Summary
Fizikokimyasal özellikleri hazırlamak ve karakterize etmek için yöntemler ve nöphalı, pH duyarlı siRNA nanopartiküller biyoaktivite sunulmaktadır. Boyut, morfoloji, yüzey yükü, siRNA yüklemesi ve gen susturulması gibi başarılı siRNA nanometinler için kriterler tartışılmaktadır.
Abstract
SiRNA 'nın hedeflenen bir moleküler tıp olarak başarısı, patolojinin dokusu içindeki hücrelere verimli sitosolik teslimine bağlıdır. SiRNA ile daha önce ' undruggable ' hepatik hastalık hedeflerini tedavi etmek için klinik başarı elde edilmiştir. Ancak, verimli tümör siRNA teslim uzun dolaşım süresi, boşluk organları kaçırma (örneğin, karaciğer ve böbrek), ve tümör penetrasyonu ve tutma dahil olmak üzere ek farmakokinetik tasarım hususları gerektirir. Burada, özellikle tümör gibi non-hepatik dokularda, verimli siRNA dağıtımı için tasarlanan polimerik Nanopartiküllerin hazırlanması ve in vitro fizikokimyasal/biyolojik karakterizasyonu açıklanmaktadır. SiRNA nanopartiküller siRNA 'nın elektrostatik karmaşıklığı ve diblock kopolimer Poly (etilen glikol-b-[2-(dimethylamino) etil metakrilgeç-Co-butil metakrilgeç]) (Peg-DB) ile polyion kompleksler oluşturacak şekilde hazırlanmıştır ( polyplexes) nerede siRNA Polyplex çekirdek içinde strestered ve PEG formları hidrofilik, nötrally şarj Korona. Ayrıca, DB bloğu endolysosomal yolu asidify (< pH 6,8) veziküller olarak membran-lytic olur, endosomal kaçış ve siRNA sitosolik teslim tetikleyen. Boyut, yüzey yükü, parçacık Morfoloji ve siRNA yükleme gibi siRNA nanopartiküllerinin fizikokimyasal özelliklerini karakterize etme yöntemleri açıklanmıştır. SiRNA nanopartiküller bioactivity hızlı ve yüksek verimlilik gen susturma tahlil bir model geni olarak Lusiferaz kullanılarak ölçülür. Bu ilk testleri (PEG-DB tabanlı polyplexes gibi) geçen tasarımlar, siRNA 'nın tümörlere veya diğer patolojiler için teslimatını değerlendiren ön klinik hayvan çalışmalarına çeviri için uygun kabul edilir.
Introduction
Çünkü sirnas, proteinleri mRNA dizilerinden çevirmesini inhibe ettiği için, teorik olarak bilinen tüm patolojileri1,2,3,4,5' e ilaç olarak kullanabilirler. Ancak, tıpta siRNA kullanımı siRNA moleküllerinin kapsamlı yoksul farmakokinetik profili ile sınırlıdır6,7. İntravenöz olarak enjekte edildiğinde, sirnas böbrekler üzerinden hızla temizlenir ve/veya nükserler ile8,9' a düşer. Büyük boyutu ve negatif şarj nedeniyle, siRNA hücreleri giremezsiniz veya RNA kaynaklı susturma kompleksi erişmek için endolysosomal yol kaçmak (RıSC) sitsol içinde bulunan10,11,12, 13olmak üzere. Böylece, geniş çaba siRNA teslimat stratejileri tasarım ve uygulanması üzerinde duruldu14. Bu çaba büyük ölçüde lipid ve polimer bazlı nanopartiküller gelişimi üzerinde odaklanmıştır hangi paket siRNA, boşluk ve bozulma içinde vivo korumak, ve Able hücresel Alım ve endosomal kaçış ile iyonizlenebilir, katyonik Amin grupları. Birçok klinik öncesi başarı bildirilmiştir ve en son olarak, kalıtsal Transthyretin-aracılı (hATTR) amilidoz15' i tedavi etmek için nanopmadde bazlı hepatik siRNA tesliminde ilk klinik başarıda bildirilmiştir.
Geleneksel Farmakoloji (yani, küçük molekül ilaçlar) tarafından şu anda "undruggable" olan birçok kanser neden genler vardır, polimerik siRNA Nanopartiküllerin tasarımını motive (sı-NPs) kanser tedavisinde16. Ancak, non-hepatik siRNA teslim için dikkate alınmalıdır tasarım parametreleri ayrı bir dizi vardır. Teslimat sistemi sistemik dolaşım içinde aglütinasyon neden Polyplex cationıc şarj kalkanı gerekir17,18,19. Tümör teslim için, özellikle, si-NP stabilitesi bağışlamak uzun sirkülasyon için esastır ve böylece gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi ile tümörler içinde birikmesi artmıştır20,21. Dahası, üzerinde kontrol si-NP boyutu sadece nanopartiküller yaklaşık olarak esastır 20 – 200 Nm çapı boyutu kaldıraç EPR22, ve daha küçük si-NPS (~ 20 – 50 nm çapı) sergi daha büyük ölçekli nano maddeler üzerinde geliştirilmiş tümör penetrasyon ve mikroparçacıklar23.
İntravenöz uygulamadan sonra siRNA 'nın sistemik tümör teslim edilmemesi için bu ek tasarım kısıtlamalarını ele almak için, nötr olarak şarj edilen pH-duyarlı si-NPs geliştirilmiştir (Şekil 1)24. Bu si-NPS pegylated, ya da en son, zwitterionated25, nötr yüzey şarj ve protein adsorpsiyon ve dolaşım opsonizasyonla direnci için. Sadece hücre içi teslimat götürmek için katyonik karakter güvenemezsiniz beri, son derece verimli endosomal kaçış güçlü gen susturma elde etmek için zorunludur. Buna göre, bu si-NPS ' nin çekirdeği, ekstrasellüler pH 'da (7,4) inert olan, ancak endolysosomal yolunun asitlendirilmiş koşullarında anahtar benzeri bir şekilde tetiklenen yüksek endosomolitik çekirdeğden oluşur [pH 6,8 (erken endosomes) – 5,0 ( lysosomes)]. Son olarak, sı-NPs ' i k i çekirdek içindeki katyonik ve hidrofobik içeriğin bir karışımı, hem elektrostatik hem de Van der Waals stabilizasyon kuvvetlerini sağlar, sadece katyonik sistemlere kıyasla kan içinde sı-NPs ' i k i stabilitesini geliştirir.
Nispeten basit bir tasarıma birçok fonksiyonun entegrasyonu, karmaşık mimari ve hassas kompozisyon ile polimerler üretmek için geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) kontrollü polimerizasyon kullanılarak mümkündür. Sı-NPs ' i nötr yüzey şarjı, pH-duyarlılık ve NP stabilitesi ile üretmek için, RAFT Poly (etilen glikol-b-[2-(dimethylamino) etil metakrilgeç-Co-butil metakrilgeç]) (Peg-DB; Şekil 1a). PEG-DB, siRNA ile Electrostatik olarak karmaşıkmış, si-NPs ' i PEG Korona ve DB/siRNA çekirdeği ile şekillendirdi (Şekil 1B). PEG, sı-NP Korona üzerinde inert, nötrsel olarak şarj edilmiş bir hidrofilik tabaka oluşturur. DB bloğu 2-(dimethylamino) etil metakrilgeç (DMAEMA) ve butil metakrilgeç (BMA) 50:50 molar oranından oluşur. Cationic DMAEMA elektrostatik kompleksleri negatif-siRNA şarj. Van der Waals etkileşimleri tarafından NP çekirdek içinde BMA Self-Associates, NP istikrarı artan. Birlikte, dmaema ve BMA, DB polimer bloğuna pH bağımlıdır lipid bilayer-lytic davranışlarını vermek. Hücre dışı pH 'da, DB bloğu si-NP çekirdeğine göre kullanılır ve lipid bilayerine inert olur. Asidik koşullar altında, endolysosomal yol içinde olanlar gibi, DB bloğu içinde iyonizable DMAEMA proton sünger etkisini kolaylaştırır, endosomal tamponlama osrotik şişme ve rüptür26yol açar. Ayrıca, DB bloğundaki hidrofobik BMA moisanları, lipid bilayerine aktif olarak entegre olup, güçlü endosomoliz ile sonuçlanır. Bu nedenle, siRNA PEG-DB ile anatomik olarak şarj edilmiş ve hücre içi pH 'da son derece kararlı olan sı-NPs ' l e, ancak Asidik pH 'da lipid bilayerleri bozarak, siRNA yükü sitomik teslim edilmesini sağlayarak karmaşıklık oluşturmaktadır.
Burada, PEG-DB ' e si-NPs üretmek için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Fizikokimyasal parametreler ve si-NPS biyoaktivite karakterize yöntemleri sunulmuştur ve tartışılır. Si-NP biyoaktivitesini hızla değerlendirmek için, Lusiferaz, sahte çalışmalar için model geni olarak kullanılır. Firefly luciferase, ateşböcekleri27' in ' Glow ' sorumlu proteindir. Buna göre, Firefly Lusiferaz geni ile nakledilmiş olan memelinin hücreleri, Lusiferaz ifadesinin seviyelerini ölçmek için bir Luminometre kullanılarak yakalanabilir bir Bioluminesans ' Glow ' üretir. Burada, biz luciferase karşı siRNA teslim ve luciferase içinde biyolüminesans karşılık gelen azalma ölçülmesi ile sı-NPS biyoaktivite değerlendirmek için Lucia kullanın
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sı-NPs ' i k i hazırlama ve karakterizasyon
- si-NP hazırlama
- 10 mM sitrik asit tamponunun (pH 4,0) 3,33 mg/mL 'de polimer çözülür. Polimer önce çözünür sağlamak için etanol içinde 10X konsantrasyonu çözülebilir.
Not: Polimer düşük konsantrasyonlarda çözünebilir, ancak 3,33 mg/mL yukarıda konsantrasyonlarda kullanmak homojen NP oluşumunu engelleyebilir. - SiRNA (50 μM içinde diH2O) Ekle N+:P- oranı 10. Polimer ve siRNA çözümlerini pipetleme ile iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca inküye edelim. N+:P- oran, siRNA 'daki negatif şarj edilmiş fosfat gruplarının sayısına polimerde pozitif şarj edilen Amin gruplarının sayısını temsil eder ve aşağıdaki formülle hesaplanır:
nerede, Mol pol polimer molar miktarıdır, RU Amin polimer başına pozitif-şarj aminlerin yinelenen birimleri sayısıdır, Mol siRNA siRNA molar miktarı, ve BP siRNA siRNA molekül başına baz çiftleri sayısıdır. - 5 kat fazla 10 mM fosfat tampon (pH 8,0) ekleyin ve pipetleme veya tüpün tersine çevirme ile hafifçe karıştırın. Son pH 'nin nötr olduğunu onaylamak için (~ 7.2-7.5), pH test şeritlerine 10 μL si-NP çözeltisi pipet.
Not: sitrik asit ve fosfat tamponları Millipore Sigma arabellek referans merkezi grafiklerine göre hazırlanır.
- 10 mM sitrik asit tamponunun (pH 4,0) 3,33 mg/mL 'de polimer çözülür. Polimer önce çözünür sağlamak için etanol içinde 10X konsantrasyonu çözülebilir.
- Sı-NPs ' i k i fizikokimyasal karakterizasyonu
- Dinamik ışık saçılma (DLS) kullanarak elde edilen sı-NPs boyutu ve yüzey şarj kaydedin. 1 mL si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) ile 0,45 μm gözenek boyutunda şırınga filtreleri ile kare kuvars veya polistiren küvetine filtre uygulayarak bir DLS örneği hazırlayın. Üreticinin özelliklerine göre bir DLS aleti kullanarak kayıt boyutu ve yüzey şarj ölçümleri.
- Şanzıman elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak görüntüleme analizine göre si-NPs ' i k i boyutunu ve morfolojisini onaylayın.
- 1 mg/mL 'de TEM ızgaralarına 5 μL si-NP solüsyonu ekleyin ve 60 s için inküye yapın. 3 s için kuru Blot.
- 5 μL% 3 uranyl asetat çözeltisi ekleyin ve 20 s için inküye. 3 s için kuru Blot. kurutma altında bir gecede kuru ızgaralar.
- Kullanılacak belirli mikroskop için kurulan protokole göre görüntü ızgaraları.
- Çeşitli N+:P- oranlar agaroz jel retardasyon kullanarak si-NPS siRNA yüklenmesini karakterize.
- % 2 agaroz jel üretmek için, pH 8,0 'de 100 ml 1x Tae (Tris-asetat-EDTA) tampona 2 g Elektroforez sınıfı agaroz tozu ekleyin. Agarose askıya karıştırmak. Tüm agaroz çözülene kadar mikrodalgada ortaya çıkan ısı (1-3 dk).
- Bir kez soğutulmuş, ekleyin 5 μL etidium bromür (10 mg/mL H2O), ve karıştırın iyi. Bir jel tepsisine agaroz dökün ve kuyular üretmek için yere tarak, 30 dakika kuru izin. yükleme kuyularını geride bırakmak için tarağı dikkatle kaldırın ve jel tepsisini 1x Tae tampon ile maksimum dolgu çizgisine doldurun.
- Oluşturmak sı-NPs (yukarıdaki yordamına göre) 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20 ve 40 N+:P- oranlar. Her si-NP formülasyonu için parafin filmi üzerine 2 μL plakaya yükleme boya (SDS ve azaltma ajanları) yerleştirin. Pipet ile parafin filmi üzerine yükleme boya ile 10 μL si-NP çözeltisi karıştırın.
- Agaroz jel kuyularına si-NP/Loading boya çözeltileri ekleyin. 35 dk (veya numune jel uzunluğu% 80 geçinceye kadar) için 100 V at gerilim kaynağı çalıştırın.
- Üreticinin özelliklerine göre bir UV transaydınlatıcı üzerinde siRNA bantları görselleştirin.
- Şanzıman elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak görüntüleme analizine göre si-NPs ' i k i boyutunu ve morfolojisini onaylayın.
2. sı-NPS ' i k i vitro biyoaktivite belirlenmesi
- Model gen lusiferaz bir knockdown
- Lusiferaz si-NPS oluşturmak (yukarıdaki prosedüre göre) Lusiferaz siRNA kullanarak ve şifreli si-NPS bir denetim olarak şifreli siRNA dizisi kullanarak. Hem si-NPS aynı son N+:P- oran ve agaroz jel gerilme çalışmaları ile tanımlanan optimum oranda formualte. Örnek siRNA dizileri malzeme tablosundayer alır.
- Tohum luciferase-ifade hücreleri [MDA-MB-231/luciferase (BSD) istikrarlı hücreler] 96-iyi siyah duvarlı plakalar iyi başına 2.000 hücrelerin bir yoğunlukta. Bir kuluçko (37 °C,% 5 CO2, 95% nem) tam medya (dmem, 10% FBS) gecede uymasına izin verin.
- Son hacmi 100 μL ve 100 nM siRNA konsantrasyonu için tam serum medyası içine seyreltici si-NPs. Hücreleri 24 saat si-NPs ile tedavi edin.
- 24 saat sonra, 150 μg/mL D-Luciferin içeren tam serum medyası ile tedavileri kaldırın ve medyayı değiştirin. Üreticinin özelliklerine göre bir plaka okuyucusunda veya in vivo optik görüntüleme sisteminde Luminesans ölçümü yapmadan önce hücreleri 5 dakika boyunca inküat.
- Luciferin-içeren medyayı taze, tam serum medyası ile değiştirin ve 24 saat daha fazla inküye yapın. Yukarıdaki adımı tekrarlayın, medyayı kaldırarak ve 150 μg/mL D-Luciferin içeren tam serum medyası ile değiştirin ve ardından 48 h timepoint 'te Luminesans ölçümü yapmadan önce 5 dakika kuluçk edin.
- Uzunlamasına çalışmalar için, Luminesans ölçümü sırasında hücreleri steril koşullarda koruyun. Luciferin içeren değiştirildikten sonra ölçümler arasında taze, tam medyada kültüre devam edin.
Not: uygun siRNA konsantrasyonu farklı si-NPs ve siRNA molekülleri ile farklılık gösterecektir. Endosomolitik çekirdek (örneğin, Peg-DB) ile nötr olarak şarj edilmiş polyplexes kullanırken, 100 Nm genellikle hücreler tarafından iyi tolere edilir ve >% 75 Lusiferaz sahte üretir. PEG-DB ' e 10 N+:P- oran ve 100 Nm siRNA tedavilerinin kütle oranı (26 BP siRNA varsayılarak) 23,3, i.e., her 1,0 NG için Peg-DB 23,3 ng eklemek siRNA. Örneğin, 1,16 μL eklemek 3,33 mg/mL polimer için 166,5 NG siRNA bir iyi tedavi etmek için 100 nM bir 96-kuyu plaka (iyi başına 100 mL medya hacmi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İn vivo siRNA teslimat için etkili si-NPS bazı temel özellikleri uygun boyutta (~ 20 – 200 Nm çapı), siRNA paketleme ve gen susturma biyoaktivite vardır. Bu kapsamlı bir liste olmadığında (tartışmada belirtildiği gibi), bu temel özelliklerin bir formülasyonun daha fazla test edilmesini dikkate almadan önce onaylanması gerekir.
Şekil 2 formülasyon üzerine sı-NP boyutu ve yüzey şarj karakterize gösterilmektedir. DLS ve TEM, si-NP boyutunun (her ikisi), polydispersity (DLS) ve Morfoloji (TEM) gözlemlemek için tamamlayıcı yöntemler olarak kullanılır. DLS ölçümleri, si-NP 1 ' in Ortalama çapı 35 Nm, tek bir zirve varlığı ile gösterilen unimodal dağıtım ve nispeten dar bir tepe genişliğine göre düşük polidağılma olduğunu gösterir (Şekil 2a). TEM ölçümleri, DLS 'den boyut ölçümünü onaylıyor, si-NPs ' i k i Tekdüzen bir nüfusun varlığını önermektedir ve si-NPs ' i k i (Şekil 2C) küresel morfolojisini ortaya çıkarır. Si-NP 2 ' nin DLS ve TEM ölçümleri, ortalama çapı 1.500 Nm, Multimodal ve polydisperse nüfus ve çözelti toplamları, hiçbir farklı parçacık morfoloji oluşturan istenmeyen boyutu (> 200 Nm çapı) olduğunu ortaya (Şekil 2B, D ). Hem sı-NPs 1 hem de 2, sıfır ortalama Zeta potansiyel değerleri (Şekil 2E) ile gösterilen nötr yüzey şarj göstergesi.
SiRNA 'nın sı-NPS ' d e verimliliği yükleme, agaroz jel retardasyon tahlili kullanılarak karakterize edilir. Un-complexed siRNA agaroz jel ile göç eder ve (etidium bromür bağlanması nedeniyle) jel altta görüntülenir. SiRNA, si-NPS formuna polimer ile kompleks olduğunda, agaroz jel üzerinden göç engeller ve siRNA, jel üst kısmında (ya da kuyuya yüklendiği yerde) görselleştirilecektir. PEG-DB tabanlı sı-NPs için, ~ 10-20 N+:P oranı (Şekil 3) ' de tam kompleks elde edilinceye kadar N+:P oranlarının artması ile kompleks artar.
Luciferase, si-NP geni sililme bioactivity hızlı değerlendirilmesi için bir model geni olarak kullanılır. Bir plaka okuyucu veya in vivo optik görüntüleme sistemi ile Bioluminescence ölçümleri, iyi plaka formatında Lusiferaz protein ifadesinin hızlı, yüksek verim miktarını sağlar. Bu teknik, PCR (gen ifadesi) ve Batı leke (protein ifadesi) gibi geleneksel moleküler analizlerle gen susturulması analizinden çok daha hızlı, daha ucuz ve daha az külfetli. Bu yöntemle, Lusiferaz-ifade hücreleri Lusiferaz si-NPS ile tedavi edilir ve şifreli si-NPS (kontrol olarak) ve% Lusiferaz aktivite ışıma sinyali işlenmemiş hücrelere karşılaştırılarak hesaplanır. Bioactive Lusiferaz si-NPS, Şekil 4' te si-NP 1 için görülebilecek şekilde, doğrudan şifreli si-NP kontrolüne kıyasla% Lusiferaz aktivitesini önemli ölçüde azaltacaktır. Buna karşılık, Lusiferaz si-NPS (si-NP 2 gibi) şifreli si-NP kontrolüne kıyasla% Lusiferaz etkinliğini azaltmaz Bioaktif kabul edilmez (Şekil 4). Genellikle 48 h maksimum gen susturma zamanı (Şekil 4), ama biz zaman noktalarında 24 saat 240 h sonrası tedavi arasında değişen önemli gen susturulması gözlemledik.
Şekil 1. Polimer Kimya ve si-NP şematik. (A) si-NPS ve endows nötr yüzey şarj (Peg blok) ve pH duyarlı davranış (DB blok) oluşturur Peg-DB diblock kopolimer kimyasal bileşimi. (B) si-NPS ' i kendi kendine montajı. PH 4,0, DB bloğu su ile çözünür, çünkü DMAEMA üçüncül aminler son derece protonasyonlu. Pozitif şarj edilmiş DB bloğu elektrostatik kompleksler siRNA moleküllerini negatif olarak şarj etmiştir. PH daha sonra ~ 7,4 5x pH 8,0 fosfat tampon ilavesi ile ayarlanır, "hydrophobization" DB blok ve siRNA ve db içinde si-NPS çekirdek içinde sekestrasyon sonuçlanan. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2. Sı-NP boyutunda DLS ve TEM karakterizasyonu, yüzey şarjı ve morfoloji. (A, C) sı-NP 1 uygun boyutta bir Tekdüzen örnek temsil eder (~ 50-100 Nm çapı), oysa (B, D) si-NP 2 istenmeyen oluşur, büyük ve polydisperse agrega. (E) hem si-NPS, yakın nötr yüzey şarj (Zeta potansiyeli) görüntüler. Hata çubukları standart hatayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. Si-NP siRNA yükleme verimliliğini değerlendirmek için agarose jel retardasyon tahlil. Jel alt siRNA bantları ortadan kaybolma polimer siRNA karmaşıklığı gösterir. Polimer-kompleks siRNA jel üzerinden göç edemez ve böylece yükleme kuyuları yakın jel üst kısmında görselleştirildi. N+:P- oranı arttıkça, siRNA karmaşıklığı artar, jel alt siRNA bant azalmış yoğunluğu ile belirtildiği gibi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. Luciferase MDA-MB-231 hücrelerinde model gen luciferase si-NP-aracılı nakavt. Lusiferaz aktivitesi (A) 24 h ve (B) 48 h Post-Treatment ya şifreli si-NPS veya Lusiferaz si-NPS 10 N+:P- oran ve 100 Nm siRNA doz. % Luciferase aktivitesi, tedavi örneklerinin (şifreli ve luciferase) Luminesans sinyalini tedavi edilmeyen hücrelerin parlaklık sinyaliyle bölerek hesaplanır. Not: sı-NP 1, gen susturma biyoaktivite ile etkili bir formülasyon temsil eder, ancak sı-NP 2 gen susturma biyoaktivite olmadan bir formülasyonu temsil eder. (*) belirli bir zaman noktasında formülasyon için şifreli gruba kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir fark (p < 0,05) gösterir. Hata çubukları standart hatayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan si-NPs, anjiyonik siRNA ve katyonik polimerlerin elektrostatik Birliği ile polyion kompleksine (polyplexes) oluşur. SiRNA 'nın elektrostatik karışımı ve Peg-DB polimerlerin katyonik DB bloğu düşük pH (4,0) ile karıştırılarak kolaylaştırılır. PH 4,0, DMAEMA son derece protonated, ve dolayısıyla DB bloğu yüksek oranda şarj edilir. Bu, polimerlerin, miselleri şekillendirme ve siRNA ile verimli bir şekilde DB kompleksler yerine çözümde unimers olarak çözülmesini sağlar. Daha sonra, çözelti pH 'sı nötr olarak ayarlanır (pH 7,4), neden ' hydrophobization ' DB bloğu, misel oluşumu, ve ortaya çıkan polyplexes çekirdeği içinde kompleks siRNA sıkışması. Bu polyplexes, PEG 'in DB/siRNA çekirdeğinin etrafında hidrofilik, inert bir kabuk oluşturur ve sistemik yönetim için gerekli olan nötr yüzey şarj sonucu tasarlanmıştır. Polimer Kimya ve Polyplex oluşum süreci Şekil 1' de özetlenmiştir.
Sı-NPs ' i k i titiz fizikokimyasal karakterizasyonu, formülasyonların biyolojik teste taşınması için uygun olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Boyut, yüzey şarj ve parçacık şekli/morfoloji biyolojik performansı etkileyebilecek tüm önemli parametrelerdir. Tümörlere sistemik teslimat için, si-NP büyüklüğü 20 – 200 Nm çapı22arasında düşmelidir ve en son çalışmalar 20 – 50 nm çap parçacıklarının ideal23olduğunu göstermektedir. Yüzey şarj protein adsorpsiyon ve opsonizasyonla en aza indirmek için nötr veya biraz negatif olmalıdır28. Çalışmalar parçacık şekli ve farmakokinetik/parçacık boşluğu arasındaki bağlantıyı araştırdı, yüksek en boy oranı ile parçacıklar teklif küresel parçacıklar üzerinde arzu edilir29,30,31. Ancak, bugüne kadar küresel parçacıklar hala en sık istihdam edilir, ve bizim bilgi için, Onkoloji insan çalışmalarına tercüme edilmiş tek parçacık şekli vardır.
Burada sunulan si-NPs gibi polyplexes, uniform ve tutarlı oluşumunun, bir dizi fizikokimyasal parametreye bağlı olduğunu dikkate almak önemlidir. Biz ampirik bu Polyplex konsantrasyonu, çözeltinin pH ve siRNA (N+:P- oran) polimer oranı tüm büyük ölçüde etkisi Polyplex oluşumu bulduk. Bizim elimizde, siRNA konsantrasyonu Polyplex oluşumunda büyük bir etkiye sahip değildir, ancak 3,33 mg/mL aşan polimer konsantrasyonları kullanarak büyük agregalar ve tutarsız Polyplex boyutlarının oluşmasına neden olur. Bu si-NPs pH duyarlı olduğu gibi, son pH si-NP çözümleri çok asidik olduğunda çeşitli sorunlar ortaya çıkabilir (< pH 7,2). Bu komplikasyonları önlemek için iki yol, saf diH2O polimerlerin lyophilize etmektir böylece çözünme üzerine tampon bileşimi değiştirmek ve zaman Içinde arabellek pH "sürüklenen" önlemek için sık olarak arabellekleri yeniden yapmak için hiçbir tuzları vardır. Dikkatli olmak için, arabellek pH si-NPs yapmadan önce her zaman teyit edilmelidir, ve si-NP çözümleri son pH her zaman doğrulanmalıdır. Son olarak, N+:P- si-NPS oranı siRNA verimlilik ve Polyplex fizikokimyasal parametreler yükleme etkiler. Genellikle ideal bir var N+:P- oran tüm siRNA yüklenir ama miselleri ayrı nüfus formları ve sitotoksisite artar un-kompleks polimer bir aşırı bolluk değildir. Burada sunulan sı-NPs için, N+:P- 10-20, optimum tutarlılık ve performansın gözlemlendiği aralığıdır.
Luciferase muhabiri hücre hatları si-NP bioactivity hızlı ve yüksek verimlilik analizi için burada kullanılır. Luciferase muhabiri hücre hatları, biyolojik aktivite analizine başlamadan önce oluşturulan veya satın alınmalıdır, böylece zaman ve masraf içinde ilk yatırım gerektirir. Ancak, gen susturulması değerlendirmek için Lusiferaz muhabiri hücrelerin kullanımı daha hızlı, yüksek verimlilik analizi için daha fazla ve daha ucuz zaman içinde RT-PCR (mRNA ifade ölçmek için) veya Batı lekesi (protein ifade ölçmek için) gerçekleştirme daha. Örneğin, bu tahlil içinde ışıkesans ölçümü genellikle RT-PCR veya Batı blots gerçekleştirmek için gerekli tüm gün veya çok günlük süreçler aksine sadece birkaç dakika sürer. Dahası, ışıldama ölçümleri, birçok numunenin eşzamanlı olarak ölçülmesine izin veren iyi plaklarda yapılabilir (96-kuyu plakalarının yazarlar tarafından kullanıldığı). Son olarak, D-Luciferin yukarıda ve tipik hücre kültürü reaktifler ötesinde gereken tek reaktif olduğunu, RT-PCR veya Batı Blot daha yöntem çok daha uygun hale. Ancak, Lusiferaz muhabiri hücre tahlil sadece model gen lusiferaz gen susturma değerlendirilmesi için sınırlı olduğunu unutulmamalıdır ve faiz diğer "terapötik genler" sel susturulması ölçmek için kullanılamaz. Böylece, yazarlar RT-PCR ve/veya Batı leke ilgi terapötik genler gen susturma değerlendirmek için kullanılan birkaç çalışmada okuyucular bakın24,32,33,34.
Bioactivity ek olarak, araştırmacılar ideal si-NP performansını karakterize etmek için in vitro biyolojik testlerin kapsamlı bir gamı dikkate almalısınız. Yukarıda açıklanan Lusiferaz tahlil Ayrıca işlenmiş hücrelere şifreli si-NP işlenmiş hücrelerin Luminesans sinyali karşılaştırarak hücre canlılığı değerlendirmek için kullanılabilir. SiRNA olmayan bir hedefleme sırası olduğundan, lüminesans herhangi bir değişiklik si-NPS hücre viability üzerinde spesifik olmayan etkisi atfedilebilir ve bu etkisi genellikle Polimer Kimya ve molar miktarına bağlıdır. Akış sitometri ve Floresan Mikroskobu teknikleri, floresan etiketli siRNAs, polimerler veya her ikisini kullanarak sı-NPs hücre alımı değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, kök-döngü PCR ve Argonaut 2 immünopresipitasyon gibi moleküler teknikler, hücre içi siRNA seviyelerini kesin olarak ölçmek için kullanılabilir. SiRNA sadece biyo-aktif olduğu için, burada RıSC 'ye yüklenir, si-NPs hücre tarafından bir kez setratalize siRNA endosomal kaçış tetiklemek gerekir. Deneysel ölçmek için kullanılan assays endosomal kaçış kırmızı kan hücresi hemoliz assay içerir (hakkında ayrıntılı olarak açıklanan Evans ve al.35), floresan etiketli sı-NP kargo ve LysoTracker36colocalization, ve en son, galektin 8 ' in yarılmış endosomal veziküller37,38. Veri toplama ve hücre viability, hücre alımı, endosomal kaçış ve biyoaktivite için in vitro deneylerden sonuçları sentezleme yorumlarını çizmek ve mekanik korumak bilgi araştırmacının tamamlayıcı parçaları sağlamak hakkında Insight si-NP (in) etkinliği.
Toplamı olarak, nanopartiküller verimli siRNA teslim yeteneğine sahip hastalık tedavisinde muazzam bir potansiyele sahip. Örneğin, Onkoloji, kansere ilerlemesine neden olan birçok gen, tedaviye direnç, ve metasrik geleneksel Farmakoloji tarafından ' uyuşturucu kullanılamaz ' ama siRNA kullanılarak tedavi edilebilir. Ancak, hastalığın hayvan modellerinde kullanımı için önkoşul, siRNA nanomedicinler (burada sı-NPs olarak anılacaktır) hem güvenlik hem de etkinliğini sağlamak için geniş fizikokimyasal ve biyolojik karakterizasyon gerektirir. Bu amaçla, in vitro si-NPS ' i üretmek ve karakterize etmek için, si-NPs ' i k, hayvan çalışmalarına ileriye taşımak için uygunluk açısından değerlendirilebilir Yöntemler burada açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ilgi hiçbir potansiyel çatışmalar ifşa.
Acknowledgments
Yazarlar bu araştırma yürütmek için veri ve laboratuar kaynaklarına erişim için DRS. Craig Duvall ve Rebecca Cook minnettar. Yazarlar, DLS ve TEM (NSF EPS 1004083) enstrümanlarına erişim için nano ölçekli bilim ve mühendislik (VıMSE) için Vanderbilt Enstitüsü 'ne minnettar olurlar. Yazarlar lisansüstü araştırma bursu programı (NSF # 1445197) desteklemek için Ulusal Bilim Vakfı minnettar. Yazarlar mali destek için Ulusal Sağlık Enstitüleri minnettar (NıH R01 EB019409). Yazarlar mali destek (DOD CDMRP OR130302) için savunma Kongre yönetmen tıbbi araştırma programı için minnettar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
