati e sintetizzare i risultati degli esperimenti in vitro per la vitalità delle cellule, l'assorbimento delle cellule, la fuga endosomiale e la bioattività forniscono ai ricercatori pezzi complementari di informazioni da cui trarre interpretazioni e Garner meccanicistici informazioni sull'efficacia di si-NP (in).
In sintesi, le nanoparticelle in grado di fornire efficacemente siRNA hanno un enorme potenziale per il trattamento delle malattie. Ad esempio, in oncologia, molti geni che causano la progressione del cancro, la resistenza alla terapia e le metastasi sono "ondulabili" dalla farmacologia convenzionale, ma potrebbero essere trattati con siRNA. Tuttavia, prerequisito per il loro uso in modelli animali di malattia, siRNA nanomedicine (indicato qui come si-NPs) richiedono un'estesa caratterizzazione fisico-chimica e biologica per garantirne la sicurezza e l'efficacia. A tal fine, sono stati descritti i metodi per produrre e caratterizzare si-NPs in vitro, mediante il quale si possono valutare l'idoneità a portare avanti gli studi sugli animali.
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Disclosures
Gli autori non rivelano potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori sono grati a DRS. Craig Duvall e Rebecca Cook per l'accesso a dati e risorse di laboratorio per lo svolgimento di questa ricerca. Gli autori sono grati al Vanderbilt Institute for nanoscala Science and Engineering (VINSE) per l'accesso agli strumenti DLS e TEM (NSF EPS 1004083). Gli autori sono grati alla National Science Foundation per aver sostenuto il programma di borse di ricerca graduate (NSF # 1445197). Gli autori sono grati agli istituti nazionali di sanità per il sostegno finanziario (NIH R01 EB019409). Gli autori sono grati al dipartimento di difesa Congressionalmente diretto programma di ricerca medica per il sostegno finanziario (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
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