Summary
この記事の目的は、メタボロミクス分析のために培養した付着細胞からの水性代謝産物の抽出のためのプロトコルを記述することであり、特に、毛細管電気泳動-質量分光法。
Abstract
メタボロミクス分析は、正常細胞と比較してがん細胞の特定の代謝調節を理解するだけでなく、早期癌の発見や化学療法の反応予測のためのバイオマーカーの同定にも有望なオミクスアプローチです。癌患者メタボロミクス分析のための均一サンプルの準備は解決されるべき重大な問題である。ここでは、毛細血管電気泳動質量分析 (CE-MS) を用いたメタボロミクス解析のために、培養した付着細胞からの水性代謝物を抽出するための簡単で信頼性の高いプロトコルを紹介します。培養細胞からの水性代謝産物は、細胞の培養および洗浄、メタノールによる細胞の処理、代謝物の抽出、および CE MS 分析のためのスピンカラムを用いたタンパク質および高分子の除去によって分析されます。ビステアリルエチレンジアミドで処理された肺癌細胞株を用いた代表的な結果は、酸化的試薬であり、酸化ストレス下の細胞の明確に観察可能な代謝シフトを示す。この記事は、メタボロミクス研究に携わる学生や研究者にとって、CE MS による分析のために細胞株から代謝物を採取することが初めての場合に特に有益です。
Introduction
オットー・ウォーバーグは、癌細胞がグルコースを取り、十分な酸素の存在下で乳酸を産生するために発酵する異常な能力を獲得することを観察した—ウォーバーグ効果または好気性解糖体1,2として呼ばれる現象。ミトコンドリア呼吸欠損は、癌細胞3における好気性解糖系の基礎として推測されている。実際、ウォーバーグ効果は、臨床実践4,5で広く使用されている fluorodeoxyglucose (FDG)-陽電子放射断層撮影 (PET) による腫瘍イメージングの基礎となっています。好気性解糖系の高い割合は癌の重要な特徴と考えられており、Hanahan やワインバーグ6で説明されているように、最近ではよく知られている「がんの特徴」の一つとして採用しています。癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における体性変異— HRAS/KRAS/NRAS、 EGFR、 BRAF、 MYC、 TP53、isocitrate 脱水素酵素 (IDH)、およびフマル酸プロホルモンコンバターゼ (FH) —癌細胞における特定の代謝変化にリンクされており、ウォーバーグ効果7の結果であると考えられる。
メタボロミクス分析は、がん細胞における代謝調節を理解するだけでなく、早期のがんバイオマーカーや化学療法の反応予測を明らかにするための有望なアプローチでもあります。抗癌化合物を有する感受性または抵抗性の癌細胞の治療に続いて、それらの代謝応答の追跡は、癌患者における特定の抗癌治療の有効性を予測する代謝バイオマーカーの同定を容易にする8 、9、10、11。この記事では、ビステアリルエチレンジアミドで処理されたEGFR突然変異を伴う肺腺癌 (酸化ストレスを引き起こす) に由来する癌細胞株をメタボロミクス分析のためのモデルとして使用した。キャピラリー電気泳動質量分析 (CE-MS) を使用したこの分析方法の利点は、質量範囲m/z 50-100012,13で荷電代謝物を包括的に測定できることです。この記事の目的は、初心者のために、培養癌細胞およびその後のメタボロミクス分析、特に CE MS による水性代謝産物の調製のための詳細なステップワイズ視覚プロトコルを提供することである。
Protocol
1. 細胞培養1日目
注: 代謝物抽出の各サンプルは、適度ではあるが完全にコンフルエントではない単一の 100 mm 組織培養皿から調製する必要があります (約2〜500万個の細胞を含む)。アッセイに必要な皿の数を計算し、それに応じて準備します。
- 培養 HCC827 および PC-9 細胞を37° cで 5% の培地にて、10% ウシ胎児血清 (FBS) を添加した RPMI-1640 中。
- 100 mm 培養皿から細胞培養培地を吸引する。
- カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液2ml を使用して、各皿の細胞を洗浄します。PBS 溶液が皿の表面を完全に覆うように、優しく各皿をロックします。
- 培養皿から洗浄緩衝液を吸引除去する。
- 0.25% トリプシン-EDTA 溶液を37° c に加温し、5 mL 血清学的ピペットを使用して 2 mL のトリプシン EDTA 溶液を加えます。トリプシンが皿の表面を完全に覆うように、それぞれの皿を静かに揺らします。
- 37° c で約5分間培養皿をインキュベートします。
- 1皿あたり 4 mL の予温めた完全な成長培地を加えます。セルを再懸濁にそっとピペットで押し込みます。
- 各細胞懸濁液を別個の 15 mL 円錐管に移し、800× gで5分間遠心分離する。
- 再懸濁は、各細胞ペレットを 2 mL の予加温された完全な増殖培地中に収めた。
- 自動セルカウンタおよび 0.4% トリパンブルーソリューションを使用して、セルの合計数と実行率を決定します。
- 10μ l の細胞懸濁液と10μ l の 0.4% トリパンブルー溶液を混合します。
- 毛管作用によって細胞数える部屋のスライドにサンプルの10のμ l を荷を積む。
- チャンバースライドを自動セルカウンタに挿入します。透過光が自動的に点灯し、機器がセルに焦点を合わせます。
- キャプチャボタンを押して画像をキャプチャし、結果を表示します。
- 必要に応じて、さらに成長培地を加えて、所望の細胞濃度を得る。
- 種子は100ミリメートル細胞培養皿あたり約1〜250万細胞である。
注: CE 分析によって決定される代謝産物濃度は、生存細胞数に基づいて正規化されます。細胞計数を目的として、各群について少なくとも1種の余分な播種培養皿を調製することが必要である。 - 5% CO2 で37° c で培養皿を18時間インキュベートします。
2. 試薬の調製
- 超純水で L-メチオニンスルホンおよびd-樟脳-10-スルホン酸1000を含む商業内部標準液を希釈します。
注:80 サンプル未満の場合は、内部標準溶液1と 45 mL の超純水を 50 mL のメスフラスコに50混合し、その後、最大で 50 mL の超純水で溶液を使用してください。 - 洗浄緩衝液として超純水に 0.05 g/mL マンニトール溶液を調製します。
注: サンプル数が30未満の場合は、500ミリリットルの超純水で 25 g のマンニトールを単に溶解します。100 mm 培養皿あたり約 15 mL の洗浄緩衝液が必要となりますので、サンプル数に応じて十分な量の洗浄バッファーを用意してください。
3. 予洗浄用遠心フィルターユニット
- 各遠心フィルターユニットのフィルターカップに250μ l の超純水をピペットで入れます (材料の表を参照してください)。
注: サンプルごとに2つのフィルタユニットが必要です。 - フィルターユニットをしっかりとキャップし、4° c で9100× gで5分間遠心分離してください。
- 各濾液の量を確認してください—重要な濾液が最初の短いスピンの間に蓄積された場合、フィルタユニットは欠陥であり得る。この場合、フィルタユニットを破棄し、代わりに新しいフィルタユニットを使用してください。
- フィルターユニットの蓋をしっかり閉め、4° c で9100× gで30分間遠心分離してください。
- どのフィルターカップにも超純水が残っていないことを確認してください。各回収管にある超純水をピペットで取り出し、廃棄します。
注: フィルタを損傷する可能性があるため、ピペットでフィルターカップ内の残留水を除去しないでください。 - フィルターカップを回収チューブに交換してください。
注: フィルターが乾燥時に損傷する可能性があるため、1時間以内に遠心フィルターユニットを使用してください。
4. 2 日目の細胞培養
-
インキュベーターから 100 mm の培養皿を取り出します。
注: 推奨される細胞培養持続時間は18時間です。 - 各 100 mm 培養皿から細胞培養培地を吸引する。
- 各ディッシュに化合物または薬剤の適切な濃度を含む 10 mL の細胞培養培地を加え、細胞層を乱さないように注意する。
注: 実証目的で、この実験では PBS に溶解した 250 mM ビステアリルエチレンジアミド (最終濃度250μ m) を10μ l 添加しました。 - ビステアリルエチレンジアミドまたは PBS のコントロールとして、37° c で30分間培養皿をインキュベートします。
- 各 100 mm 培養皿から細胞培養培地を吸引する。
- 各皿の縁に 5% のマンニトール溶液 2 mL をそっと加えて、細胞層を乱さないように注意し、その後、皿をわずかに傾けることによって細胞を洗浄する。
注: PBS または食塩水溶液は、CE MS ベースのメタボロミクス分析に干渉し、測定結果に悪影響を及ぼすため、洗浄緩衝剤として使用しないでください。 - 各培養皿から洗浄緩衝液を吸引し、皿1本あたり 10 mL の洗浄緩衝液を加えて軽く傾けることによって再び細胞を洗浄する。
- 各培養皿の端から洗浄緩衝液を完全に吸引する。
注: 細胞を吸引しないことに注意を払いながら、できるだけ多くの洗浄バッファーとして吸引します。残留マンニトールは、CE-MS 分析を妨げる可能性があります。細胞の吸引は、セルの数を減少させ、したがって、データの正規化におけるエラーの原因となります。
5. 培養細胞からの代謝物の抽出
- 培養皿1本当たり800μ l の 99.7% メタノールを添加する。各文化料理を前後に優しく揺らし、表面全体を覆います。皿は30秒間室温で残しておきなさい。
- ピペットの先端をメタノールに浸し、数回ゆっくりと上下にピペッティングすることにより、皿あたりの希釈された内部標準溶液の550μ l をゆっくりと加えます。
- 各文化料理を前後に優しく揺らし、表面全体を覆います。
- 皿は30秒間室温で残しておきなさい。
6. 細胞抽出物の限外濾過
- 抽出した溶液を各培養皿から別の 1.5 mL マイクロ遠心チューブに移す。
- 4° c で2300× gで5分間チューブを遠心します。
- 各上清の350μ l をサンプルあたり2つの遠心フィルターユニットに移す。
注: 各培養皿から、抽出された溶液の合計700μ l を2つのフィルターチューブ (350 μ l/チューブ) に移した。 - フィルター・カップに液体が残っていない状態になるまで、約2時間、4° c で9100× gでフィルターチューブを遠心します。
- フィルターカップを取り外し、回収チューブの蓋をしっかりと閉めます。
7. 試料の蒸発
- 遠心蒸発器を準備する-通常、これは、蒸発器、コールドトラップ、および真空ポンプで構成されています。
- 回収チューブを遠心蒸発器に入れます。
注: チューブの蓋は開いたままにしておきます。 - 室温で真空条件下で抽出したサンプル溶液を蒸発させる。
注: 回転および圧力の数の典型的な構成はそれぞれ 1500 rpm および 1000 Pa であり、通常サンプルを完全に蒸発させるためにおよそ 3 h かかります。 - 収集チューブのいずれにも液体が残っていないことを確認し、チューブの蓋をしっかり閉めます。
- 収集チューブは、メタボロミクス分析まで超低温 (−80° c) の深い冷凍庫に保管してください。
8. メタボロミクス分析 (CE MS)
- 再懸濁分析直前の超純水50μ l の濾液を測定した。
- アイソクラティックポンプ、ce-ms アダプタ、および ce-ESI 噴霧器を搭載した毛細血管電気泳動システムと飛行時間の質量分析計システムを使用して、前述の12,13に記載された方法によって CE-ms 分析を実行します。
注: 両方のシステムは、システムベンダーのソフトウェアによって制御することができ、溶融シリカ毛細管 (50 μ m 内径× 80 cm の全長) によって接続されています。- 装置およびサンプルバイアルをセットアップし、毛管カセットで毛細管を準備し、アニオンまたは陽イオン分析モードに応じてシース液と適切な電気泳動バッファーを補充してから、電圧を印加します。
注: 計測および解析条件については、他の12,13で詳しく説明します。 - ソフトウェアを開き、データ取得方法とサンプル情報を含むワークリストを準備します。
- テスト実行を開始し、信号強度、内部標準のピーク形状、その他の標準化合物のピーク分解能などのデータを確認します。
- 必要に応じて解析条件を微調整します。
- 3 s 用に 50 mbar、30 kV の電圧でサンプル溶液を注入します。
注: CE-MS は、正または負のイオンモードのいずれかで行われました。質量範囲m/z 50-1000 をスキャンするように分光器を設定します。毛管電圧は4つの kV で置かれた;窒素ガスの流量 (ヒータ温度300° c)。ポジティブモードの場合、fragmentor、スキマーおよび OCT RFV 電圧は、それぞれ75、50および 125 V に設定されました。マイナスイオンモードでは、fragmentor、スキマー、OCT RFV の電圧をそれぞれ100、50、200 V に設定しました。
- 装置およびサンプルバイアルをセットアップし、毛管カセットで毛細管を準備し、アニオンまたは陽イオン分析モードに応じてシース液と適切な電気泳動バッファーを補充してから、電圧を印加します。
- スペクトラムデータを分析する。
- 自動統合ソフトウェアを使用して質量スペクトルデータからピークを抽出し、 m/z、ピーク領域、および移行時間 (MT) などのピーク情報を取得します。
注: この方法については、他の14で詳しく説明します。 - Isotopomers、付加物イオン、および公知の代謝産物の他の生成物イオンに対応するシグナルピークを除外する。
- M/z値および MTs に従って、HMT 代謝物データベースからの情報で残りのピークに注釈を付けます。
- 注釈付きピークの領域を、内部標準レベルとサンプルあたりのセル数に正規化します。
- 各代謝産物について調製した標準曲線を用いて培養細胞 (pmol/106 細胞) 中の各代謝産物の濃度を評価する。
- その後の統計的分析および生物学的解釈のために定量化された代謝物濃度を使用する14.
- 自動統合ソフトウェアを使用して質量スペクトルデータからピークを抽出し、 m/z、ピーク領域、および移行時間 (MT) などのピーク情報を取得します。
Representative Results
癌細胞 (pmol/106 細胞) における代謝産物濃度は生存細胞数に対して正規化されているので、実験条件は、条件間の生存細胞数の変動を最小限に抑えるように注意して設定すべきである。例えば、ビステアリルエチレンジアミド処理は、比較的高濃度 (250 μ m) であったが、短時間で全ての細胞ができるだけ等しく成長することを可能にするために、分析された生存細胞の数を等しくする。これらの実験条件下では、HCC827 および PC-9 細胞は3時間均等に成長した (図 1)。PBS 処理 (対照) 細胞と比較してビステアリルエチレンジアミド処理された細胞の CE-MS 分析は、HCC827 および PC-9 細胞においてそれぞれ175および150の差動代謝物を明らかにした。これらの中で、ペントースリン酸経路 (PPP) のいくつかの中間体および上部解糖系は両方の細胞株においてビステアリルエチレンジアミド処理状態において有意に高かったが、一方、少数のトリカルボン酸 (TCA) サイクル中間体は、治療条件 (図 2および図 3)。
この PPP は、還元性ニコチン酸ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩 (NADPH) の形態で還元当量を生成し、これは、15のレドックスホメオスタシスの恒常性維持および脂肪酸生合成に使用される。ビステアリルエチレンジアミド治療後、グルコン酸のレベル-酸化されたグルコース-HCC827 細胞で12倍増加し、PC 9 細胞で10倍;同様に、ビステアリルエチレンジアミド治療に続いて、6-リン酸塩 (G6P は) のグルコースレベル (リン酸化グルコースおよび最初のヘキソキナーゼ-触媒解糖系製品) も、それぞれ HCC827 および PC-9 細胞において 6.3-および3.5 倍増加した (図 4)。さらに、ビステアリルエチレンジアミド治療後、phosphogluconate (6PG) のレベルは、PPP における最初の中間体であり、PBS コントロールに見られるレベルと比較して、HCC827 細胞では89倍、PC-9 細胞では231倍に増加した (図 4)。対照的に、果糖 6-リン酸塩 (F6P) およびフルクトース 1, 6-ビスホスフェート (F1, 6P) のような他の解糖系中間体のレベルは、ビステアリルエチレンジアミド実験条件において変化しなかった (図 4)。総ニコチン酸アミドアデニンニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NADP+) レベルは、ビステアリルエチレンジアミド処理と PBS 制御条件 (図 4) の間でほぼ同等であり、グルコースが PPP を介して主に異化したことが示唆された。
図 1.ビステアリルエチレンジアミド処理時に未変更のセル番号。250 μ m のビステアリルエチレンジアミドに対する細胞増殖応答をトリパンブルー染色法を用いて測定した。(A) HCC827 および (B) PC-9 細胞のうち PBS (青色) またはビステアリルエチレンジアミド (赤; 250 μ m) を1または 3 h で処理したセル番号が示されている。データは平均値± SD (n = 6) として表示されます。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.代謝産物の代表的な MS ピーク。Electropherograms は、(A) グルコン酸、(B) グルコース6−リン酸 (g6p は)、(C) 6 − Phosphogluconate (6PG)、及び (D) ニコチン酸アミドアデニンニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸 (NADP+) として注釈付けされた、CE − MS 分析によって得られる。各行は細胞株 (固体、HCC827、点線、PC-9) および治療 (青色、PBS、赤色、ビステアリルエチレンジアミド) を示している。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.細胞内代謝産物のメタボロームプロファイル(A) HCC827 および (B) ビステアリルエチレンジアミドで処理した PC-9 細胞における代謝産物の倍変化は、LOG2(ビステアリルエチレンジアミド/PBS) として示されている。合計で、175および150代謝産物は、それぞれ HCC827 および PC-9 細胞において注釈付けされた。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.ビステアリルエチレンジアミド処理時の PPP のアップレギュレーションビステアリルエチレンジアミドによる治療後の解糖系およびリン酸ペントース (PPP)に関与する主要代謝物質の細胞内濃度 (pmol/106 細胞) が示されている。代謝物は、PBS (blue) またはビステアリルエチレンジアミド (赤、250μ m) で処理された HCC827 および PC-9 細胞から30分間、グルコン酸、グルコース 6-リン酸 (g6p は)、フルクトース 6-リン酸 (F6P)、6などの代表的な代謝産物を抽出した。− phosphogluconate (6PG)、及びリン酸アミドアデニンニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NADP+) が示されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここでは、メタボロミクスをベースとした培養がん細胞から代謝物を調製するための、広くアクセス可能な方法論について述べる。このプロトコルの中で最も重要なポイントの1つは、測定された代謝物濃度が生存細胞数に対して正規化しているため、がん細胞を適切に調製することです。細胞数の正確な推定のためには、メタボロミクス分析のための代謝産物の抽出と並行して生存細胞数を数えるために実験群ごとに少なくとも1つの追加培養皿を調製する必要がある。さらに、同じ数の細胞は、反復のために、そして数えるための皿の各皿で播種されるべきです。将来的には、これは、同じ料理が生存細胞をカウントし、代謝物を抽出するために使用されることを可能にする迅速かつストレッサー (例えば、トリプシンフリーの) 細胞計数プロトコルによって助けられるであろう。細胞が食器の表面から剥離しないように、洗浄中は注意が必要です。重度の細胞毒性試験および細胞接着を減少させる他の実験は、洗浄手順の間の細胞の潜在的な損失によるこの抽出プロトコルには不適当であり得る。
PBS のような塩ベースのバッファーは、メタボロミクス分析を妨害し、測定に悪影響を及ぼすため、CE MS ベースのメタボロミクス分析のために培養細胞から代謝物を抽出するための洗浄バッファーとして、5% のマンニトール溶液を使用することが重要です。
2つまたは3つの皿は個々の皿からの代謝物をそれぞれ抽出し、次にサンプルをプールすることによって単一のサンプルとして結合することができる;しかし、複数の皿を組み合わせることは、抽出された代謝産物溶液中の残留マンニトールを増加させることが多い。これはまた、CE-MS によるメタボロミクス分析を妨げる可能性があります。したがって、単一のサンプルとして複数の料理や井戸を使用しないことをお勧めします。
このメタボロミクス分析法は、50 ~ 1000 Da の分子量を持つ荷電分子を包括的に測定するために開発されました。従って、この議定書は水様の、低分子量の混合物の抽出のために最大限に使用される。したがって、このプロトコールは、タンパク質および核酸のような脂質または高分子のような疎水性代謝産物の抽出には適さない。培養細胞試料の包括的脂質分析またはリピドミクスの要求が高まっていることから、親水性および疎水性代謝産物の同時抽出のための簡便で効果的なプロトコールの開発が必要とされている。
代謝物抽出の最初のステップ—培地の吸引と細胞をマンニトールで洗浄すること—細胞の代謝プロファイルへの変化を最小限に抑えるために、できるだけ早く行う必要があります。マンニトールによる洗浄後のメタノールによる細胞の治療は、タンパク質を変性させ、酵素がさらに代謝反応を触媒するのを防ぐことを前提としています。しかし、メタノール処理後でも、酸化還元反応、いくつかの脱カルボキシル化プロセス、チオール結合などの非酵素的化学反応が起こることがあります。このように、このプロトコルによって測定されたこれらの反応に関与する代謝物の任意の濃度は慎重に解釈する必要があります。このメタボロームは、ゲノムやトランスクリプトームとは対照的に、さまざまな化学的性質を持つ分子で構成されています。したがって、単一のプロトコルでは、損失や乱れなしにすべての代謝産物を抽出することはできません。このような反応性の高い代謝物をより正確に測定するためには、fractionations と derivatizations を必要とする特定の代謝産物群を抽出するように特別に設計されたプロトコルに相談する必要があります。ここで提示されるプロトコールは、CE − MS によるメタボロミクス分析のための培養細胞試料からの水性代謝産物の簡便かつ迅速な抽出を説明する。本稿では、現在の原稿の焦点が異なるので、CE を詳細に設定する方法については説明できませんでしたが、CE-MS をセットアップするための詳細な手順を説明するには、別の専用の記事が必要かもしれません。
Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
庄内地域産業振興センターの皆様のご協力に感謝いたします。この作品は、国立がん研究開発基金 (助成番号 28-9) による山形県と鶴岡市の研究資金によって部分的に支えられ、日本学術振興会 (科研費) によって助成17K07189」に HM。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
| Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
| CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
| CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
| CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
| Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
| Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
| Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
| Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
| Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
| Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
| D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
| Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
| Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
| Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
| HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
| Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
| Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
| Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
| Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
| Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
| PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
| Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ·cm pure water |
| Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |
References
- Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).
- Soga, T. Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming. Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and Cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Fukuda, H., et al. Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection. European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).
- Miles, K. A., Williams, R. E. Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism. Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes. Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).
- Makinoshima, H., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).
- Makinoshima, H., et al. Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).
- Makinoshima, H., et al. Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma. Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).
- Sato, Y., et al. Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1129 (2018).
- Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).
- Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Patra, K. C., Hay, N. The pentose phosphate pathway and cancer. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).
