Summary
Metoder for å forberede og karakterisere fysikalsk egenskaper og bioactivity av nøytralt-ladet, pH-responsive siRNA nanopartikler er presentert. Kriterier for vellykkede siRNA-nanomedisiner som størrelse, morfologi, overflate ladning, siRNA-lasting og gendeaktivering diskuteres.
Abstract
Suksessen til siRNA som en målrettet molekylær medisin er avhengig av sin effektive cytosolic levering til celler i vevet i patologi. Klinisk suksess for behandling av tidligere ' undruggable ' lever sykdoms mål med siRNA har blitt oppnådd. Men effektiv tumor siRNA levering nødvendiggjør ytterligere farmakokinetiske design hensyn, inkludert lang sirkulasjon tid, Evasion av klaring organer (f. eks, lever og nyrer), og tumor penetrasjon og oppbevaring. Her beskriver vi utarbeidelse og in vitro fysikalsk/biologisk karakterisering av polymer nanopartikler designet for effektiv siRNA levering, spesielt til ikke-hepatic vev som svulster. Den siRNA nanopartikler er utarbeidet av elektrostatisk kompleks av siRNA og diblokk kopolymer Poly (etylen glykol-b-[2-(dimetylamino) etanol akrylat-co-butyl AKRYLAT]) (PEG-DB) for å danne polyion komplekser ( polyplexes) der siRNA er sequestered innenfor polyplex kjernen og PEG danner en hydrofile, nøytralt-ladet Corona. Videre DB blokken blir membran-lytisk som blemmer av endolysosomal veien acidify (< pH 6,8), utløser endosomal rømme og cytosolic levering av siRNA. Metoder for å karakterisere de fysikalsk egenskapene til siRNA nanopartikler som størrelse, overflate ladning, partikkel morfologi og siRNA-lasting er beskrevet. Bioactivity av siRNA nanopartikler måles ved hjelp av luciferase som en modell gen i en rask og høy gjennomstrømming gen demping analysen. Tegninger hvilke admission card disse Initial prøver (som PEG-DB-basert polyplexes) er betraktet som passende for oversettelse å prekliniske dyr studier vurderingen leveringen av siRNA å svulst eller annet steder av patologi.
Introduction
Fordi siRNAs hemme oversettelsen av proteiner fra mRNA sekvenser, kan de teoretisk brukes til narkotika alle kjente patologi1,2,3,4,5. Bruken av siRNA i medisin er imidlertid begrenset av den omfattende, fattige farmakokinetiske profilen til siRNA molekyler6,7. Når injisert intravenøst, siRNAs er raskt tømmes gjennom nyrene og/eller degradert av nukleaser8,9. På grunn av sin store størrelse og negative ladning, kan siRNA ikke gå inn i celler eller unnslippe endolysosomal veien for å få tilgang til RNA-indusert demping kompleks (RISC) som ligger i stoffer10,11,12, 13 i år. Dermed har omfattende innsats fokusert på design og implementering av siRNA leveranse strategier14. Dette arbeidet har i stor grad fokusert på utvikling av lipid-og polymer-baserte nanopartikler som pakke siRNA, beskytte den fra klarering og degradering in vivo, og initiere cellulær opptak og endosomal flykte gjennom ionebyttermembraner, kationiske Amin grupper. Mange pre-klinisk suksesser har blitt rapportert og sist, den første kliniske suksessen er rapportert for nanopartikkel-baserte hepatic siRNA levering til behandling arvelig transthyretin-mediert (hATTR) amyloidose15.
Det er mange kreftfremkallende gener som for tiden er "undruggable" av konvensjonelle farmakologi (dvs. små molekyl narkotika), motiverende utformingen av polymer siRNA nanopartikler (si-NPs) for å behandle kreft16. Det finnes imidlertid et eget sett med utformings parametere som må vurderes for ikke-hepatic siRNA-levering. Leveringssystemet må skjerme kationiske ladning av polyplex som forårsaker Agglutinasjon innenfor systemisk sirkulasjon17,18,19. For tumor levering, spesielt, si-np stabilitet er viktig å gi gave lang sirkulasjon og dermed økt akkumulering innen svulster via forbedret permeabilitet og oppbevaring (EPR) effekt20,21. Videre er kontroll over si-NP størrelse viktig siden bare nanopartikler ca 20-200 NM diameter i størrelse utnytte EPR22, og mindre si-NPs (~ 20-50 NM diameter) utstillingen forbedret tumor penetrasjon over større størrelser nanopartikler og mikropartikler23.
For å håndtere disse ekstra design begrensningene for systemisk tumor levering av siRNA etter intravenøs administrering, er det utviklet nøytralt pH-responsiv si-NPs (figur 1)24. Disse si-NPs er pegylert, eller sist, Zwitterionated25, for nøytral overflate ladning og resistens mot absorpsjon av protein og opsonization i sirkulasjon. Siden de ikke kan stole utelukkende på kationiske karakter for å kjøre intracellulære levering, er ekstremt effektiv endosomal å unnslippe avgjørende for å oppnå potent gen-deaktivering. Følgelig er kjernen i disse si-NPs består av en svært endosomolytic kjerne som er inert på ekstracellulære pH (7,4), men som utløses i en Switch-lignende måte i de surgjort forholdene i endolysosomal veien [pH 6,8 (tidlig endosomes)-5,0 ( lysosomer)]. Endelig, en blanding av kationiske og hydrofobe innhold i kjernen av si-NPs gir både elektrostatisk og Van der Waals stabilisering styrker, forbedre stabiliteten i si-NPs i blodet i forhold til bare kationiske systemer.
Integreringen av mange funksjoner i en relativt enkel design er mulig ved hjelp av reversibel tillegg-fragmentering kjeden Transfer (RAFT) kontrollerte polymerisering å produsere polymerer med kompleks arkitektur og presis sammensetning. Å produsere si-NPs med nøytral overflate ladning, pH-respons, og NP stabilitet, er FLÅTEN som brukes til å syntetisere Poly (etylen glykol-b-[2-(dimetylamino) etanol akrylat-co-butyl AKRYLAT]) (PEG-DB; Figur 1a). PEG-DB er elektrostatisk complexed med siRNA, forming si-NPs med en PEG Corona og DB/siRNA kjerne (figur 1B). PEG danner et inert, nøytralt hydrofile lag på si-NP Corona. DB-blokken består av en 50:50 molar ratio på 2-(dimetylamino) etanol akrylat (DMAEMA) og butyl akrylat (BMA). Kationiske DMAEMA elektrostatisk komplekser negativt ladet siRNA. BMA Self-Associates i NP-kjernen av van der Waals interaksjoner, økende NP stabilitet. Sammen, DMAEMA og BMA meddele pH-avhengig lipid bilayer-lytisk oppførsel til DB polymer blokk. Ved ekstracellulære pH er DB-blokken sequestered til si-NP-kjernen og er inert til lipid bilayers. Under Sure forhold, slik som de i endolysosomal veien, ionebyttermembraner DMAEMA innenfor DB blokken Letter Proton svamp effekt, der endosomal bufring fører til osmotisk hevelse og brudd26. I tillegg hydrofobe BMA andeler i DB-blokken aktivt integreres i og lyse lipid bilayers, noe som resulterer i potent endosomolysis. Således, siRNA er complexed med PEG-DB å blankett si-NPs det er nøytralt-ladet og høylig stabile for ekstracellulære pH bortsett fra hvilke avbryte lipid bilayers for syrlig pH, forsikrer cytosolic leveranse av det siRNA payload.
Heri beskrives de eksperimentelle prosedyrene for å produsere si-NPs fra PEG-DB. Metoder for å karakterisere fysikalsk parametre og bioactivity av si-NPs er presentert og diskutert. For å raskt kunne vurdere si-NP-bioactivity, brukes luciferase som modell gen for knockdown studier. Firefly luciferase er proteinet som er ansvarlig for "gløden" av ildfluene27. Følgelig, pattedyrceller transfekterte med Firefly luciferase genet produsere en Puerto Mosquito "glød" som kan fanges opp ved hjelp av en luminometeret å kvantifisere nivåer av luciferase uttrykk. Her bruker vi luciferase å vurdere bioactivity av si-NPs ved å levere siRNA mot luciferase og kvantifisere tilsvarende reduksjon i bioluminesens i luciferase-uttrykker celler i forhold til celler som mottar en forvrengt siRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjøring og karakterisering av si-NPs
- si-NP Forberedelse
- Oppløse polymer i 10 mM sitronsyre buffer (pH 4,0) ved 3,33 mg/mL. Polymer kan først oppløses ved 10x konsentrasjon i etanol for å sikre oppløsning.
Merk: polymer kan oppløses ved lavere konsentrasjoner, men bruk ved konsentrasjoner over 3,33 mg/mL kan forhindre homogen NP-dannelse. - Legg til siRNA (50 μM i di2O) for å resultere i N+:P- forhold på 10. Bland polymer og siRNA løsninger grundig ved pipettering og la ruge i 30 min. N+:P- ratio representerer antall positivt ladet Amin grupper på polymer til antall negativt ladet fosfat grupper på siRNA og er beregnet av formelen nedenfor:.
der, mol Pol er molar mengden polymer, RU Amin er antall gjentatte enheter av positivt ladet aminer per polymer, mol siRNA er molar mengden av siRNA, og BP siRNA er antall Base parene per siRNA molekyl. - Tilsett en 5-fold overkant av 10 mM fosfat buffer (pH 8,0) og bland forsiktig enten ved pipettering eller invertere røret. For å bekrefte at den endelige pH er nøytral (~ 7.2-7.5), Pipetter 10 μL av si-NP-løsning på pH-teststrimler.
Merk: sitronsyre og fosfat buffere er utarbeidet i henhold til Millipore Sigma buffer Reference Center diagrammer.
- Oppløse polymer i 10 mM sitronsyre buffer (pH 4,0) ved 3,33 mg/mL. Polymer kan først oppløses ved 10x konsentrasjon i etanol for å sikre oppløsning.
- Fysikalsk karakterisering av si-NPs
- Ta opp størrelsen og overflate belastningen på resulterende si-NPs ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS). Forbered en DLS-prøve ved å filtrere 1 mL si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) via 0,45 μm pore-størrelse sprøyte filtre til en firkantet kvarts eller polystyren Cuvette. Opptaks størrelse og overflate lade målinger ved hjelp av et DLS-instrument i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Bekreft størrelsen og morfologi av si-NPs ved avbildnings analyse ved hjelp av overførings elektron mikroskopi (TEM).
- Tilsett 5 μL av si-NP-løsning ved 1 mg/mL til TEM-gitter og ruge for 60 s. blot tørr for 3 s.
- Tilsett 5 μL av 3% uranylnitratet acetate løsning og ruge for 20 s. blot tørr for 3 s. Dry rutenett over natten under uttørking.
- Bilderutenett i henhold til protokollen som er opprettet for det bestemte mikroskopet som skal brukes.
- Karakterisere lasting av siRNA i si-NPs på ulike N+:P- prosenter bruker agarose gel retardasjon.
- For å produsere 2% agarose gel, tilsett 2 g elektroforese grade agarose pulver til 100 mL av 1x TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer ved pH 8,0. Rør for å suspendere agarose. Heat avdekket i mikrobølgeovn til alle agarose er oppløst (1-3 min).
- Når avkjølt, tilsett 5 μL av etidiumbromid bromide (10 mg/mL i H2O), og bland godt. Hell agarose i en gel brett og sted kam å produsere brønner, la tørke i 30 min. Fjern forsiktig kammen for å etterlate laste brønner, og fyll gel skuffen til maks Påfyllings linjen med 1x TAE-buffer.
- Generer si-NPs (i henhold til fremgangsmåten ovenfor) ved 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20 og 40 N+:P- prosenter. Plasser 2 μL alikvoter (ingen SDS-og reduksjonsmidler) på para fin film for hver enkelt si-NP-formulering. Bland 10 μL av si-NP-løsning med laste fargestoff på para fin film ved pipette.
- Legg si-NP/loading Dye løsninger til agarose gel brønner. Kjør spenningskilde på 100 V for 35 min (eller til prøvene har krysset 80% av gel lengde).
- Visualiser siRNA-bånd på en UV-transilluminator i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Bekreft størrelsen og morfologi av si-NPs ved avbildnings analyse ved hjelp av overførings elektron mikroskopi (TEM).
2. bestemme in vitro bioactivity av si-NPs
- Knockdown av modellen genet luciferase
- Generer luciferase si-NPs (i henhold til fremgangsmåten ovenfor) ved hjelp av luciferase siRNA og kryptert si-NPs ved hjelp av en kryptert siRNA-sekvens som en kontroll. Formualte både si-NPs ved samme endelige N+:P- ratio og på det optimale forholdet identifisert ved agarose gel retardasjon studier. Eksempel siRNA-sekvenser er inkludert i materialfortegnelsen.
- Seed luciferase-uttrykker celler [MDA-MB-231/luciferase (BSD) stabile celler] i 96-vel svart-vegger plater i en tetthet på 2 000 celler per brønn. Tillat å følge over natten i full Media (DMEM, 10% FBS) i en inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% fuktighet).
- Fortynne si-NPs i full serum Media for et endelig volum på 100 μL per brønn og siRNA konsentrasjon på 100 nM. Behandle celler i 24 timer med si-NPs.
- Etter 24 timer, fjerne behandlinger og erstatte Media med full serum medier som inneholder 150 μg/mL D-luciferin. Ruge celler i 5 minutter før måle luminescence på en plate leser eller in vivo optisk bildebehandlingssystem i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Erstatt luciferin medier med friske, fulle serum medier og ruge 24 timer til. Gjenta trinnet ovenfor, og fjern Media og Erstatt med fulle serum medier som inneholder 150 μg/mL D-luciferin, etterfulgt av en 5 min inkubasjons før måle luminescence ved 48 h timepoint.
- For langsgående studier, vedlikeholde celler under sterile forhold mens måle luminescence. Fortsett til kultur i friske, fulle medier mellom målinger etter utskifting av luciferin.
Merk: riktig siRNA-konsentrasjon vil variere med forskjellige si-NPs-og siRNA-molekyler. Ved bruk av nøytralt polyplexes med en endosomolytic kjerne (f.eks. PEG-DB), er 100 nM vanligvis godt tolerert av cellene og produserer > 75% luciferase knockdown. Massen ratio av PEG-DB til siRNA på 10 N+:P- ratio og 100 nM siRNA behandlinger (forutsatt 26 bp siRNA) er 23,3, dvs. legge 23,3 ng av Peg-DB for hver 1,0 ng av siRNA. Legg for eksempel 1,16 μL av 3,33 mg/mL polymer til 166,5 ng fra siRNA for å behandle en brønn på 100 nM i en 96-brønn plate (100 mL medie volum per brønn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Noen viktige egenskaper ved effektiv si-NPs for in vivo siRNA levering er riktig størrelse (~ 20-200 NM diameter), siRNA emballasje, og gendeaktivering bioactivity. Selv om dette ikke er en uttømmende liste (som omtalt i diskusjonen), bør disse grunnleggende egenskapene bekreftes før du vurderer videre testing av en formulering.
Figur 2 illustrerer karakterisering av si-np størrelse og overflate ladning ved formulering. DLS og TEM brukes som komplementære metoder for å observere si-NP størrelse (begge), polydispersitet (DLS), og morfologi (TEM). DLS-målinger viser at si-NP 1 har en gjennomsnittlig diameter på 35 NM, unimodal fordeling indikert av tilstedeværelsen av en enkelt topp, og lav polydispersitet indikert med en relativt smal topp bredde (figur 2a). TEM-målinger bekrefter størrelses målingen fra DLS, antyder tilstedeværelsen av en ensartet befolkning på si-NPs, og avslører den sfæriske morfologi av si-NPs (figur 2C). DLS og TEM målinger av si-NP 2 avslører at det har uønsket størrelse (> 200 NM diameter) av gjennomsnittlig diameter 1 500 NM, en multimodal og polydisperse befolkning, og aggregater i løsningen, danner ingen distinkte partikkel morfologi (figur 2b, D ). Både si-NPs 1 og 2 skjerm nøytral overflate ladning, indikert av nesten null bety Zeta potensielle verdier (figur 2e).
Lasting effektiviteten av siRNA i si-NPs er karakterisert ved hjelp av en agarose gel retardasjon analysen. Un-complexed siRNA migrerer gjennom agarose gel og er visualisere (på grunn av binding av etidiumbromid bromide) på gel bunnen. Når siRNA er complexed med polymer for å danne si-NPs, migrasjon gjennom agarose gel er hindret og siRNA er visualisere på gel toppen (eller hvor den ble lastet inn i brønner). For PEG-DB-baserte si-NPs, øker kompleks med økende N+:P- prosenter til full kompleks oppnås ved ~ 10-20 N+:P- ratio (Figur 3).
Luciferase brukes som modell gen for rask vurdering av bioactivity av si-NP-genet. Bioluminesens målinger via en plate leser eller in vivo optisk bildebehandlingssystem gir mulighet for rask, høy gjennomstrømming kvantifisering av luciferase protein uttrykk i brønn plateformat. Denne teknikken er betydelig raskere, billigere og mindre belastende enn å analysere gen-deaktivering gjennom tradisjonelle molekylære analyser som PCR (genuttrykk) og Western Blot (protein uttrykk). Ved denne metoden blir luciferase-uttrykker celler behandlet med luciferase si-NPs og kryptert si-NPs (som en kontroll), og% luciferase aktivitet er beregnet ved å sammenligne luminescence signal til ubehandlede celler. Bioaktive luciferase si-NPs vil vise betydelig redusert% luciferase aktivitet når sammenlignet direkte til forvrengt si-NP-kontroll, som kan sees for si-NP 1 i Figur 4. I kontrast, luciferase si-NPs som ikke reduserer% luciferase aktivitet sammenlignet med forvrengt si-NP-kontroll (for eksempel si-NP 2) anses ikke bioaktive (Figur 4). Ofte er 48 h tiden for maksimal gen-deaktivering (Figur 4), men vi har observert betydelig gen-deaktivering på tidspunkter som spenner fra 24 t til 240 h etter behandling.
Figur 1. Polymer kjemi og si-NP skjematisk. (A) kjemisk sammensetning av Peg-DB diblokk kopolymer som komponerer si-NPs og endows nøytral overflate LADNING (PEG Block) og pH-responsiv adferd (DB Block). (B) selv montering av si-NPs. Ved pH 4,0, DB-blokk er vannløselige fordi DMAEMA tertiær aminer er svært protonerte. Den positivt ladet DB blokk elektrostatisk komplekser negativt ladet siRNA molekyler. PH er deretter justert til ~ 7,4 ved tilsetning av 5x pH 8,0 fosfat buffer, noe som resulterer i "hydrophobization" av DB blokk og opptak av siRNA og DB innenfor kjernen av si-NPs. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. DLS og TEM karakterisering av si-NP størrelse, overflate ladning, og morfologi. (A, C) si-np 1 representerer en ensartet prøve med passende størrelse (~ 50-100 NM diameter), mens (B, D) si-np 2 har dannet uønskede, store og polydisperse aggregater. (E) både si-NPs-skjerm nær-nøytral overflate ladning (Zeta potensial). Feilfelt representerer standard feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Agarose gel retardasjon-analysen for å vurdere si-NP siRNA lasting effektivitet. Forsvinningen av siRNA band på gel bunnen indikerer kompleks av siRNA til polymer. Polymer-complexed siRNA er ute av stand til å migrere gjennom gel og er dermed visualisere på toppen av gel i nærheten av lasting brønner. Som N+:P- ratio økes, siRNA kompleks øker, som indikert av redusert intensitet av siRNA bandet på gel Bottom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Si-NP-mediert knockdown av modellen genet luciferase i luciferase MDA-MB-231 celler. Luciferase aktivitet ved (A) 24 h og (B) 48 h post-behandling med enten forvrengt si-NPs eller luciferase si-NPS ved 10 N+:P- ratio og 100 nM siRNA dose. % Luciferase aktivitet beregnes ved å dele luminescence signal av behandlings prøver (kryptert og luciferase) ved luminescence signal av ubehandlede celler. Merk: si-NP 1 representerer en effektiv formulering med bioactivity av gen demping, mens si-NP 2 representerer en formulering uten bioactivity av gendeaktivering. (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p < 0,05) sammenlignet med den krypterte gruppen for en formulering ved en gitt timepoint. Feilfelt representerer standard feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Si-NPs beskrevet her er dannet av elektrostatisk sammenslutning av anioniske siRNA og kationiske polymerer i polyion komplekser (polyplexes). Elektrostatisk kompleks av siRNA og kationiske DB blokk av PEG-DB polymerer er tilrettelagt ved å blande ved lav pH (4,0). Ved pH 4,0, er DMAEMA svært protonerte, og følgelig DB blokken er svært ladet. Dette sikrer at polymerer oppløses som unimers i løsning i motsetning til forming miceller og at DB komplekser effektivt med siRNA. Deretter justeres pH-verdien til nøytral (pH 7,4), noe som forårsaker ' hydrophobization ' av DB-blokken, micelle formasjon, og en complexed siRNA innenfor kjernen av den resulterende polyplexes. Disse polyplexes er utformet slik at PEG danner en hydrofile, inert skall rundt DB/siRNA kjernen, noe som resulterer i nøytral overflate ladning som er nødvendig for systemisk administrasjon. Den polymer kjemi og prosessen med polyplex formasjon er skissert i figur 1.
Streng fysikalsk karakterisering av si-NPs er avgjørende for å avgjøre om formuleringer er hensiktsmessig for å flytte inn i biologisk testing. Størrelse, overflate ladning, og partikkelform/morfologi er alle viktige parametre som kan påvirke biologisk ytelse. For systemisk levering til svulster, bør si-NP størrelse faller mellom 20-200 NM diameter22, og de siste studiene tyder 20-50 NM diameter partikler er ideelle23. Surface charge bør være nøytral eller litt negativ for å minimere absorpsjon av protein og opsonization28. Studier har undersøkt sammenhengen mellom partikkelform og farmakokinetikken/partikkel klaring, noe som tyder på at partikler med høyt størrelsesforhold er ønskelig fremfor sfæriske partikler29,30,31. Men hittil sfæriske partikler er fortsatt mest brukt, og til vår kunnskap, er den eneste partikkel formen å ha blitt oversatt til menneskelige studier i onkologi.
Det er viktig å merke seg at den enhetlige og konsekvente dannelsen av polyplexes, slik som si-NPs som presenteres her, er avhengig av en rekke fysikalsk parametre. Vi har funnet empirisk at polyplex konsentrasjon, pH i løsningen, og forholdet mellom polymer til siRNA (N+:P- ratio) alle drastisk innvirkning polyplex formasjon. I våre hender siRNA konsentrasjon ikke har en stor innvirkning på polyplex dannelse, men ved hjelp av polymer konsentrasjoner i overkant av 3,33 mg/mL resulterer i dannelse av store aggregater og inkonsekvent polyplex størrelse. Ettersom disse si-NPs er pH-responsive, kan en rekke problemer oppstå når den endelige pH i si-NP løsninger er for surt (< pH 7,2). To måter å forebygge disse komplikasjoner er å lyophilize polymerer i ren di2O slik at det ikke er noen salter for å endre buffer sammensetning ved oppløsning og å re-lage buffere ofte for å hindre at "drivende" av buffer pH over tid. For å være forsiktig bør pH-buffere bekreftes hver gang før man gjør si-NPs, og den endelige pH i si-NP-løsningen skal alltid verifiseres. Til slutt, N+:P- ratio på si-NPs virkninger siRNA lasting effektivitet og polyplex fysikalsk parametere. Det finnes vanligvis et ideelt N+:P- forhold der alle siRNA er lastet, men det er ikke en overdoser av un-complexed polymer som danner separate bestander av miceller og øker cytotoksisitet. For si-NPs som presenteres her, er N+:P- 10-20 det området der optimal konsistens og ytelse er observert.
Luciferase reporter cellelinjer er brukt her for rask og høy gjennomstrømming analyse av si-NP bioactivity. Luciferase reporter cellelinjer må genereres eller kjøpes før du starter bioactivity analyse, og dermed krever en innledende investering i tid og kostnader. Men bruk av luciferase reporter celler for å vurdere gendeaktivering er raskere, mer mottagelig for høy gjennomstrømming analyse, og billigere over tid enn å utføre RT-PCR (for å måle mRNA uttrykk) eller vestlig blots (for å måle protein uttrykk). For eksempel tar måling luminescence i denne analysen vanligvis bare noen få minutter i motsetning til hele dagen eller flere dagers prosesser som er nødvendige for å utføre RT-PCR eller vestlige blots. Videre kan luminescence målinger gjennomføres på godt plater, noe som åpner for samtidige kvantifisering av mange prøver (opp til 96-brønn plater har blitt brukt av forfatterne). Til slutt, D-luciferin er den eneste reagens som trengs utover typiske cellekultur reagenser, noe som gjør metoden mye rimeligere enn RT-PCR eller Western Blot. Det bør bemerkes imidlertid at luciferase reporter celle analysen er begrenset til bare å vurdere gendeaktivering av modellen genet luciferase og kan ikke brukes til å måle gendeaktivering av andre "terapeutiske gener" av interesse. Dermed forfatterne henvise leserne til flere studier der RT-PCR og/eller Western Blot har blitt brukt til å vurdere gendeaktivering av terapeutiske gener av interesse24,32,33,34.
I tillegg til bioactivity bør forskerne ideelt sett vurdere et omfattende spekter av in vitro-biologiske tester for å karakterisere si-NP-ytelse. Den luciferase analysen beskrevet ovenfor kan også brukes til å vurdere celle levedyktighet ved å sammenligne luminescence signal av forvrengt si-NP behandlede celler til ubehandlede celler. Siden siRNA er en ikke-målrettet sekvens, kan enhver endring i luminescence tilskrives ikke-spesifikk effekt av si-NPs på celle levedyktighet, og denne effekten er vanligvis avhengig av polymer kjemi og molar beløp. Teknikker i strømnings flowcytometri og fluorescerende mikroskopi kan brukes til å vurdere celle opptak av si-NPs ved hjelp av fluorescensmerkete-merket siRNAs, polymerer eller begge deler. I tillegg kan molekylær teknikker som Stem-loop PCR og Argonaut 2 immunutfelling brukes til å presist måle intracellulære siRNA nivåer. Siden siRNA er bare bioaktive hvis levert til stoffer, hvor den er lastet inn i RISC, må si-NPs utløse endosomal rømme av siRNA gang internalisert av cellen. Analyser som brukes til å eksperimentelt måle endosomal flukt inkluderer den røde blod celle hemolyse analysen (beskrevet i detalj av Evans et al.35), fluorescerende bilde av colocalization av fluorescensmerkete merket si-np-Last og LysoTracker36, og nylig, fluorescerende Imaging av rekrutteringen av Galectin 8 til punktert endosomal blemmer37,38. Samle inn data og syntetisere resultatene fra in vitro eksperimenter for celle levedyktighet, celle opptak, endosomal rømme, og bioactivity gi forskeren komplementære biter av informasjon som å trekke tolkninger og Garner mekanistisk innsikt om si-NP (i) effektivitet.
I sum, nanopartikler i stand til å effektivt levere siRNA har et enormt potensial til å behandle sykdom. For eksempel, i onkologi, mange gener som forårsaker kreft progresjon, resistens mot terapi, og metastasering er "undruggable" av konvensjonelle farmakologi, men kan behandles ved hjelp siRNA. Men forutsetning for deres bruk i dyremodeller av sykdom, siRNA nanomedisiner (referert til her som si-NPs) krever omfattende fysikalsk og biologisk karakterisering for å sikre både deres sikkerhet og effektivitet. For dette formål har metodene blitt beskrevet her for å produsere og karakterisere si-NPs in vitro, der si-NPs kan vurderes for egnethet til å videreføres inn i dyrestudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne avslører ingen potensielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for DRS. Craig Duvall og Rebecca Cook for tilgang til data og laboratorie ressurser for å gjennomføre denne forskningen. Forfatterne er takknemlige for Vanderbilt Institute for nanoskala Science and Engineering (VINSE) for tilgang til DLS og TEM (NSF EPS 1004083) instrumenter. Forfatterne er takknemlige for National Science Foundation for å støtte Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). Forfatterne er takknemlige for National Institutes of Health for økonomisk støtte (NIH R01 EB019409). Forfatterne er takknemlige for Department of Defense Congressionally regissert Medical Research program for økonomisk støtte (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
