Summary
Metoder för att bereda och karakterisera de fysikalisk-kemiska egenskaperna och bioaktiviteten hos neutralt laddade, pH-responsiva siRNA-nanopartiklar presenteras. Kriterier för framgångs rika siRNA nanomedicines som storlek, morfologi, ytladdning, siRNA lastning och nedtystning av gener diskuteras.
Abstract
Framgången för siRNA som en riktad molekylär medicin är beroende av dess effektiva cytosoliska leverans till celler i vävnaden i patologi. Klinisk framgång för behandling av tidigare "oregerliga" mål för lever sjukdom med siRNA har uppnåtts. Emellertid, effektiv tumör siRNA leverans nödvändigdrar ytterligare farmakokinetiska design överväganden, inklusive lång cirkulations tid, undvikande av clearance organ (t. ex., lever och njurar), och tumör penetration och retention. Här beskriver vi preparering och in vitro fysikalisk-kemisk/biologisk karakterisering av polymernanopartiklar konstruerade för effektiv siRNA leverans, särskilt till icke-hepatiska vävnader såsom tumörer. SiRNA nanopartiklar bereds genom elektro statisk komplexering av siRNA och diblocksampolymerpoly (etylenglykol-b-[2-(dimethylamino) etylmetakrylat-co-butylmetakrylat]) (PEG-dB) för att bilda polyjonkomplex ( polyplexes) där siRNA binds i polyplexkärnan och PEG bildar en hydrofil, neutralladdad Korona. Dessutom, DB blocket blir membran-lytic som vesikler av endolysosomala vägen försura (< pH 6,8), utlöser endosomal flykt och cytosoliskt leverans av siRNA. Metoder för att karakterisera de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos siRNA nanopartiklar såsom storlek, ytladdning, partikelmorfologi och siRNA-lastning beskrivs. Bioaktivitet av siRNA nanopartiklar mäts med luciferas som en modell gen i en snabb och hög genom strömning gen ljud dämpning assay. Konstruktioner som klarar dessa initiala tester (såsom PEG-DB-baserade polyplexes) anses lämpliga för översättning till prekliniska djur studier som bedömer leveransen av siRNA till tumörer eller andra sjukdoms platser.
Introduction
Eftersom sirnas hämmar översättningen av proteiner från mRNA-sekvenser, kan de teoretiskt användas för att drog alla kända patologier1,2,3,4,5. Användningen av siRNA i medicin begränsas dock av den övergripande dåliga farmakokinetiska profilen för siRNA-molekyler6,7. När sirnas injiceras intravenöst elimineras de snabbt genom njurarna och/eller bryts ned av nukleaser8,9. På grund av dess stora storlek och negativa laddning kan siRNA inte komma in i cellerna eller undkomma den endolysosomala vägen för att få till gång till det RNA-inducerade ljud dämpnings komplexet (RISC) som finns i cytosolen10,11,12, och 13. Därför har omfattande insatser fokuserat på design och implementering av siRNA leverans strategier14. Denna ansträngning har till stor del fokuserat på utvecklingen av lipidbaserade och polymerbaserat nanopartiklar som paketerat siRNA, skyddar den från clearance och nedbrytning in vivo, och initierar cellulär upptag och endosomal flykt genom joniserbara, katjoniska amingrupper. Många prekliniska framgångar har rapporter ATS och senast, den första kliniska framgången har rapporter ATS för nanoparticle-baserade hepatiska siRNA leverans för att behandla ärftlig transthyretin-medierad (hATTR) amyloidos15.
Det finns många cancerframkallande gener som för närvarande "undruggable" av konventionella farmakologi (dvs., små molekyl droger), motivera utformningen av polymera siRNA nanopartiklar (SI-NPs) för att behandla cancer16. Det finns dock en separat uppsättning design parametrar som måste övervägas för icke-hepatisk siRNA-leverans. Leverans systemet måste skydda den katjoniska laddningen av Polyplex som orsakar agglutination inom den systemiska cirkulationen17,18,19. För tumör leverans, specifikt, SI-NP stabilitet är viktigt att ge lång cirkulation och därmed ökad ackumulering inom tumörer via förbättrad permeabilitet och retention (EPR) effekt20,21. Dessutom kontroll över si-NP storlek är viktigt eftersom endast nanopartiklar cirka 20-200 nm diameter i storlek hävstångs effekt EPR22, och mindre si-NPs (~ 20-50 nm diameter) uppvisar förbättrad tumör penetration över större storlek nanopartiklar och mikropartiklar23.
För att åtgärda dessa ytterligare konstruktions begränsningar för systemisk tumör leverans av siRNA efter intravenös administrering, har neutralt laddade, pH-responsiva si-NPs utvecklats (figur 1)24. Dessa si-NPs är pegylerat, eller senast Zwitterionated25, för neutral ytladdning och resistens mot proteinadsorption och Opsonization i omlopp. Eftersom de inte kan förlita sig enbart på katjonkaraktär för att driva intracellulär leverans, är extremt effektiv endosomal flykt absolut nödvändigt för att uppnå potent gen ljud dämpning. Följaktligen är kärnan i dessa si-NPs består av en mycket endosomolytic kärna som är inert vid extracellulär pH (7,4), men som utlöses i en switch-liknande sätt i de försurade villkoren för endolysosomala vägen [pH 6,8 (tidig endosomer)-5,0 ( lysosomer)]. Slutligen, en blandning av katjoniska och hydrofoba innehåll i kärnan av si-NPs ger både elektro statiska och Van der Waals stabiliserings styrkor, förbättra stabiliteten i si-NPs i blodet jämfört med bara katjoniska system.
Integrationen av många funktioner i en relativt enkel konstruktion är möjlig med hjälp av reversibel addition-fragmentering Chain transfer (RAFT) kontrollerad polymerisation för att producera polymerer med komplex arkitektur och exakt komposition. För att producera si-NPs med neutral ytladdning, pH-respons, och NP stabilitet, flotte används för att syntetisera poly (etylenglykol-b-[2-(dimethylamino) etylmetakrylat-co-butylmetakrylat]) (PEG-DB; Figur 1a). PEG-DB är elektrostatiskt komplex med siRNA, som bildar si-NPs med en PEG-Korona och DB/siRNA-kärna (figur 1b). PEG bildar ett inert, neutralladdat hydrofila skikt på SI-NP-koronan. DB-blocket består av ett 50:50 molar-förhållande på 2-(dimethylamino) etylmetakrylat (DMAEMA) och butylmetakrylat (BMA). Katjoniska DMAEMA elektrostatiskt komplex negativt laddade siRNA. BMA Self-Associates inom NP kärnan av Van der Waals interaktioner, vilket ökar NP stabilitet. Tillsammans, DMAEMA och BMA förmedla pH-beroende lipidbilayer-lytic beteende till DB polymer blocket. Vid extracellulär pH, är DB blocket binds till si-NP kärna och är inert mot lipidbilayers. Under sura förhållanden, såsom de inom den endolysosomala vägen, fören klar joniserbar DMAEMA inom DB-blocket protonsvampeffekten, där endosomal buffring leder till osmotisk svullnad och ruptur26. Dessutom, hydrofoba BMA-delarna inom DB-blocket integreras aktivt i och lysera lipidbilayers, vilket resulterar i potent endosomolysis. Därför är siRNA komplex med PEG-DB för att bilda si-NPs som är neutralt laddade och mycket stabila vid extracellulär pH men som stör lipidbilayers vid surt pH, vilket säkerställer cytosolisk leverans av siRNA-nyttolasten.
Häri beskrivs de experimentella procedurer för att producera si-NPs från PEG-DB. Metoder för att karakterisera de fysikalisk-kemiska parametrarna och bioaktiviteten hos si-NPs presenteras och diskuteras. För att snabbt kunna bedöma si-NP-bioaktivitet används luciferas som en modell gen för knockdown-studier. Firefly Luciferase är proteinet som ansvarar för "glöd" av eld flugor27. Följaktligen, däggdjurs celler transfekterade med Firefly luciferas genen producerar en bioluminiscerande "glöd" som kan fångas med hjälp av en luminometer för att kvantifiera nivåer av luciferas uttryck. Här använder vi Luciferase för att utvärdera bio aktiviteten hos si-NPs genom att leverera siRNA mot Luciferase och kvantifiera motsvarande reduktion i bioluminescens i Luciferase-uttryck celler jämfört med celler som tar emot en kodad siRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelse och karakterisering av si-NPs
- SI-NP beredning
- Lös upp polymeren i 10 mM citron syra buffert (pH 4,0) vid 3,33 mg/mL. Polymer kan först lösas upp vid 10x koncentration i etanol för att säkerställa upplösning.
Anmärkning: polymer kan lösas upp vid lägre koncentrationer, men användning vid koncentrationer över 3,33 mg/mL kan förhindra homogent NP-bildning. - Tillsätt siRNA (50 μM i diH2O) för att resultera i N+:P- förhållandet 10. Blanda polymeroch siRNA lösningar grundligt genom att Pipettera och låt Inkubera i 30 min. N+:P- kvoten representerar antalet positivt laddade amingrupper på polymeren till antalet negativt laddade fosfat grupper på siRNA och beräknas med formeln nedan:
där mol pol är den molara mängden polymer, RU Amin är antalet upprepande enheter av positivt laddade aminer per polymer, mol siRNA är molar mängden siRNA, och BP siRNA är antalet bas par per siRNA molekyl. - Tillsätt ett 5-faldigt överskott på 10 mM fosfatbuffert (pH 8,0) och blanda försiktigt antingen genom pipettering eller invertering av röret. För att bekräfta att det slutliga pH-värdet är neutralt (~ 7.2-7.5), Pipettera 10 μL av si-NP-lösningen på pH-provremsor.
Anmärkning: citron syra och fosfatbuffertar bereds enligt Millipore Sigma buffer referens Center diagram.
- Lös upp polymeren i 10 mM citron syra buffert (pH 4,0) vid 3,33 mg/mL. Polymer kan först lösas upp vid 10x koncentration i etanol för att säkerställa upplösning.
- Fysikalisk-kemisk karaktärisering av si-NPs
- Registrera storlek och ytladdning för resulterande si-NPs med dynamisk ljus spridning (DLS). Förbered ett DLS-prov genom att filtrera 1 mL si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) genom 0,45 μm porstorlek spruta filter i en kvadrat kvarts eller polystyren kyvetten. Mätningar av inspelnings storlek och ytladdning med hjälp av ett DLS-instrument enligt tillverkarens specifikationer.
- Kontrol lera si-NPs storlek och morfologi genom bild analys med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM).
- Tillsätt 5 μL av si-NP-lösningen med 1 mg/mL till TEM-galler och inkubera för 60. blot torka i 3 s.
- Tillsätt 5 μL 3% uranyl acetatlösning och inkubera i 20 s. blot torka i 3 s. torra galler under natten under uttorkning.
- Bild rutnät enligt det protokoll som upprättats för det specifika Mikroskop som ska användas.
- Karakterisera lastning av siRNA i si-NPs på olika N+:P- nyckeltal med AGA ros gel retardation.
- För att producera 2% AGA ros gel, tillsätt 2 g elektrofores grade AGA ros pulver till 100 ml 1x Tae (tris-acetat-EDTA) buffert vid pH 8,0. Rör om för att suspendera agarose. Värme avtäckt i mikrovågsugn tills alla AGA ros är upplöst (1-3 min).
- När den svalnat, tillsätt 5 μL etidiumbromid (10 mg/mL i H2O) och blanda väl. Häll AGA ros i en gel bricka och placera kam för att producera brunnar, låta torka i 30 min. Ta försiktigt bort kam för att lämna bakom lastning brunnar, och fyll gel bricka till max fyllnings linje med 1x Tae buffert.
- Generera si-NPs (enligt förfarandet ovan) på 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, och 40 N+:P- nyckeltal. Placera 2 μL av påfyllnings färg ämnet (inga SDS och Reduktions medel) på paraffin film för varje si-NP-formulering. Blanda 10 μL av si-NP lösning med påfyllnings färg ämne på paraffin film med pipett.
- Tillsätt si-NP/laddar färg ämnen lösningar till AGA ros gel brunnar. Kör spännings källa vid 100 V för 35 min (eller tills proverna har korsad 80% av gel längden).
- Visualisera siRNA-banden på en UV-transilluminator enligt tillverkarens specifikationer.
- Kontrol lera si-NPs storlek och morfologi genom bild analys med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM).
2. bestämning av bio aktiviteten in vitro hos si-NPs
- Knockdown av modellera genen luciferas
- Generera luciferas si-NPS (enligt förfarandet ovan) med luciferas siRNA och kodade si-NPS med en kodad siRNA sekvens som en kontroll. Formualte båda si-NPs på samma slutliga N+:P- ratio och i det optimala förhållandet identifierats av AGA ros gel utvecklingsstörning studier. Exempel på siRNA-sekvenser ingår i material tabellen.
- Seed luciferase-uttrycker celler [MDA-MB-231/Luciferase (BSD) stabila celler] i 96-väl svartväggiga plattor med en densitet av 2 000 celler per brunn. Låt hålla över natten i full media (DMEM, 10% FBS) i en inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% luft fuktighet).
- Späd ut si-NPs till ett fullständigt serum medium för en slutlig volym på 100 μL per brunn och siRNA-koncentrationen på 100 nM. Behandla celler i 24 timmar med si-NPs.
- Efter 24 timmar, ta bort behandlingar och ersätt media med full serum media som innehåller 150 μg/mL D-luciferin. Inkubera cellerna i 5 minuter före mätning av Luminescens på en Plattläsare eller in vivo optiskt bild tagnings system enligt tillverkarens specifikationer.
- Ersätt luciferin-innehållande media med färska, fullständiga serum medier och inkubera 24 timmar mer. Upprepa steget ovan, ta bort media och Ersätt med full serum media som innehåller 150 μg/ml D-luciferin, följt av en 5 min inkubation före mätning luminiscens vid 48 h timepoint.
- För longitudinella studier, bibehålla cellerna under sterila förhållanden och samtidigt mäta Luminescens. Fortsätt att odla i fräscha, fulla medier mellan mätningarna efter byte av luciferin-innehållande.
Obs: lämplig siRNA-koncentration kommer att variera med olika si-NPs-och siRNA-molekyler. Vid användning av neutralladdade polyplexes med en endosomolytisk kärna (t. ex. PEG-dB), är 100 nM vanligt vis väl tolererad av cellerna och producerar > 75% luciferas knockdown. Massan förhållandet PEG-DB till siRNA vid 10 N+:P- ratio och 100 nM siRNA behandlingar (förutsatt 26 BP sirna) är 23,3, dvs lägga 23,3 ng av PEG-dB för varje 1,0 ng av siRNA. Tillsätt till exempel 1,16 μL 3,33 mg/mL polymer för 166,5 ng av siRNA för att behandla en brunn vid 100 nM i en 96-well-platta (100 mL median volym per brunn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vissa väsentliga egenskaper hos effektiva si-NPs för in vivo siRNA leverans är rätt storlek (~ 20-200 nm diameter), siRNA förpackning, och gen tysta bio aktivitet. Även om detta inte är en uttömmande förteckning (som behandlas i diskussionen), bör dessa grundläggande egenskaper bekräftas innan man överväger ytterligare testning av en formulering.
Figur 2 illustrerar karaktäriseringen av si-NP-storlek och ytladdning vid formulering. DLS och tem används som kompletterande metoder för att observera si-NP storlek (båda), polydispertion (DLS), och morfologi (TEM). DLS-mätningar visar att si-NP 1 har en genomsnittlig diameter på 35 nm, en unimodala fördelning som indikeras av närvaron av en enda topp och låg polydispersitet som indikeras av en relativt smal topp bredd (figur 2A). TEM-mätningar bekräftar storleks mätningen från DLS, antyder närvaron av en enhetlig population av si-NPs, och avslöjar den sfäriska morfologin för si-NPs (figur 2C). DLS och TEM mätningar av si-NP 2 avslöjar att den har oönskade storlek (> 200 nm diameter) av genomsnittlig diameter 1 500 Nm, en multimodal och polydisperse population, och aggregat i lösning, bildar ingen distinkt partikel morfologi (figur 2b, D ). Både si-NPs 1 och 2 visar neutral ytladdning, vilket indikeras med nästan noll medelvärde Zeta potentiella värden (figur 2e).
Lastning effektivitet siRNA i si-NPs kännetecknas med hjälp av en AGA ros gel utvecklingsstörning analys. Un-complexed siRNA migrerar genom AGA ros gel och visualiseras (på grund av bindning av etidiumbromid) vid gelen botten. När siRNA är komplex med polymeren för att bilda si-NPs blockeras migrationen genom AGA ros-gelen och siRNA visualiseras på gelen (eller där den laddades i brunnar). För PEG-DB-baserade si-NPs, ökar komplexering med ökande N+:P- nyckeltal tills full komplexering uppnås vid ~ 10-20 N+:P- förhållande (figur 3).
Luciferase används som en modell gen för en snabb bedömning av si-NP-genen tystande bio aktivitet. Bioluminescens mätningar via en Plattläsare eller in vivo optisk Imaging system möjliggör snabb, hög genom strömning kvantifiering av luciferas protein uttryck i väl-plattan format. Denna teknik är betydligt snabbare, billigare och mindre betungande än att analysera gen ljud dämpning genom traditionella molekyl ära analyser som PCR (gen uttryck) och Western blot (protein uttryck). Med denna metod, luciferas-uttrycker celler behandlas med luciferas si-NPS och kodade si-NPS (som en kontroll), och% luciferas aktivitet beräknas genom att jämföra luminiscens signal till obehandlade celler. BioActive luciferas si-NPs kommer att uppvisa signifikant minskad% luciferas aktivitet jämfört direkt med kodade si-NP kontroll, som kan ses för si-NP 1 i figur 4. I kontrast, luciferas si-NPs som inte minskar% luciferas aktivitet jämfört med kodade si-NP kontroll (såsom si-NP 2) anses inte bioaktiva (figur 4). Ofta 48 h är tiden för maximal nedtystning av gener (figur 4), men vi har observerat betydande nedtystning av gener vid tidpunkter som sträcker sig från 24 h till 240 timmar efter behandlingen.
I figur 1. Polymerkemi och si-NP Schematisk. (A) kemisk sammansättning av diblocksampolymer PEG-DB som komponerar si-NPs och utruser neutral YTLADDNING (PEG-block) och pH-responsivt beteende (dB-block). Bsjälv montering av si-NPs. Vid pH 4,0, är DB blocket vattenlösligt eftersom DMAEMA tertiära aminer är mycket protonated. Den positivt laddade DB blocket elektrostatiskt komplex negativt laddade siRNA molekyler. PH justeras sedan till ~ 7,4 genom tillsats av 5x pH 8,0 fosfatbuffert, vilket resulterar i "hydrofobization" av DB block och bindning av siRNA och DB inom kärnan av si-NPs. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 2. DLS och TEM karaktärisering av si-NP storlek, ytladdning och morfologi. (A, C) SI-NP 1 representerar ett enhetligt prov med lämplig storlek (~ 50-100 Nm diameter), medan (B, D) SI-NP 2 har bildat oönskade, stora och polydisperse aggregat. (E) båda si-NPs visar nästan neutral ytladdning (Zeta potential). Felstaplar representerar standard fel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 3. Agarose gel utvecklingsstörning test för att bedöma si-NP siRNA lastning effektivitet. Borttagandet av siRNA-banden vid Gelens botten indikerar komplexering av siRNA till polymer. Polymer-complexed siRNA är oförmögen att migrera genom gelen och är därmed visualiseras på toppen av gelen i närheten av lastning brunnar. Eftersom N+:P- kvoten ökas, ökar siRNA komplexering, vilket indikeras av minskad intensitet av siRNA bandet vid gelen botten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 4. SI-NP-medierad knockdown av modell genen Luciferase i Luciferase MDA-MB-231-celler. Luciferasaktivitet på (a) 24 h och (B) 48 h efter behandling med antingen kodade si-NPS eller luciferas si-NPS vid 10 N+:P-ratio och 100 nM siRNA- DOS. % Luciferase aktivitet beräknas genom att dividera luminiscens signalen av behandling prover (kodade och luciferase) av luminiscens signalen av obehandlade celler. Anmärkning: si-NP 1 är en effektiv formulering med bio aktivitet med nedtystning av gener, medan si-NP 2 representerar en formulering utan att genen tystas bioaktivitet. (*) indikerar en statistiskt signifikant skillnad (p < 0,05) jämfört med gruppen kodade för en formulering vid en given tidpunkt. Felstaplar representerar standard fel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SI-NPs beskrivs här bildas genom elektro statisk Association av anjon siRNA och katjoniska polymerer till polyjon komplex (polyplexes). Elektro statisk komplex bildare av siRNA och det katjoniska DB-blocket av PEG-DB-polymerer under lättas genom blandning vid lågt pH (4,0). Vid pH 4,0, DMAEMA är mycket protonated, och därmed DB blocket är mycket laddad. Detta säkerställer att polymererna löses upp som unimers i lösning i stället för att bilda miceller och att DB-komplex effektivt med siRNA. Därefter justeras pH-värdet till neutralläge (pH 7,4), vilket leder till "hydrofobization" av DB-blocket, micellkoncentration-formationen och Entrapment av den komplex siRNA inom kärnan av de resulterande polyplexes. Dessa polyplexes är utformade så att PEG bildar ett hydrofila, inert skal runt DB/siRNA-kärnan, vilket resulterar i neutral ytladdning som är nödvändig för systemisk administrering. Polymerkemi och process av Polyplex formation beskrivs i figur 1.
Rigorös fysikalisk-kemisk karakterisering av si-NPs är avgörande för att avgöra om formuleringar är lämpliga för att flytta till biologisk testning. Storlek, ytladdning och partikel form/morfologi är viktiga parametrar som kan påverka den biologiska prestandan. För systemisk leverans till tumörer, SI-NP storlek bör falla mellan 20-200 nm diameter22, och de senaste studierna tyder på 20-50 nm diameter partiklar är idealiska23. Ytladdningen ska vara neutral eller något negativ för att minimera proteinadsorption och Opsonization28. Studier har undersökt sambandet mellan partikel form och farmakokinetik/partikel clearance, vilket tyder på att partiklar med hög bild förhållande är önskvärda över sfäriska partiklar29,30,31. Men hittills sfäriska partiklar är fortfarande vanligast, och till vår kännedom, är den enda partikel form som har översatts till mänskliga studier i onkologi.
Det är viktigt att notera att den enhetliga och konsekventa bildandet av polyplexes, såsom si-NPs som presenteras här, är beroende av en rad fysikalisk-kemiska parametrar. Vi har funnit empiriskt att Polyplex koncentration, pH i lösningen, och förhållandet mellan polymer till siRNA (N+:P- ratio) alla drastiskt påverka Polyplex formation. I våra händer, har siRNA koncentration inte en stor inverkan på Polyplex bildning, men med hjälp av polymerkoncentrationer över 3,33 mg/mL resulterar i bildandet av stora aggregat och inkonsekvent Polyplex storlek. Eftersom dessa si-NPs är pH-lyhörd kan en mängd problem uppstå när det slutliga pH-värdet för si-NP-lösningarna är för surt (< pH 7,2). Två sätt att förhindra dessa komplikationer är att frystorkade polymerer i ren diH2O så att det inte finns några salter att ändra buffertsammansättning vid upplösning och att åter göra buffertar ofta för att förhindra att "drifting" av buffert pH över tiden. För att vara försiktig, bör pH buffertar bekräftas varje gång innan du gör si-NPs, och det slutliga pH-värdet av si-NP lösningar bör alltid verifieras. Slutligen, N+:P- förhållandet mellan si-NPs påverkar siRNA lastning effektivitet och Polyplex fysikalisk-kemiska parametrar. Det finns typiskt en idealisk N+:P- förhållande där alla siRNA är laddad men det finns inte ett överflöd av un-komplex polymer som bildar separata populationer av miceller och ökar cytotoxicitet. För si-NPs presenteras här, N+:P- 10-20 är det område där optimal konsistens och prestanda har observerats.
Luciferase reporter cellinjer används här för snabb och hög genom strömning analys av si-NP bio aktivitet. Luciferase reporter cellinjer måste genereras eller köpas innan du påbörjar bio aktivitet analys, vilket kräver en initial investering i tid och bekostnad. Emellertid, användning av luciferas reporter celler för att bedöma nedtystning av gener är snabbare, mer mottagliga för hög genom strömning analys, och billigare med tiden än att utföra RT-PCR (för att mäta mRNA uttryck) eller västra blotting (för att mäta protein uttryck). Till exempel, mäta luminiscens i denna analys tar vanligt vis bara några minuter i motsats till hela dagen eller flera dagar processer som krävs för att utföra RT-PCR eller västra blots. Dessutom kan luminiscens mätningar utföras på väl plattor, vilket möjliggör samtidig kvantifiering av många prover (upp till 96-well plattor har använts av författarna). Slutligen, D-luciferin är den enda reagens som behövs utöver typiska cell kulturer reagenser, vilket gör metoden mycket billigare än RT-PCR eller Western blot. Det bör dock noteras att luciferas reporter cell analysen är begränsad till att endast bedöma nedtystning av modellen genen luciferas och kan inte användas för att mäta gen ljud dämpning av andra "terapeutiska gener" av intresse. Författarna hänvisar därför läsarna till flera studier där RT-PCR och/eller Western blot har använts för att bedöma avljud av terapeutiska gener av intresse24,32,33,34.
Förutom bio aktivitet, bör forskarna helst överväga ett omfattande spektrat av in vitro biologiska tester för att karakterisera si-NP prestanda. Den luciferas analys som beskrivs ovan kan också användas för att bedöma cellernas livs kraft genom att jämföra luminiscens signalen av kodade si-NP behandlade celler till obehandlade celler. Eftersom siRNA är en icke-riktad sekvens, kan varje förändring i luminiscens hänföras till icke-specifika effekter av si-NPs på cellernas livs kraft, och denna effekt är typiskt beroende av polymerkemi och molar belopp. Tekniker i flödescytometri och fluorescerande mikroskopi kan användas för att bedöma cellupptag av si-NPs med fluorescently-märkta siRNAs, polymerer, eller båda. Dessutom kan molekyl ära tekniker såsom Stem-loop PCR och Argonaut 2 immunonederbörd användas för att exakt mäta intracellulära siRNA nivåer. Eftersom siRNA endast är bioaktivt om det levereras till cytosolen, där det lastas i RISC, måste si-NPs utlösa endosomal flykt av siRNA när den har internaliserats av cellen. Analyser som används för att experimentellt mäta endosomal flykt inkluderar den röda blod cells hemolys-analysen (beskrivs i detalj av Evans et al.35), fluorescerande avbildning av colokaliseringen av fluorescensmarkerade märkt si-NP-last och lysotracker36, och senast fluorescerande avbildning av rekryteringen av galectin 8 till punkterade endosomal vesikler37,38. Samla in data och syntetisera resultaten från in vitro-experiment för cellernas livs kraft, cellupptag, endosomal flykt och bio aktivitet ger forskaren kompletterande uppgifter som att dra tolkningar och samla mekanistiska insikt om si-NP (in) effektivitet.
Sammanfattnings vis har nanopartiklar som effektivt kan leverera siRNA en enorm potential att behandla sjukdomen. Till exempel, i onkologi, många gener som orsakar cancer progression, resistens mot terapi, och metastaser är "undruggable" av konventionell farmakologi men kan behandlas med siRNA. Men förutsättningen för deras användning i djur modeller av sjukdomen, siRNA nanomedicines (kallas här som si-NPs) kräver omfattande fysikalisk-kemisk och biologisk karakterisering för att säkerställa både deras säkerhet och effektivitet. För detta ändamål har metoder beskrivits häri för att producera och karakterisera si-NPs in vitro, genom vilken si-NPs kan bedömas för lämplighet att föra vidare till djur studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna avslöjar inga potentiella intresse konflikter.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma till DRS. Craig Duvall och Rebecca Cook för till gång till data och Lab resurser för att bedriva denna forskning. Författarna är tacksamma till Vanderbilt Institutet för nanoskala vetenskap och teknik (VINSE) för till gång till DLS och TEM (NSF EPS 1004083) instrument. Författarna är tacksamma till National Science Foundation för att stödja Graduate forskar stipendium program (NSF # 1445197). Författarna är tacksamma för de nationella hälso instituten för ekonomiskt stöd (NIH r01 EB019409). Författarna är tacksamma för Department of Defense Congressii riktat medicinsk forskning program för ekonomiskt stöd (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
