Summary

거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

Published: April 30, 2019
doi:

Summary

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 박테리아의 단세포 배양을 보여줍니다. 세균 세포를 함유하는 GV는 액적 전달 방법에 의해 제조되었고, 세균 성장의 직접적인 관찰을 위해 유리 기판 위에 지지막 에 고정시켰다. 이 접근은 또한 그밖 세포에 적응할 수 있습니다.

Abstract

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 단세포 수준에서 세균성 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 세균 세포 배양은 자연 환경에서 세균 세포의 기능을 이해하는 데 중요합니다. 기술적인 진보 때문에, 다양한 세균성 세포 기능은 밀폐된 공간 안쪽에 단세포 수준에서 드러나질 수 있습니다. GV는 양과성 지질 분자로 구성된 구형 마이크로 크기의 구획이며 세포를 포함한 다양한 물질을 보유 할 수 있습니다. 본 연구에서, 단일 세균 세포를 액적 전달 방법에 의해 10-30 μm GV로 캡슐화하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 유리 기판 상에서 지지막 상에 고정시켰다. 우리의 방법은 GV 내부의 단일 박테리아의 실시간 성장을 관찰하는 데 유용합니다. 우리는 대장균 (대장균) 세포를GV 내부의 모델로 배양했지만,이 방법은 다른 세포 유형에 적응 할 수 있습니다. 우리의 방법은 미생물학, 생물학, 생명 공학 및 합성 생물학의 과학 및 산업 분야에서 사용될 수 있습니다.

Introduction

단일 세포 수준에서 세균 세포의 배양은 점점 더 주목을 받고 있다. 밀폐된 공간 내부의 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양하면 자형형 가변성1,2,3,4,세포 동작5, 6개 , 7명 , 8개 , 9,항생내성10,11. 배양 기술의 최근 발전으로 인해, 단일 박테리아의 배양은 잘 칩4,7,8,젤 방울12,13과 같은 제한된 공간 내에서 달성 될 수있다 및 물 -에 – 오일 (W/ O) 물방울 5,11. 단일 세균 세포의 이해 또는 활용을 촉진하기 위해 재배 기술의 추가 기술 개발이 필요합니다.

생물학적 세포막을 모방하는 소포는 양서류 분자로 구성된 구형 구획이며 다양한 물질을 보유할 수 있습니다. 소포는 크기에 따라 분류되며 소형 소포(SV, 직경 및 100nm), 대형 소포(LAV, lt;1 μm) 및 거대 소포(GV, >1 μm)를 포함합니다. SV 또는 ROV는 생물학적 세포막(14)에 대한 그들의친화성 때문에 약물 담체로서 일반적으로 사용된다. GV는 또한프로토셀(15) 또는 인공세포(16)의시공을 위한 반응기 시스템으로 사용되어 왔다. 생물학적 세포를 GV내로 캡슐화한 것은 17, 18, 이에 따라 반응기 시스템과 결합될 때 세포 배양 시스템으로서의 잠재력을 보여준다고17,18.

여기서, 실험 적인 절차의 비디오와 더불어, 우리는 GV가 새로운 세포 배양 용기로 이용될 수 있는 방법19를기술합니다. 박테리아를 함유하는 GV는 액적 전달 방법(20)에 의해 제조된 후 커버 유리 에 지지된 막에 고정시켰다. 우리는 실시간으로 GV 내부의 단일 세포 수준에서 세균 성장을 관찰하기 위해이 시스템을 사용했다.

Protocol

1. 액적 전달 방법에 의한 세균세포를 함유하는 GV의 제조 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC, 10 mMM, 1 mL) 및 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[바이오티닐(폴리에틸레네글리콜)-2000] (비오틴-PEG-DSPE, 0.1 mM, 1 mL) 클로로폼/ 메탄올 용액 (2/1, v / v)을 하고 재고를 -20 °C에 보관하십시오. 지질 함유 오일 용액의 제조 POPC 용액의 20 μL과 비?…

Representative Results

액적 전달 방법을 사용하여 단일 세균 세포를 함유하는 GV를생성하는 간단한 방법을 제시한다(도 1). 도 1a는 박테리아를 함유하는 GV의 강수량의 개략적 이미지를 나타낸다. 박테리아를 포함하는 W/O 방울은 GV를 형성하기 위하여 원심분리에 의해 기름 물 (지질 단층) 계면에 걸쳐 전달됩니다. 자당 (내부 수성 용액)과 포도당 (외?…

Discussion

여기서, 우리는 GV 내부의 단세포 수준에서 세균 세포를 배양하는 방법을 기술한다. 이 간단한 방법은 액적 전달 방법을 사용하여 단일 세포 수준에서 세균 세포를 포함하는 GV를 형성하는 것을 포함한다. 세균 세포를 함유하는 GV를 얻기 위한 다른 접근법과 비교하여, 이 방법은 두 가지 장점이 있다: (i) 개발하기 쉽고, (ii) 샘플 용액의 작은 부피(2 μL)가 GV를 제조하는 데 필요하다. 세균세포를 함유…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 일본 의 문부과학성(MEXT)의 우수 청년 연구자(리더, 제16812285호)의 우수 청년 연구자 주도 이니셔티브(16812285호)와 젊은 과학자 연구 보조금(18K18157, 16K21034)의 지원을 받았습니다. 일본과학진흥회(JSPS)에서 M.M.까지, MEXT에서 K.K.까지 의학지원(No. 17H06417, 17H06413).

Materials

Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

References

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).

Play Video

Cite This Article
Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

View Video