Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

גולד ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות לגילוי משופר נוירוכימי

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59552

Summary

במחקר זה, אנו משנים פחמן סיבים מיקרואלקטרודות עם חלקיקי זהב כדי לשפר את הרגישות של זיהוי נוירוטרנסמיטר.

Abstract

במשך 30 שנים, סיבי פחמן מיקרואלקטרודות (CFMEs) כבר תקן זיהוי נוירוטרנסמיטר. בדרך כלל, סיבי פחמן מואבקים לתוך נימים זכוכית, משכה להתחדד, ולאחר מכן אטום באמצעות אפוקסי כדי ליצור חומרים אלקטרודה המשמשים לסריקה מהירה מחזורית בדיקות וולטממטריה. לשימוש CFMEs חשופים יש מספר מגבלות, למרות. בראש ובראשונה, סיבי הפחמן מכיל בעיקר פחמן המטוס בסיס, אשר יש שטח בשטח נמוך יחסית ותשואות רגישויות נמוכות יותר nanחומרים אחרים. יתר על כן, פחמן graphitic מוגבל על ידי הרזולוציה הטמפורלית שלה, ואת מוליכות נמוכה יחסית. לבסוף, נוירוכימיקלים וקרו ידועים לרעה על פני השטח של אלקטרודות פחמן שבו הם יוצרים חומרים פולימרים שאינם מוליך לחסום את הספיחה מוליך עצבי נוסף. עבור מחקר זה, אנו משנים CFMEs עם חלקיקי זהב כדי לשפר את בדיקות נוירוכימיות עם סריקת מחזורי וולטממטריה במהירות. Au3 + הופקד על פני השטח של cfmes או שהיה מצופה בחשמל מתוך תמיסה קולאידית. מכיוון שהזהב הוא מתכת יציבה ויחסית, הוא חומר האלקטרודה האידיאלי למדידות אנליטיות של נוירוכימיקלים. ננו-חלקיק זהב שונה (אונפ-CFMEs) היה יציבות לתגובת דופמין עבור מעל 4 שעות. יתר על כן, התערוכה של אונפ-CFMEs רגישות מוגברת (זרם חמצוני גבוה יותר של מחזורי הוולטמגרמות) וקינטיקה מהירה יותר של העברת אלקטרון (נמוך יותר ΔEP או הפרדת שיא) מאשר לא שונו בעבר cfmes. התפתחות האתר מספקת את הקמתה של חיישני האלקטרוכימי החדשניים לגילוי שינויים מהירים בריכוז הדופאמין ובחומרים נוירוכימיקלים אחרים במגבלות הנמוכות של גילוי. לעבודה זו יישומים נרחבים לשיפור המדידות הנוירוכימיות. הדור של הזהב ננו-חלקיק שונה CFMEs יהיה מאוד חשוב לפיתוח חיישני אלקטרודה הרומן לזהות נוירוטרנסמיטורים ב vivo מכרסמים ודגמים אחרים כדי ללמוד השפעות נוירוכימיות של שימוש בסמים, דיכאון, שבץ, איסכמיה, ומדינות התנהגותיות ומחלות אחרות.

Introduction

פחמן סיבים מיקרואלקטרודות (cfmes)1 משמשים הטובים ביותר כחיישנים ביולוגיים כדי לזהות את החמצון של מספר נוירוטרנסמיטורים קריטיים2, כולל דופמין3, נוראדרנלין4, סרוטונין5, אדנוזין6, היסטמין7, ואחרים8. תאימות וגודל של סיבי פחמן להפוך אותם אופטימלי עבור השרשה כמו יש נזק רקמות מוחלט לעומת אלקטרודות סטנדרטיות גדול יותר. 9 cfmes ידועים בעלי תכונות אלקטרוכימיות שימושיות והם מסוגלים לבצע מדידות מהירה בעת שימוש עם טכניקות אלקטרוכימיות מהיר, בדרך כלל מהירה סריקה מחזורית (fscv)10,11. Fscv היא טכניקה הסורקת את הפוטנציאל המוחל במהירות ומספק מחזורי וולטמגרמה ספציפיים עבור אנליטים ספציפיים12,13. הנוכחי טעינה גדולה המיוצר על ידי סריקה מהירה יציבה על סיבי פחמן והוא יכול להיות ברקע מופחתים כדי לייצר מחזורי וולטמגרמות ספציפיים.

בשל האלקטרוכימיה האופטימלית והחשיבות הנוירוביולוגית שלו, הדופמין נחקר באופן נרחב. קטכולאמין דופמין הוא שליח כימי חיוני המשחק תפקיד מרכזי בשליטה של תנועה, זיכרון, קוגניציה, ורגש בתוך מערכת העצבים. עודף או מחסור של דופמין יכול לגרום להפרעות נוירולוגיות ופסיכולוגיות רבות; בין אלה הן מחלת פרקינסון, סכיזופרניה, והתנהגות ממכרת. היום, מחלת פרקינסון ממשיכה להיות הפרעה נפוצה בשל ניוון של מידות נוירונים מעורבים בסינתזה דופמין14. תסמיני המחלה של פרקינסון כוללים רעידות, איטיות תנועה, נוקשות, ובעיות בשמירה על האיזון. מצד שני, ממריצים כגון קוקאין15 ו אמפטמין16,17 לקדם את הגלישה של דופמין. שימוש בסמים בסופו של דבר מחליף את הזרימה הרגילה של דופמין ומצבים המוח לדרוש עודף דופמין, אשר בסופו של דבר מוביל התנהגויות ממכר.

בשנים האחרונות, יש דגש על שיפור פונקציונליות האלקטרודה בזיהוי נוירוטרנסמיטר18. השיטה הנפוצה ביותר של שיפור רגישות האלקטרודה היא על ידי ציפוי משטח סיבים. למרבה ההפתעה, יש כבר מחקר מוגבל נעשה על מתכת ננו-חלקיק electrodeposition תצהיר על סיבי פחמן19. אצילי מתכת-חלקיקים כגון זהב, עשוי להיות הופקד על המשטח סיבים עם חומרים פונקציונליים אחרים20. לדוגמה, הגדלת אזור המשטח האלקטרואקטיבי עבור ספיחה של נוירוטרנסמיטר להתרחש. אלקטרומופקד חלקיקי מתכת בצורה מהירה, ניתן לטהר, ולדבוק סיב פחמן. אלקטרוכימיה ממשיכה להיות משמעותית הן התצהיר של חלקיקי מתכת אצילי שיפור פני השטח של סיבי פחמן, כפי שהוא מאפשר את השליטה של התגררות וצמיחה של חלקיקים אלה. לבסוף, מוגבר מאפיינים קטליטיים ומוליך, ותחבורה המונית משופר הם בין היתרונות האחרים של ניצול חלקיקי מתכת לניתוח אלקטרו.

קורס רצף המעבדה המתקדמת של האוניברסיטה האמריקנית (הכימיה הביולוגית הניסיונית I ו-II כימית 471/671-472/672) הוא שילוב של מעבדות אנליטיות, פיזיקליות, וביוכימיה. הסמסטר הראשון הוא סקירה של טכניקות מעבדה. הסמסטר השני הינו פרויקט מחקר מונחה סטודנטים והוביל למחקרבן 21. עבור פרויקטים אלה, הסטודנטים בחנו בעבר את המנגנון של ביואוליכאל, חלבון, פפטיד, ו חומצת אמינו הקלה סינתזה של חלקיקי זהב22,23. עבודה עדכנית יותר התמקדה היווצרות של זהב ננו-חלקיק (אונפ) הייצור על משטחי האלקטרודה ואת הערכה של השפעות האונפס על היכולת CFMEs לזהות נוירוטרנסמיטורים. בעבודה הנוכחית, המעבדה החלה טכניקה זו כדי להדגים כי הרגישות של CFMEs בזיהוי חמצון-דופמין מוגברת באמצעות הפקדת האלקטרופ על פני השטח סיבים. כל חשופים-CFME מאופיין על ידי סריקה שונים, יציבות ו דופמין-ריכוז כאשר מזהה דופמין-זרמים חמצוני למדוד חמצון דופמין על פני השטח של CFME. Au3 + היה לאחר מכן חשמל או0 ו הופקד בו על משטח סיבים כמו חלקיקים, ואחריו סדרה של ניסויים אפיון. לאחר השוואה ישירה, הדודות-CFMEs נמצאו בעלי רגישות גבוהה יותר של זיהוי דופמין. הציפוי האחיד של הדודות על משטח הסיבים דרך הסיג החשמלי מעבד את שטח המשטח הגבוה יותר אלקטרואקטיבי; כך, הגברת הספיחה של דופמין על פני השטח אלקטרודה שונה. . זה הוביל לזרמי דופאמין גבוהים יותר ההפרדה הפוטנציאלית של חמצון דופמין ופסגות הפחתת (∆ Ep) של אונפ-cfmes היה גם קטן יותר, הרומז קינטיקה מהירה יותר העברת אלקטרון. עבודות עתידיות של מחקר זה כולל בדיקות vivo של הן חשופות ו-האונפ-CFMEs לאיתור דופמין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בניית מיקרואלקטרודות סיבי פחמן

  1. הכנת סיבי פחמן
    1. כדי ליצור פחמן סיבים מיקרואלקטרודות, ראשית להפריד את סיבי הפחמן (סיבי פחמן, 7 מ"מ בקוטר) אחד אחד באמצעות ידיים, כפפות, ו מרית.
    2. משוך או הוציא סיב אחד. מחוטי הצמר המעוות
    3. מנושף סיב פחמן בודד לתוך נימי זכוכית (חבית בורוסיליקט זכוכית קפילר ללא מיקרופילמנט, 1.2 מ"מ קוטר חיצוני, 0.68 מ"מ קוטר פנימי).
    4. צור מחזיק אלקטרודה עבור האלקטרודות על ידי גזירה פיסת קרטון כי הוא כ 10 ס מ אורך על ידי 25 ס מ רוחב.
  2. משוך את האלקטרודות. בעזרת פולר-קפיל אנכי
  3. פתחו את דלת ההזזה. של פולר הנימים האנכי
  4. לשחרר ולהסיר את מוט המחזיק מתכתי, על ידי סיבוב מקדחה-צ'אק נגד כיוון השעון עם מספיק מקום כדי להכניס את נימי הזכוכית.
  5. הכניסו את נימי הזכוכית למחזיק האלקטרודות. הרימו את נימי הזכוכית לראש הנימים האנכיים באופן ידני.
  6. הדקו את נימי הזכוכית בעזרת המקדח בכיוון השעון, מבלי לשבור או לנפץ את נימי הזכוכית.
  7. להתאים את החימום 1, מחמם 2, ואת הגדרות מגנט ליצרן רמות הציע למשוך נימים זכוכית להתחדד משובח עבור חומרים אלקטרודה.
  8. לחץ על לחצן התחל אדום כדי לחמם את הסליל מתפתל למשוך את האלקטרודות באמצעות לחץ, כוח הכבידה, והסקה.
  9. תן לסליל המתפתל להתקרר. מהמצב האדום והלוהט שלו חותכים את סיבי הפחמן עם מספריים המחברים את שני אלקטרודות משכו מלמעלה למטה. השתמש בשיטת הקידוח-צ'אק כדי להסיר את נימי הזכוכית מהפולר האנכי באמצעות פיתול הכיוון נגד כיוון השעון.

2. הכנה למיקרואלקטרודה פחמן-סיב

  1. תחת סטריאוסקופ או מיקרוסקופ, לחתוך את סיבי הפחמן בולטות מהמשטח של נימי הזכוכית עם מספריים כירורגית או להב תער חדה כדי כ 100 – 150 יקרומטר באורך.
  2. הכינו תמיסה של אפוקסי על-ידי ערבוב של 10 גר' אפוקסי עם 0.2 מ ל של הרהארמר בבקבוקון במבחנה של 25 מ ל באמצעות ספוגית כותנה.
  3. מטבל רק קצה של כל אלקטרודה לתוך התמיסה אפוקסי והרתחת במשך כ 15-s.
  4. טובלים את העליון הנ ל של סיבי פחמן מיקרואלקטרודה באצטון עבור כ 3 s לשטוף את כל אפוקסי עודף מחבית של מיקרואלקטרודה סיב פחמן.

3. אלקטרודפוציה

  1. מניחים את האלקטרודה עובד (פחמן סיבים מיקרואלקטרודה) בפתרון של 0.5 mM האוקלרנית4 בנוסף לאלקטרודה ההפניה, כסף כסף כלוריד (Ag/agcl) באמצעות המיקרומניפולציה.
  2. חברו את האלקטרודה העובדת ואת האלקטרודות להפניה לפוטנציאל ולשלב הקדמי.
  3. פתח את תוכנת UNC HDCV. שנה את ההגדרות בתוכנה כדי להחיל את צורת הגל. הזן את צורת הגל הבאה לתוך הגדרות המחשב: לסרוק מ 0.2 V ל-1.0 V בתוך 0.1 M KCl פתרון המכיל 0.5 mM לפחות4 בקצב סריקה של 50 mV/s עבור 10 מחזורים. לחץ על החץ הירוק כדי להחיל את צורת הגל. לאחר מכן, לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל בהקלטת המידות.

4. סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

הערה: תמונה חשופים וזהב ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות באמצעות סריקת אלקטרון מיקרוסקופ כלי (SEM). טען את המדגם על סרט מוליך שחור ובעקבות ההוראות המתוארות ביצרן.

  1. הפעלת המכשיר
    1. הפוך את המפתח להתחלה ולהפצה.
    2. פתח את התוכנה InTouchScope על ידי לחיצה כפולה.
    3. . שחררו את המפתח . זה אמור לנחות על הסימן שלי בעצמו
    4. המתן עד שלחצן הפינוי יפסיק להבהב.
    5. לאחר שלחצן הפינוי יפסיק להבהב, לחץ על לחצן האוורור.
    6. המתן עד שלחצן ה-VENT יפסיק להבהב.
    7. ודא כי מרחק העבודה (WD) הוא 20 מ"מ – 30 מ"מ.
    8. בעת המתנה, הכן את המדגם (ים).
  2. סריקה
    1. לאחר שלחצן האוורור יפסיק להבהב, טען את המדגם (ים) לתוך הכלי.
    2. ודא שהחלק המעוקל של מחזיק המדגם מכוון לכיוון הכלי בעת טעינת מדגם (ים).
    3. לחץ על לחצן ' פינוי ' לאחר שהמדגם נטען.
    4. כוונן את מרחק העבודה ל-10 מ"מ.
    5. לאחר שלחצן הפינוי יפסיק להבהב, הפעל את המחשב.
    6. לחץ על התוכנה בטווח מגע, הממוקמת בשולחן העבודה. יש שתי תוכנות בטווח מגע, לחץ על אחד בלי העיגול הירוק והצהוב.
    7. לאחר התוכנה נפתחת, לחץ על להתבונן (הימני העליון של המסך), כדי להדליק את הקרן. ודא שלחצן ' פינוי ' הפסיק להבהב לפני הלחיצה על ' התבונן '.
    8. התחל לנתח את המדגם (ים).
    9. ודא שהגדרות מתח, מרחק עבודה (WD) והגדרות הבדיקה הנוכחיות (PC) הן מקובלות.
    10. הקטן התרחקות (~ 50X) להגדרה גבוהה יותר והתקרבות למיקום נמוך יותר.
    11. . הגדר את מרחק העבודה ב -10 מ"מ
    12. לפני נטילת תמונה של מדגם (ות), ודא שהתמונה תישמר בתיקיית היעד הרצויה.
    13. כדי לבחור את התיקיה הרצויה, לחץ על ההגדרות (למעלה משמאל למסך).
    14. יצא את התמונות מהמחשב באמצעות כונן הבזק.
  3. ביטול
    1. לחץ על להתבונן כדי לכבות את הקרן.
    2. לחץ על לחצן האוורור והמתן עד שיפסיק להבהב.
    3. בזמן ההמתנה שלחצן ה-VENT יפסיק להבהב, התאם את מרחק העבודה בחזרה ל -20 מ"מ – 30 מ"מ.
    4. לאחר שלחצן האוורור יפסיק להבהב, פרוק את המדגם מכלי הנגינה.
    5. לחץ על לחצן ' פינוי ', והמתן עד שיפסיק להבהב.
    6. לאחר שלחצן הפינוי יפסיק להבהב, צא מהתוכנה וכבה את המחשב.
    7. הפוך את המפתח לסימן O כדי לכבות לחלוטין את המכשיר.

5. סריקה מהירה מחזורית בדיקות הוולטממטריה

  1. לחבר את סיבי פחמן מיקרואלקטרודה לפוטנציאל ולשלב הראש יחד עם אלקטרודות Ag/AgCl התייחסות.
  2. באמצעות המיקרומניפולציה, הנמך את סיבי הפחמן המיקרואלקטרודה אל תא הזרימה היטב על-ידי התאמת ידני של הידיות X, Y ו-Z.
  3. להכין פתרון מאגר במים די (131.5 mM הנאקל, 3.25 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.25 mM ארנה2פו4, 1.2 mmMgcl 2, ו 2.0 Mm Na2כך4 עם ה-pH מותאם ל 7.4).
  4. מלאו את תא הזרימה עם מאגר מלוחים באגירה מפוספז (pH = 7.4).
  5. בעזרת מזרק מאגר 60 mL מתמלא, הכנס את מאגר PBS לתוך תא הזרימה בערך 1 mL/min.
  6. הניחו את האלקטרודה בתא הזרימה והחילו את צורת הגל על ידי לחיצה על הכפתור הירוק. התבוננו באולוסקופ וחתכו את האלקטרודה או התאימו את הרווח כדי למנוע עומס יתר. אפשר כ -10 דקות של שיווי משקל בין כל לרוץ אלקטרודה.
  7. הגדר צורת גל ברירת המחדל. לסרוק מ – 0.4 V כדי 1.3 V ב 10 הרץ ו 400 V/s.
  8. הכנת פתרון מלאי של 10 מ"מ דופמין, סרוטונין, נוראדרנלין, ועוד בחומצה perchloric. לדלל נוירוכימיקלים לריכוז הסופי של 1 μM במאגר ידי pipetting 1 μM של פתרון מניות דופמין ב 10 מ ל של מאגר PBS באמצעות פיפטה.
  9. כדי להתחיל במדידות, לחץ על לחצן הרשומה. לאחר 10 s, להזריק 0.2 mL של 1 μM דופמין לתוך תא הזרימה או כל ריכוז אחר של מוליך עצבי. כוונן את הריכוז, קצב הסריקה, צורת גל (החזקת פוטנציאל או החלפת פוטנציאל) בהתאם. הגדר את זמן ההפעלה הכולל עבור 30 s.
  10. נתח את ההפעלה באמצעות תוכנת ניתוח HDCV. שנה את הפרמטרים לפי הצורך.
  11. לאחר השלמת הניסוי, נקו את תא הזרימה על-ידי הזרקת 3 מ ל מים ולאחר מכן האוויר לתוך המאגר ויציאות ההזרקה של תא הזרימה שלוש פעמים כל אחד.
  12. . כבו את צורת הגל והכלי

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבור איור 1, אנו מראים סכמטי שבו FSCV בדיקות מנוצל כדי למדוד את הריכוז של הנוירוטרנסמיטורים בתוך מבחנה. איור 1 מציג את בעלי הדופאמין שהוחלו על צורת הדופמין. המשולש בצורת גל סריקות מ-0.4 V כדי 1.3 V ב 400 V/s. בחלק השני של הדמות משמאל, זה מציג את החמצון של דופמין כדי דופמין-אורתופדיה-quinone (DOQ), שני תהליך העברת אלקטרונים מתרחשת מהמשטח של האנליטה אל פני השטח של האלקטרודה. לבסוף, העלילה הנוכחית לעומת זמן מצופה בעלילה צבעונית. העלילה לעומת הזמן הנוכחי הוא ייצוג של חמצון דופמין. זה שטוח כאשר אין חמצון דופמין, והוא עולה באופן אנכי כאשר דופמין הוא תחמוצת דופמין-אורתוקינ1 ומופחת חזרה לתוך דופמין כמו הספיחה, ולאחר מכן, desorbs מן המשטח של האלקטרודה. מגרש הצבעים הוא מגרש תלת מימדי של הנוכחי. הזרם הצהוב הוא הרקע הנוכחי (קרוב לאפס), בעוד העלילה הירוקה הוא חמצון חיובי זרם (חמצון דופמין כדי דופמין אורתוקנ1), ואת העלילה הכחולה היא הפחתה שלילית הנוכחי (דופמין אורתוקינס1 הפחתת דופמין).

SEM היה מנוצל תכונות המשטח של התמונה של אלקטרודות הפחמן חשופים ושונה. באיור 2, אנו רואים הבדל ייחודי בתכונות פני השטח בין שלושה סוגים שונים של חומרי האלקטרודה. באיור 2a, מיקרואלקטרודה של סיבי פחמן חשופים מוצג. סיבים הוא כ 7 יקרומטר קוטר עם רכסים גליליים לאורך החיצוני. איור 2b מראה חלקיקים זהב הופקד על פני השטח של סיבי הפחמן עבור כ 20 דקות עם רכס חדה גדולה של זהב בולטות מהמשטח של סיבי הפחמן. הנוכחות של זהב היה מאומת יותר עם מדידות עורכים/EDX. לאחר מכן הפחיתו את זמן הסיג החשמלי ל-5 דקות שבו הבחנו בציפוי אחיד דק זהב כפי שמוצג באיור 2 ג.

השוואת רגישות והעברת אלקטרונים

איור 3a מראה השוואה של רגישות והעברת אלקטרונים. כפי שמוצג עם מחזורית חופפים voltammograms, זהב שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות באופן משמעותי גבוהה יותר השיא של זרמים חמצוני (איור 3b) ומהיר קינטיקה העברת אלקטרון (ΔEP). המשמעות נמדדה עם מבחן t שאינו משויך (P = .004 ו-. 0016, בהתאמה). קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של הממוצע.

יציבות

חשופים (איור 4a) ו זהב ננו-חלקיק שונה (איור 4a) cfmes הוצבו בתא הזרימה עבור 4 h. מדידות נלקחו לאיתור של 1 μm דופמין כל שעה מעל 4 h. לשני האלקטרודות הייתה תגובה יציבה. ביחס לדופאמין תגובה יציבה לדופמין (ללא חמצון מים) חשוב באופן ביקורתי לביצוע מדידות ברקמה הביולוגית. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של הממוצע.

קצב סריקה

שיעור הסריקה היה מגוון מ 100 V/s כדי 1,000 V/s. שניהם חשופים (איור 5a) ו זהב ננו-חלקיק (איור 5a) אלקטרודות ששונו הראו תגובה ליניארית עם היחס דופמין זיהוי, ולכן, המציין את השליטה ספיחה על פני השטח של ננו-חלקיק חשופים וזהב שונה מיקרואלקטרודה. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של הממוצע.

ריכוז

הריכוז היה מגוון מ 100 ננומטר ל 100 μM דופמין עבור חשופים (איור 6a) ו זהב ננו-חלקיק שונה (איור 6a) פחמן מיקרואלקטרודות סיבי. הטווח הליניארי היה מ 100 ננומטר ל -10 μM. לאחר 10 μM, אנו צופים עקומה אסימפטוטית המציין כי דופמין הוא רווי על פני השטח של מיקרואלקטרודה סיב פחמן. התגובה הליניארית של זרם החמצון השיא של דופמין ביחס לריכוז דופמין מציין בקרת ספיחה אל פני השטח של האלקטרודה. ריכוזי הדופמין הרלוונטיים במוח נמצאים בטווח הזה ומשתנים בין אזורי מוח.

Figure 1
איור 1. . סכימטי של חמצון דופמין כיסוי של סיבי פחמן. מיקרואלקטרודה אוקסיגון דופאמין העברת טעינה מוצג מפני השטח כמו דופמין הוא תחמוצת דופמין-אורתוקווי1 ובחזרה דופמין כמו דופמין משולש צורת גל מוחל (-0.4 V כדי 1.3 V ב 400 V/s). הנוכחי לעומת מגרשים הזמן והצבע מוצגים חמצון המציין דופמין (ירוק) ו דופמין הפחתת (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. SEM תמונות של (a) מיקרואלקטרודה פחמן חשופים, (ב) זהב-ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות עם 20 דקות תצהיר האלקטרודה, ו (ג) זהב-ננו-חלקיק מיקרואלקטרודות שונה עם הזמן 5-דקות תצהיר האלקטרודה. זה מספק הוכחה של תוצאות העיקרון כי הגודל והעובי של ציפוי זהב ננו-חלקיק יכול להיות נשלט על ידי הזמן האלקטרו התצהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. רגישות השוואה של אלקטרודות חשופות וזהב ננו-חלקיק שונה. (א) כיסוי מחזורי וולטמגרמות של מיקרואלקטרודות חשופות וזהב ננו-חלקיק. (ב). גרף עמודות המציין הבדלים בשיא הזרם חמצוני של מיקרואלקטרודות חשופות וננו-חלקיק זהב. (ג). גרף עמודות המראה את ההבדל ב-ΔEP בין מיקרואלקטרודות חשופות וזהב ננו-חלקיק ששונו. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. . ניסוי יציבות (א) חשופים ו-(ב) זהב ננו-חלקיק מיקרואלקטרודות שהשתנו הוצבו בתא זרימה עבור סך של לפחות 4 h. רגישות שלהם כלפי 1 μM דופמין נמדד מעל 4 h. לשניהם הייתה תגובה אחידה לדופמין מעל 4 שעות. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. . ניסוי שיעור הסריקה (א) חשופים ו (ב) זהב ננו-חלקיק-מיקרואלקטרודות שהשתנו הונחו בתא זרימה, ושיעור הסריקה היה מגוון מ 100 v/s כדי 1,000 v/s. שניהם חשופים וזהב ננו-חלקיק שונה מיקרואלקטרודות היתה תגובה ליניארית עם כבוד קצב הסריקה, ובכך המציין בקרת ספיחה של דופמין אל פני השטח של ננו-חלקיק שונה סיבים פחמן מיקרואלקטרודה. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. . ניסוי בריכוז (א) חשופים ו (ב) זהב ננו-חלקיק-מיקרואלקטרודות שהשתנו נחשפו ריכוזים שונים של דופמין 100 NM – 100 μm. שניהם חשופים וזהב ננו-חלקיק שונה מיקרואלקטרודות היה תגובה ליניארית עם כבוד דופמין עד 10 μM, ובכך המציין את השליטה בקרת השטח של האלקטרודה. בריכוזים גבוה יותר 10 μm, אנו צופים עקומה אסימפטוטית, אשר מעיד על רוויית דופמין על פני השטח של האלקטרודה על ידי כיבוש כל אתרי ספיחה וכתוצאה מכך בקרת דיפוזיה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אנו להדגים שיטה הרומן לבנות זהב-ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות לאיתור של נוירוטרנסמיטורים כגון דופמין באמצעות סריקה מהירה מחזורית וולטמטריה. השיטה היא גישה יעילה, ירוקה, וזולה יחסית לשיפור הרגישות של גילוי ביואוכאל. עובי הזהב שהופקדו על פני סיבי הפחמן יכול להיות נשלט על ידי הזמן של התצהיר ואת ריכוז הזהב הנוכחי בפתרון אלקטרותצהיר. שונה זהב פחמן סיבים מיקרואלקטרודות הוכחו יש באופן משמעותי יותר אלקטרואקטיבי משטח הקרקע מאשר אלקטרודות חשופות בנוסף לקינטיקה מהירה יותר של העברת אלקטרון. כמו כן, היו להם רגישויות גבוהות יותר וגבולות נמוכים יותר של גילוי מאשר חומרי האלקטרודה שלא שונו. יתר על כן, אלקטרודות הראו יציבות כלפי זיהוי דופמין כאשר נבדק בתא הזרימה לפחות 4 h. הייתה תגובה לינארית ביחס לשיא הזרם חמצוני לאיתור דופמין ביחס לקצב הסריקה הן הריכוז עבור הזהב שונה סיבי פחמן אלקטרודות המציין בקרת ספיחה אל פני השטח של האלקטרודה.

צעדים קריטיים בפרוטוקול כוללים את משיכת מיקרואלקטרודות סיבי פחמן עם פולר הקפילר אנכי והשגת הדבקה הפנים בין נימי זכוכית סיבי פחמן באמצעות אפוקסי. יתר על כן, את החוט החשמלי של זהב על פני השטח של סיבי הפחמן הוא די מאתגר לשמור על איזון בין בעל ציפוי אחיד דק של זהב על פני השטח של האלקטרודה ועל הפקדת יתר זהב על פני השטח של ה אלקטרודה, אשר מעכב את זיהוי הנוירוטרנסמיטור באמצעות רעש ועומס יתר של אותות. שינויים ופתרון בעיות בשיטה כוללים אופטימיזציה של שיטת ההצהרה ביחס לזמן ולריכוז. מקורות שונים של זהב (AuCl3, haucl4, והידרוטים זהב אחרים) צריך להיות מנוצל כדי לבצע ניסויים אלה. מגבלות השיטה כוללות את האפשרות של העמסת הזהב על האות של הפוטנציאל בעקבות התצהיר. יתר על כן, כמו חומר האלקטרודה מתכת, אלקטרודות שונה זהב יכול להיות מתחמצן על המים בעת סריקה לפוטנציאלים גבוהים יותר (מעל 1.45 V), אשר יכול להפריע לאות אנליטה.

השיטה היא התקדמות מסומן בתחום כמו זהב ננו-חלקיק שונה מיקרואלקטרודות משמעותית לשפר את זיהוי הנוירוטרנסמיטר ולא נבדקו ביסודיות עבור זיהוי נוירוטרנסמיטר באמצעות FSCV. שיטה נוספת של שיפור אותות אלקטרוכימי עבור cmfes היא באמצעות שינוי עם פחמן צינורות24,25,26. לעתים קרובות מגביר את האות לתוך שפופרת ננו פחמן. עם זאת, הרעש הוא גם גדל כמו שכבה של צינוריות פחמן הופקד הוא הטרוגנית. ננו-חלקיק זהב התצהיר הוא שיטה מהירה, מיועלת, ויעילה כדי ליצור חיישנים ביואוכאל משופרת. פיתוח שיטות עתידיות יכלול אופטימיזציה של זהב שינוי ננו-חלקיק של מיקרואלקטרודות פחמן סיבים ליצור דק, אחידה שכבות של זהב על פני השטח מעל מיקרואלקטרודות סיבי פחמן. יתר על כן, המחקר ואופטימיזציה של גילוי של נוירוכימיקלים אחרים (נוראדרנלין, סרוטונין, היסטמין, אדנוזין, ואחרים) גם יבוצע. לבסוף, אלה משופרת זהב שינוי מיקרואלקטרודות ישמש לבצע במדידות vivo של נוירוטרנסמיטורים ב מכרסם או מודלים זבוב הפירות. שיפור של זיהוי דופמין דרך שינוי ננו-חלקיק זהב מאפשר יישומים רבים אפשריים ומחקרים במדעי המוח כגון לימוד מחלת פרקינסון, התעללות בסמים, והפרעות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

היינו רוצים להודות לאוניברסיטה האמריקאית, מחקר הפקולטה תמיכה מענק, נאס א DC מענק שטח, ו NSF-MRI 1625977.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dopamine hydrochloride Sigma Aldrich H8502-5G
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich P5493-1L
Pine WaveNeuro Potentiostat Pine Instruments NEC-WN-BASIC This orders comes in bulk with all other accessories such as headstages, adapters, cords, and other electronics
Pine Flow Cell and Micromanipulator Pine Instruments NEC-FLOW-1 This is also another bulk order including the micromanipulator, flow cell, knobs, tubing, connectors, etc.
Glass-Capillary A-M Systems 602500
T-650 Carbon Fiber Goodfellow C 005711
Epon 828 Epoxy Miller-Stephenson EPON 828 TDS
Diethelynetriamine Sigma Aldrich D93856-5ML
Gold (III) chloride Sigma Aldrich 254169 Comes as either HAuCl4 or AuCl3
pH meter Fisher S90528
Farraday Cage AMETEK TMC 81-334-03
Syringe Pump NEW ERA PUMP NE-1000
Eppendorf Pipettes and Tips Eppendorf 2231000222 This is also a bulk order containing multiple pipettes and tips
10 -1,000 mL beakers VWR 10536-390
Carbon fiber Goodfellow C 005711
SEM JEOL JSM-IT100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zestos, A. G., Nguyen, M. D., Poe, B. L., Jacobs, C. B., Venton, B. J. Epoxy insulated carbon fiber and carbon nanotube fiber microelectrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 182, 652-658 (2013).
  2. Bucher, E. S., Wightman, R. M. Electrochemical analysis of neurotransmitters. Annual review of analytical chemistry. 8, 239-261 (2015).
  3. Zestos, A. G., Venton, B. J. Communication—Carbon Nanotube Fiber Microelectrodes for High Temporal Measurements of Dopamine. Journal of The Electrochemical Society. 165, G3071-G3073 (2018).
  4. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of neurochemistry. 119, 932-944 (2011).
  5. Abdalla, A., et al. In Vivo Ambient Serotonin Measurements at Carbon-Fiber Microelectrodes. Analytical chemistry. 89, 9703-9711 (2017).
  6. Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PloS one. 13, e0196932 (2018).
  7. Denno, M. E., Privman, E., Borman, R. P., Wolin, D. C., Venton, B. J. Quantification of histamine and carcinine in Drosophila melanogaster tissues. ACS chemical neuroscience. 7, 407-414 (2016).
  8. Sanford, A. L., et al. Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes. Analytical chemistry. 82, 5205-5210 (2010).
  9. Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Analytical chemistry. 76, 5697-5704 (2004).
  10. Raju, D., et al. Polymer modified carbon fiber-microelectrodes and waveform modifications enhance neurotransmitter metabolite detection. Analytical Methods. 11, 1620-1630 (2019).
  11. Jacobs, C. B., Ivanov, I. N., Nguyen, M. D., Zestos, A. G., Venton, B. J. High temporal resolution measurements of dopamine with carbon nanotube yarn microelectrodes. Analytical chemistry. 86, 5721-5727 (2014).
  12. Zestos, A. G., Yang, C., Jacobs, C. B., Hensley, D., Venton, B. J. Carbon nanospikes grown on metal wires as microelectrode sensors for dopamine. Analyst. 140, 7283-7292 (2015).
  13. Zestos, A. G. Carbon Nanoelectrodes for the Electrochemical Detection of Neurotransmitters. International Journal of Electrochemistry. , (2018).
  14. Kim, J. H., et al. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease. Nature. 418, 50 (2002).
  15. Zestos, A. G., et al. Ruboxistaurin Reduces Cocaine-Stimulated Increases in Extracellular Dopamine by Modifying Dopamine-Autoreceptor Activity. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1960-1969 (2019).
  16. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS Journal. 19, 1284-1293 (2017).
  17. Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42, 1940 (2017).
  18. Zestos, A. G., Venton, B. J. Carbon Nanotube-Based Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection. ECS Transactions. 80, 1497-1509 (2017).
  19. Zachek, M. K., Hermans, A., Wightman, R. M., McCarty, G. S. Electrochemical Dopamine Detection: Comparing Gold and Carbon Fiber Microelectrodes using Background Subtracted Fast Scan Cyclic Voltammetry. J Electroanal Chem (Lausanne Switz). 614, 113-120 (2008).
  20. Li, J., Xie, H., Chen, L. A sensitive hydrazine electrochemical sensor based on electrodeposition of gold nanoparticles on choline film modified glassy carbon electrode. Sensors and Actuators B: Chemical. 153, 239-245 (2011).
  21. Hartings, M. R., Fox, D. M., Miller, A. E., Muratore, K. E. A hybrid integrated laboratory and inquiry-based research experience: replacing traditional laboratory instruction with a sustainable student-led research project. Journal of Chemical Education. 92, 1016-1023 (2015).
  22. Hart, C., et al. Protein-templated gold nanoparticle synthesis: protein organization, controlled gold sequestration, and unexpected reaction products. Dalton Transactions. 46, 16465-16473 (2017).
  23. Hartings, M. R., et al. Concurrent zero-dimensional and one-dimensional biomineralization of gold from a solution of Au3+ and bovine serum albumin. Science and technology of advanced materials. 14, 065004 (2013).
  24. Xiao, N., Venton, B. J. Rapid, sensitive detection of neurotransmitters at microelectrodes modified with self-assembled SWCNT forests. Analytical chemistry. 84, 7816-7822 (2012).
  25. Zestos, A. G., Jacobs, C. B., Trikantzopoulos, E., Ross, A. E., Venton, B. J. Polyethylenimine Carbon Nanotube Fiber Electrodes for Enhanced Detection of Neurotransmitters. Analytical chemistry. 86, 8568-8575 (2014).
  26. Yang, C., et al. Carbon nanotubes grown on metal microelectrodes for the detection of dopamine. Analytical chemistry. 88, 645-652 (2015).

Tags

כימיה סוגיה 147 סריקה מהירה מחזורית הוולטממטריה FSCV פחמן-סיבים microelectrode דופמין נוירוטרנסמיטר זהב חלקיקי
גולד ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות לגילוי משופר נוירוכימי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohanaraj, S., Wonnenberg, P.,More

Mohanaraj, S., Wonnenberg, P., Cohen, B., Zhao, H., Hartings, M. R., Zou, S., Fox, D. M., Zestos, A. G. Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection. J. Vis. Exp. (147), e59552, doi:10.3791/59552 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter