Summary
São apresentados métodos para preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas e a bioatividade de nanopartículas de siRNA com carga neutra e pH responsivo. Os critérios para nanomedicinas bem sucedidas de siRNA tais como o tamanho, a morfologia, a carga de superfície, o carregamento de siRNA, e o silenciamento do gene são discutidos.
Abstract
O sucesso de siRNA como uma medicina molecular alvejada é dependente em cima de sua entrega citosólica eficiente às pilhas dentro do tecido da patologia. O sucesso clínico para tratar previamente "undruggable" alvos hepatic da doença com siRNA foi conseguido. Entretanto, a entrega eficiente do siRNA do tumor necessita considerações farmacocinéticas adicionais do projeto, incluindo o tempo longo da circulação, a evasão de órgãos do afastamento (por exemplo, fígado e rins), e a penetração e a retenção do tumor. Aqui, nós descrevemos a preparação e in vitro caracterização físico-química/biológica de nanopartículas poliméricos projetadas para a entrega eficiente de siRNA, particular aos tecidos não-hepatic tais como tumores. As nanopartículas de siRNA são preparadas por complexação eletrostática de siRNA e o copolímero diblock poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-co-butil metacrilato]) (PEG-DB) para formar complexos de poliíons ( polyplexes) onde o siRNA é seqüestrado dentro do núcleo do Polyplex e o Peg dá forma a uma Corona hidrófila, neutrally-carregada. Além disso, o bloco do DB transforma-se membrana-Lytic como os vesículas da via endolysosomal acidificar (< pH 6,8), provocando o escape endossomal e a entrega citosólica de siRNA. Métodos para caracterizar as características físico-químicas de nanopartículas de siRNA como tamanho, carga superficial, morfologia de partículas e carregamento de siRNA são descritos. A bioatividade de nanopartículas de siRNA é medida usando a luciferase como um gene modelo em um ensaio de silenciamento gênico rápido e de alta taxa de transferência. Os projetos que passam estes testes iniciais (tais como polyplexes PEG-DB-baseados) são considerados apropriados para a tradução aos estudos animais pré-clínicos que avaliam a entrega de siRNA aos tumores ou aos outros locais da patologia.
Introduction
Como as siRNAs inibem a tradução de proteínas de seqüências de mRNA, teoricamente podem ser usadas para drogas todas as patologias conhecidas1,2,3,4,5. No entanto, o uso de siRNA em medicina é limitado pelo perfil farmacocinético exaustivamente pobre de moléculas de siRNA6,7. Quando injetadas intravenosamente, as siRNAs são rapidamente desmarcadas através dos rins e/ou degradadas por nucleases8,9. Devido ao seu grande tamanho e carga negativa, o siRNA não pode entrar em células ou escapar da via endolysosomal para acessar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que reside no citosol10,11,12, treze anos. Assim, o amplo esforço tem focado no desenho e implementação das estratégias de entrega do siRNA14. Este esforço concentrou-se em grande parte no desenvolvimento de nanopartículas baseadas em lipídios e polímeros que empacotem siRNA, protegem-na do afastamento e da degradação in vivo, e iniciam a captação celular e o escape endossomal através dos grupos ionizable, catiônicos da amina. Muitos sucessos pré-clínicos foram relatados e mais recentemente, o primeiro sucesso clínico foi relatado para a entrega hepatic Nanoparticle-baseada do siRNA para tratar o amiloidose transthyretin-negociado hereditário (hattr)15.
Há muitos genes causadores de câncer que são atualmente "undruggable" pela farmacologia convencional (ou seja, pequenas moléculas de drogas), motivando o projeto de nanopartículas de siRNA poliméricos (si-NPs) para tratar o câncer16. No entanto, há um conjunto separado de parâmetros de projeto que devem ser considerados para a entrega de siRNA não-hepática. O sistema de distribuição deve proteger a carga catiônica do poliplex que provoca aglutinação dentro da circulação sistêmica17,18,19. Para a entrega do tumor, especificamente, a estabilidade do si-NP é essencial para dotar a circulação longa e assim a acumulação aumentada dentro dos tumores através do efeito realçado da permeabilidade e da retenção (EPR)20,21. Além disso, o controle sobre o tamanho de si-NP é essencial, uma vez que apenas nanopartículas de aproximadamente 20 – 200 nm de diâmetro na alavancagem de tamanho EPR22, e menor si-NPS (~ 20 – 50 nm de diâmetro) exibem melhor penetração tumoral sobre nanopartículas de tamanho maior e micropartículas23.
Para abordar estas limitações adicionais do projeto para a entrega sistemática do tumor de siRNA depois da administração intravenosa, neutralmente-carregada, si-NPs pH-responsivo foi desenvolvida (Figura 1)24. Estes si-NPs são PEGylated, ou mais recentemente, Zwitterionated25, para a carga de superfície neutra e a resistência à adsorção e à opsonização da proteína na circulação. Desde que não podem depender unicamente do caráter catiônico para conduzir a entrega intracelular, o escape endossomal extremamente eficiente é imperativo para conseguir o silenciamento de gene potente. Consequentemente, o núcleo destes si-NPS é compor de um núcleo altamente endosomolytic que seja inerte no pH extracelular (7,4), mas que é provocado em um interruptor-como a maneira nas condições acidificado da via endolysosomal [pH 6,8 (endosomes adiantados) – 5,0 ( lisossomas)]. Por último, uma mistura de conteúdo catiônico e hidrofóbico dentro do núcleo do si-NPs fornecer forças de estabilização eletrostática e Van der Waals, melhorando a estabilidade do si-NPs no sangue em comparação com sistemas meramente catiônicos.
A integração de muitas funções em um projeto relativamente simples é possível usando a polimerização controlada de transferência de cadeia de adição-fragmentação reversível (RAFT) para produzir polímeros com arquitetura complexa e composição precisa. Para produzir si-NPs com carga de superfície neutra, pH-responsividade e estabilidade NP, a JANGADA é usada para sintetizar poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) metacrilato de etilo-co-butil metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). O PEG-DB é complexado eletrostaticamente com siRNA, formando si-NPs com uma Corona PEG e núcleo DB/siRNA (Figura 1b). O PEG forma uma camada hidrófila inerte, neutralmente carregada na Corona do si-NP. O bloco DB consiste em uma razão molar de 50:50 de 2-(dimetilamino) de metacrilato de etilo (DMAEMA) e metacrilato de butilo (BMA). Complexos eletrostaticamente catiônicos de DMAEMA com carga negativa de siRNA. BMA Self-Associates dentro do núcleo NP por interações Van der Waals, aumentando a estabilidade NP. Em conjunto, DMAEMA e BMA concebem o comportamento lítico lipídico dependente do pH para o bloco de polímero DB. No pH extracelular, o bloco DB é sequestrado para o núcleo si-NP e é inerte a bilayers lipídicos. condições ácidas, como aquelas dentro da via endolysosomal, a DMAEMA ionizável dentro do bloco DB facilita o efeito da esponja de prótons, onde a tamponamento endossômica leva ao inchaço e ruptura osmótica26. Adicionalmente, os metades hydrofóbicos do BMA dentro do bloco do DB integram ativamente em e lyse bilayers lipídicos, tendo por resultado o endosomolysis potente. Assim, o siRNA é complexado com Peg-DB para formar si-NPS que são neutralmente carregados e altamente estáveis no pH extracelular, mas que perturbam as bicamadas lipídicas no pH ácido, assegurando a entrega citosónica do Payload siRNA.
São descritos aqui os procedimentos experimentais para produzir si-NPs de PEG-DB. Os métodos para caracterizar os parâmetros físico-químicos e a bioatividade de si-NPs são apresentados e discutidos. A fim de avaliar rapidamente a bioatividade de si-NP, a luciferase é usada como um gene modelo para estudos de knockdown. Firefly luciferase é a proteína responsável pelo ' fulgor ' dos vaga-lumes27. Assim, as células de mamíferos transfectadas com o gene da luciferase do vagalume produzem um "brilho" bioluminescente que pode ser capturado usando um luminômetro para quantificar os níveis de expressão de luciferase. Aqui, usamos luciferase para avaliar a bioatividade de si-NPs, entregando siRNA contra luciferase e quantificando a redução correspondente em bioluminescência em células expressando luciferase em comparação com células que recebem um siRNA mexido.
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Protocol
1. preparação e caracterização de si-NPs
- preparação para si-NP
- Dissolva o polímero em tampão de ácido cítrico de 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. O polímero pode primeiramente ser dissolvido na concentração 10x no ethanol para assegurar a dissolução.
Nota: o polímero pode ser dissolvido em concentrações mais baixas, mas o uso em concentrações acima de 3,33 mg/mL pode impedir a formação homogénea do NP. - Adicionar siRNA (50 μM em diH2O) para resultar em N+:P- rácio de 10. Misture soluções de polímero e siRNA cuidadosamente introduzindo pipetagem e deixe incubar por 30 min. O N+:P- ratio representa o número de grupos de amina com carga positiva no polímero para o número de grupos de fosfato com carga negativa no siRNA e é calculado pela fórmula abaixo:
onde, mol pol é a quantidade molar de polímero, RU amina é o número de unidades de repetição de aminas positivamente carregadas por polímero, mol siRNA é a quantidade molar de siRNA, e BP siRNA é o número de pares de base por molécula de siRNA. - Adicione um excesso de 5 dobras de tampão fosfato de 10 mM (pH 8,0) e misture suavemente, introduzindo pipetagem ou invertendo o tubo. Para confirmar que o pH final é neutro (~ 7,2-7,5), pipetando 10 μL de solução si-NP para tiras de teste de pH.
Nota: os tampões do ácido cítrico e do fosfato são preparados de acordo com os gráficos do centro de referência do amortecedor de millipore Sigma.
- Dissolva o polímero em tampão de ácido cítrico de 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. O polímero pode primeiramente ser dissolvido na concentração 10x no ethanol para assegurar a dissolução.
- Caracterização físico-química de si-NPs
- Registre a carga de tamanho e superfície do si-NPs resultante usando dispersão de luz dinâmica (DLS). Prepare uma amostra de DLS filtrando 1 mL de si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) através de filtros de seringa de tamanho de poros de 0,45 μm em uma cubeta quadrada de quartzo ou poliestireno. Tamanho do registro e medições de carga de superfície usando um instrumento DLS de acordo com as especificações do fabricante.
- Confirmar o tamanho e a morfologia do si-NPs por análise de imagem utilizando microscopia eletrônica de transmissão (Met).
- Adicionar 5 μL de solução de si-NP a 1 mg/mL às grelhas TEM e incubar para 60 s. blot seco durante 3 s.
- Adicionar 5 μL de solução de acetato de uranilo a 3% e incubar durante 20 s. secar durante 3 s. grades secas durante a noite dessecação.
- Grades de imagem de acordo com o protocolo estabelecido para o microscópio específico a ser usado.
- Caracterizar o carregamento de siRNA em si-NPs em vários N+:P- rácios usando o retardamento do gel de agarose.
- Para produzir o gel do agarose de 2%, adicione 2 g do pó do agarose da classe da electroforese a 100 mL do amortecedor de 1x TAE (Tris-Acetato-EDTA) em pH 8,0. Mexa para suspender agarose. Calor descoberto no microondas até que todo o agarose é dissolvido (1-3 min).
- Uma vez resfriado, adicionar 5 μL de brometo de etídio (10 mg/mL em H2O), e misture bem. Despeje agarose em uma bandeja de gel e coloque o pente para produzir poços, deixando secar por 30 min. Retire cuidadosamente o pente para deixar para trás os poços de carga, e encha a bandeja de gel para a linha de preenchimento máximo com 1x tampão TAE.
- Gere si-NPs (de acordo com o procedimento acima) em 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, e 40 N+:P- rácios. Colocar 2 μL de alíquotas de corante de carga (sem SDS e agentes redutores) em película de parafina para cada formulação si-NP. Misturar 10 μL de solução si-NP com corante de carregamento em película de parafina por pipeta.
- Adicione soluções de corante si-NP/loading a poços de gel de agarose. Execute a fonte de tensão em 100 V por 35 min (ou até que as amostras tenham atravessado 80% do comprimento do gel).
- Visualize as bandas de siRNA em um transiluminador UV de acordo com as especificações do fabricante.
- Confirmar o tamanho e a morfologia do si-NPs por análise de imagem utilizando microscopia eletrônica de transmissão (Met).
2. determinação da bioactividade in vitro de si-NPs
- Knockdown do luciferase do gene modelo
- Gerar luciferase si-NPs (de acordo com o procedimento acima) usando luciferase siRNA e si-NPs mexidos usando uma seqüência de siRNA embaralhada como um controle. Formualte ambos si-NPs no mesmo final N+:P- relação e na relação óptima identificada por estudos do atraso do gel do agarose. Seqüências de exemplo siRNA estão incluídas na tabela de materiais.
- Semente luciferase-expressando células [MDA-MB-231/luciferase (BSD) células estáveis] em 96-bem placas de paredes pretas em uma densidade de 2.000 células por poço. Permitir aderir durante a noite em plena mídia (DMEM, 10% FBS) em uma incubadora (37 ° c, 5% CO2, 95% umidade).
- Diluir si-NPs em meios séricos completos para um volume final de 100 μL por poço e concentração de siRNA de 100 nM. Trate as células por 24 h com si-NPs.
- Após 24 h, retire os tratamentos e substitua os meios de comunicação com meios séricos completos contendo 150 μg/mL D-luciferina. Incubar células por 5 min antes de medir a luminescência em um leitor de placa ou in vivo sistema de imagem óptica de acordo com as especificações do fabricante.
- Substitua a mídia contendo luciferina com meios séricos frescos e cheios, e incubar mais 24 h. Repita o passo acima, removendo a mídia e substituindo com a mídia sérica completa contendo 150 μg/mL D-luciferina, seguida de uma incubação de 5 min antes da luminescência de medição no timepoint de 48 h.
- Para estudos longitudinais, mantenha as células condições estéreis enquanto mede a luminescência. Continue a cultura em meios frescos, cheios entre medidas após ter substituído o luciferin-conter.
Nota: a concentração apropriada de siRNA variará com as moléculas diferentes do si-NPs e do siRNA. Ao usar polyplexes neutralmente carregados com um núcleo endosomolytic (por exemplo, PEG-DB), 100 nM é tipicamente bem tolerado pelas células e produz > 75% knockdown luciferase. A proporção de massa de PEG-DB para siRNA em 10 N+:P- ratio e 100 nm siRNA tratamentos (assumindo 26 BP sirna) é 23,3, ou seja, adicionar 23,3 ng de Peg-DB para cada 1,0 ng de siRNA. Por exemplo, adicione 1,16 μL de 3,33 mg/mL de polímero para 166,5 ng de siRNA para tratar um poço em 100 nM em uma placa de 96 poços (100 mL de volume de mídia por poço).
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Representative Results
Algumas características essenciais do si-NPs efetivo para a entrega in vivo de siRNA são o tamanho adequado (~ 20 – 200 nm de diâmetro), embalagem de siRNA e bioatividade de silenciamento de genes. Embora esta não seja uma lista exaustiva (como abordada na discussão), estas características básicas devem ser confirmadas antes de considerar mais testes de uma formulação.
A Figura 2 ilustra a caracterização do tamanho da si-NP e da carga superficial na formulação. DLS e TEM são utilizados como métodos complementares para observar o tamanho de si-NP (ambos), polidispersidade (DLS) e morfologia (TEM). As medidas de DLS mostram que si-NP 1 tem um diâmetro médio de 35 nm, distribuição unimodal indicada pela presença de um pico único e baixa polidispersidade indicada por uma largura de pico relativamente estreita (Figura 2a). As medições de TEM confirmam a medida do tamanho da DLS, sugerem a presença de uma população uniforme de si-NPs e revelam a morfologia esférica do si-NPs (Figura 2C). As medidas de DLS e TEM de si-NP 2 revelam que tem tamanho indesejável (> 200 nm de diâmetro) de diâmetro médio 1.500 nm, uma população multimodal e polidispersa, e agregados em solução, formando nenhuma morfologia de partícula distinta (Figura 2b, D ). Ambos os si-NPs 1 e 2 exibem carga de superfície neutra, indicada por valores potenciais Zeta médios quase zero (Figura 2e).
A eficiência do carregamento de siRNA em si-NPS é caracterizada usando um ensaio do atraso do gel do agarose. O siRNA un-complexed migra através do gel do agarose e é visualizado (devido à ligação do brometo do etídio) na parte inferior do gel. Quando o siRNA é complexado com o polímero para formar si-NPs, a migração através do gel de agarose é obstruída e o siRNA é visualizado na parte superior do gel (ou onde foi carregado em poços). Para o si-NPs baseado em PEG-DB, a complexação aumenta com o aumento das relações n+:P até que a complexação completa seja alcançada em ~ 10-20 n+:P- Ratio (Figura 3).
A luciferase é usada como um gene modelo para a avaliação rápida da bioatividade de silenciamento do gene si-NP. As medições de bioluminescência através de um leitor de placas ou sistema de imagem óptica in vivo permitem a quantificação rápida e de alta produtividade da expressão de proteína luciferase em formato de placa de poço. Esta técnica é consideravelmente mais rápida, mais barata, e menos onerosa do que a análise de silenciamento genético através de análises moleculares tradicionais, tais como PCR (expressão gênica) e Western blot (expressão protéica). Por este método, as pilhas luciferase-expressando são tratadas com o si-NPs do luciferase e si-NPs mexidos (como um controle), e a atividade do luciferase do% é calculada comparando o sinal da luminescência às pilhas não tratadas. A luciferase bioativa si-NPs apresentará diminuição significativa da atividade da luciferase quando comparada diretamente ao controle de si-NP embaralhado, como pode ser observado para si-NP 1 na Figura 4. Em contrapartida, a luciferase si-NPs que não reduz a atividade de luciferase em comparação com o controle de si-NP embaralhado (como si-NP 2) não é considerada bioativa (Figura 4). Muitas vezes 48 h é o tempo de silenciamento gênico máximo (Figura 4), mas observamos silenciamento genético significativo em pontos temporais variando de 24 h a 240 h pós-tratamento.
Figura 1. Química do polímero e si-NP esquemático. (A) composição química do copolímero DIBLOCK Peg-DB que compõe si-NPS e dota a carga de superfície neutra (bloco PEG) e comportamento responsivo ao pH (bloco DB). (B) auto-montagem de si-NPS. No pH 4,0, o bloco DB é solúvel em água porque as aminas terciárias DMAEMA são altamente protonadas. O bloco DB positivamente-carregado eletrostaticamente complexos moléculas de siRNA negativamente carregadas. O pH é ajustado então a ~ 7,4 pela adição do amortecedor do fosfato de 5x pH 8,0, tendo por resultado o "Hydrophobization" do bloco do DB e o sequestro de siRNA e DB dentro do núcleo de si-NPS. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Caracterização de DLS e TEM do tamanho de si-NP, carga superficial e morfologia. (A, C) si-NP 1 representa uma amostra uniforme com tamanho adequado (~ 50-100 nm de diâmetro), enquanto que (B, D) si-NP 2 formou agregados indesejáveis, grandes e polidispersos. (E) ambos si-NPS apresentam carga superficial quase neutra (potencial zeta). Barras de erro representam erro padrão. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Ensaio de retardamento de gel de agarose para avaliar a eficiência de carregamento de si-NP siRNA. O desaparecimento de faixas de siRNA no fundo do gel indica a complexação de siRNA ao polímero. O siRNA polímero-complexed é incapaz de migrar através do gel e é visualizado assim na parte superior do gel próximo os poços de carregamento. Como o N+:P- ratio é aumentado, a complexação de siRNA aumenta, como indicado pela diminuição da intensidade da banda de siRNA na parte inferior do gel. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Knockdown si-NP-negociado do gene modelo luciferase em células de luciferase MDA-MB-231. Atividade de luciferase em (A) 24 h e (B) 48 h pós-tratamento com si-NPS mexidos ou luciferase si-NPS a 10 N+:P- ratio e 100 nm de siRNA dose. % A atividade de luciferase é calculada dividindo-se o sinal de luminescência das amostras de tratamento (mexidos e luciferases) pelo sinal de luminescência de células não tratadas. Nota: si-NP 1 representa uma formulação efetiva com bioatividade de silenciamento gênico, enquanto que si-NP 2 representa uma formulação sem bioatividade de silenciamento genético. (*) indica uma diferença estatisticamente significante (p < 0, 5) em comparação com o grupo mexido para uma formulação em um determinado timepoint. Barras de erro representam erro padrão. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os si-NPs descritos aqui são formados por associação eletrostática de siRNA aniônica e Polímeros Catiônicos em complexos de poliion (polyplexes). A complexação eletrostática de siRNA e o bloco catiônicos DB de polímeros Peg-DB são facilitadas pela mistura a baixo pH (4,0). No pH 4,0, o DMAEMA é altamente protonado e, consequentemente, o bloco DB é altamente carregado. Isto assegura-se de que os polímeros se dissolvem como unimers na solução ao contrário de formar micelas e que complexos do DB eficientemente com siRNA. Subseqüentemente, o pH da solução é ajustado ao neutro (pH 7,4), causando o ' Hydrophobization do ' do bloco do DB, a formação do micela, e o aprisionamento do siRNA complexado dentro do núcleo dos polyplexes resultantes. Estes polyplexes são projetados tais que o PEG dá forma a um escudo hidrófilo, inerte em torno do núcleo de DB/siRNA, tendo por resultado a carga de superfície neutra que é necessária para a administração sistemática. A química do polímero e o processo de formação de poliplexos estão delineados na Figura 1.
A caracterização físico-química rigorosa do si-NPs é essencial para determinar se as formulações são apropriadas para a mudança em testes biológicos. O tamanho, a carga de superfície, e a forma/morfologia da partícula são todos os parâmetros importantes que podem impactar o desempenho biológico. Para a entrega sistemática aos tumores, o tamanho do si-NP deve cair entre 20-200 nanômetro diâmetro22, e a maioria de estudos recentes sugerem que as partículas do diâmetro de 20-50 nanômetro são ideais23. A carga superficial deve ser neutra ou levemente negativa para minimizar a adsorção e a opsonização da proteína28. Estudos têm investigado a conexão entre a forma de partícula e a folga farmacocinética/partícula, sugerindo que partículas com alta relação de aspecto sejam desejáveis sobre as partículas esféricas29,30,31. No entanto, até à data, as partículas esféricas ainda são mais comumente empregadas, e a nosso conhecimento, são a única forma de partícula a ter sido traduzida para estudos humanos em Oncologia.
É importante notar que a formação uniforme e consistente de poliplexes, como os si-NPs aqui apresentados, depende de uma gama de parâmetros físico-químicos. Nós encontramos empiricamente que a concentração de Polyplex, o pH da solução, e a relação do polímero a siRNA (N+:P- ratio) todos dràstica impactam a formação do Polyplex. Em nossas mãos, a concentração de siRNA não tem um grande impacto na formação de poliplexos, mas usando concentrações de polímero em excesso de 3,33 mg/mL resulta em formação de grandes agregados e tamanho de Polyplex inconsistente. Como estes si-NPs são pH-responsivos, uma variedade de problemas podem surgir quando o pH final das soluções si-NP é muito ácida (< pH 7,2). Duas maneiras de evitar essas complicações são a liofilizar polímeros em puro diH2O para que não haja sais para alterar a composição do buffer após a dissolução e para re-fazer buffers freqüentemente para evitar a "deriva" de pH tampão ao longo do tempo. Para ser cauteloso, o pH dos bufferes deve ser confirmado cada vez antes de fazer si-NPs, e o pH final de soluções do si-NP deve sempre ser verificado. Finalmente, o N+:P- ratio de si-NPS impacta a eficiência do carregamento de siRNA e parâmetros físico-químicas Polyplex. Existe tipicamente um ideal N+:P- rácio em que todos os siRNA é carregado, mas não há uma superabundância de polímero un-complexed que forma populações separadas de micelas e aumenta a citotoxicidade. Para os si-NPs apresentados aqui, N+:P- 10-20 é o intervalo em que a consistência e o desempenho ideais foram observados.
As linhas celulares de repórter luciferase são usadas aqui para a análise rápida e de alta produtividade da bioatividade de si-NP. As linhas celulares do repórter luciferase devem ser geradas ou compradas antes de iniciar a análise da bioatividade, exigindo, assim, um investimento inicial em tempo e despesa. Entretanto, o uso das pilhas do repórter do luciferase para avaliar o silenciamento do gene é mais rápido, mais passíveis à análise da elevado-taxa de transferência, e mais barato sobre o tempo do que realizando RT-PCR (para medir a expressão do mRNA) ou os borrões ocidentais (para medir a expressão da proteína). Por exemplo, a luminescência de medição neste ensaio toma tipicamente apenas alguns minutos ao contrário dos processos durante todo o dia ou do múltiplo-dia necessários executar RT-PCR ou borlas ocidentais. Além disso, as medições de luminescência podem ser conduzidas em placas de poços, permitindo a quantificação simultânea de muitas amostras (até 96 placas de poços têm sido utilizadas pelos autores). Por último, D-luciferin é o único reagente necessário acima e além dos reagentes típicos da cultura de pilha, fazendo o método muito mais disponível do que RT-PCR ou borrão ocidental. Deve-se notar entretanto, que o ensaio da pilha do repórter do luciferase é limitado a somente avaliar o silenciamento do gene do luciferase do gene modelo e não pode ser usado para medir o silenciamento do gene de outros "genes terapêuticos" do interesse. Assim, os autores remetem os leitores a vários estudos onde RT-PCR e/ou Western blot tem sido utilizado para avaliar o silenciamento gênico de genes terapêuticos de interesse24,32,33,34.
Além da bioatividade, os pesquisadores devem considerar idealmente uma gama abrangente de testes biológicos in vitro para caracterizar o desempenho de si-NP. O ensaio de luciferase descrito acima também pode ser usado para avaliar a viabilidade celular comparando o sinal de luminescência de células tratadas com si-NP embaralhadas a células não tratadas. Como o siRNA é uma sequência sem direcionamento, qualquer alteração na luminescência pode ser atribuída ao impacto não específico do si-NPs na viabilidade celular, e esse efeito é tipicamente dependente da química do polímero e da quantidade molar. As técnicas na citometria do fluxo e na microscopia fluorescente podem ser usadas para avaliar a tomada da pilha de si-NPs usando siRNAs fluorescently-etiquetados, polímeros, ou ambos. Adicionalmente, as técnicas moleculars tais como o PCR do haste-laço e a imunoprecipitação de Argonaut 2 podem ser usadas para medir precisamente níveis intracelular do siRNA. Como o siRNA é apenas Bioativo se entregue ao citosol, onde é carregado em RISC, si-NPs deve desencadear a fuga endossomal de siRNA uma vez internalizada pela célula. Os ensaios usados para medir experimentalmente o escape endossomal incluem o ensaio da hemólise do glóbulo vermelho (descrito em detalhe por Evans e outros35), imagem latente fluorescente do colocalization da carga fluorescente etiquetada de si-NP e do lysotracker36, e mais recentemente, a imagem latente fluorescente do recrutamento de galectin 8 às vesículas endossomal perfuradas37,38. A coleta de dados e a síntese dos resultados de experimentos in vitro para viabilidade celular, captação de células, escape endossomal e Bioatividade fornecem ao pesquisador peças complementares de informação a partir das quais desenhar interpretações e angariar mecanicista visão sobre si-NP (in) eficácia.
Em suma, as nanopartículas capazes de entregar eficientemente siRNA têm um tremendo potencial para tratar a doença. Por exemplo, em Oncologia, muitos genes que causam a progressão do câncer, a resistência à terapia e a metástase são ' undruggable ' pela farmacologia convencional, mas podem ser tratados usando siRNA. No entanto, pré-requisito para a sua utilização em modelos animais de doença, os nanomedicamentos siRNA (referidos aqui como si-NPs) requerem extensa caracterização físico-química e biológica para garantir a sua segurança e eficácia. Para este fim, os métodos foram descritos nisto para produzir e caracterizar in vitro o si-NPs, por que o si-NPs pode ser avaliado para a adequação para transportar para a frente em estudos animais.
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Disclosures
Os autores não divulgam potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos Drs. Craig Duvall e Rebecca Cook pelo acesso a dados e recursos laboratoriais para a realização desta pesquisa. Os autores são gratos ao Instituto Vanderbilt para a nanoescala de ciência e engenharia (VINSE) para o acesso a DLS e TEM (NSF EPS 1004083) instrumentos. Os autores são gratos à Fundação Nacional de ciência para apoiar o programa de bolsas de pós-graduação em pesquisa (NSF # 1445197). Os autores agradecem aos institutos nacionais de saúde pelo apoio financeiro (NIH R01 EB019409). Os autores são gratos ao departamento de defesa Congressionally dirigido programa de pesquisa médica para apoio financeiro (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
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