Summary
Hier presenteren we een protocol om bloedmonsters te nemen van de subclavia ader van muizen.
Abstract
De muis is het belangrijkste zoogdier model voor het bestuderen van de menselijke ziekte en de menselijke gezondheid. Echter, bloedmonster collectie van muizen is een uitdaging in het onderzoek werk. Tail Blood Collection is een populaire methode wanneer een kleine hoeveelheid bloedmonster nodig is. Orbitale slagader kan worden beschouwd als een grote hoeveelheid bloed nodig is, maar deze bloedafname methode heeft ethische kwesties. Vroeger, toonden wij de haalbaarheid en de veiligheid van de inzameling van het bloedmonster door subclavia ader punctie bij ratten, en hier onderzoeken wij of deze methode in muizen zou kunnen worden gebruikt. Wij melden dat deze methode is veilig en praktisch voor bloedafname bij muizen. Bloedafname door de subclavia ader punctie in muizen kan een handige methode in het dagelijks onderzoek werkt.
Introduction
Bloedmonster verzameling van muizen is essentieel in de meeste onderzoekslaboratoria. De conventionele benaderingen voor bloedinzameling in muizen is staart knipsel wanneer minder dan 100 µ L van steekproef nodig is1. Echter, als er meer dan 100 µ L van bloed nodig zijn op een niet-terminale tijdpunt, retroorbital, submandibulaire bloeden of submentale bloedafname zijn de meest beschouwde technieken2. In sommige gevallen, de halsader ader katheterisatie door middel van een chirurgische incisie werd aangenomen als een alternatieve methode3.
Niettemin, de bovenstaande methoden zijn schadelijk voor de muizen. Om het beste van onze kennis, is de retroorbital methode niet algemeen aanvaard vanwege het potentiële risico van complicaties4,5. Operatie gerelateerde trauma niet alleen gebeurt in het zichtbare gebied6,7, maar ook diep in de baan6. Trouwens, submandibulaire bloedafname is stressvol8 en kan worden geassocieerd met overmatig bloeden van2,9. Op basis van ons voorafgaand onderzoek10,11, hier introduceren we een nieuwe strategie voor bloedafname van de subclavia ader bij muizen. De veiligheid, haalbaarheid en het verkregen bloedvolume met deze techniek worden gepresenteerd en besproken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Centraal-Zuid-Universiteit ethiek Comite voor dier onderzoek van de tweede Xiangya ziekenhuis (Changsha, China). Het manuscript werd voorbereid volgens aankomst (dierlijk onderzoek: rapportering van in vivo experimenten) richtlijnen12.
1. materiaal en dier
- Bereid de benodigde materialen: 75% ethanol, plakband, epileer agent, 2 mL Tube, 1,0 mL spuit in verband met naald (26G), elektronische weegschaal, heparine en zoutoplossing (Zie tabel van materialen).
- Dieren: bereid 10 Kunming muizen, 6-8 weken oud en weegt 21.6-28.3 g (Zie de lijst van materialen). Handhaaf muizen in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren13.
2. anesthesie en dieren positionering
- Weeg de muis om de vereiste dosering van verdoving agent te berekenen.
- Injecteren natrium pentobarbital (60 mg/kg) door middel van intraperitoneale injectie te induceren algemene anesthesie14 (Figuur 1). Breng een steriele oog smering zalf aan het begin van de procedure om schade aan blootgestelde ogen te voorkomen.
Nota: de muizen worden beschouwd als om voldoende verdoofd wanneer het tonen van geen motor reactie op het testen van de pedaal terugtrekkings reflex, staart snuifje, of buikhuid snuifje. - Plaats de muis in de bewerkings tabel in een liggende positie en 2-4 cm afstand van de rand van de tafel om ader punctie te vergemakkelijken (Figuur 2). Bevestig de ledematen in een comfortabele positie zoals weergegeven in Figuur 2. In de hele procedure is geen intubatie of mechanische ventilatie nodig.
- Breng epileer agent rond de infraclavicular ruimte met een wattenstaafje.
- Drie minuten later, was de epileer agent met een natte wattenstaafje om de vacht en eventuele zichtbare vuil te verwijderen.
- Steriliseren van de infraclavicular ruimte met 75% ethanol en vervolgens droog met schone gaas.
3. subclavia ader punctie en bloedafname
- Identificeer de locatie van de clavicula bot en superieure sternale Fossa met een vinger.
- Zoek de punctie site dicht bij het midden van de clavicula bot en caudale aan. Zet de linker wijsvinger lateraal van de punctie site om de huid en het onderhuidse weefsel vast te stellen (Figuur 3).
- Beweeg de naald naar boven en craniale naar de superieure sternale Fossa. Zodra de naald het onderhuidse weefsel binnenkomt, beweeg de ringvinger van de rechterhand achteruit om negatieve druk te vormen (Figuur 3).
Opmerking: tijdens deze stap, de positie van de exploitant ´ s rechterhand moet iets lager zijn dan de operatietafel om de naald omhoog en superieur aan het horizontale vlak te maken. Dat is de reden waarom het dier is geplaatst in de buurt van de rand van de tafel. - Verplaats de spuit naar voren 3-4 mm, maar stoppen als er geen bloed afvoer in de spuit. Dan langzaam trekken terug de spuit en houd de negatieve druk in. In de meeste gevallen, het bloed zou de spuit in te voeren bij het tekenen terug.
- Zodra het bloed komt de spuit, bevestig de spuit en behoud van de negatieve druk totdat het vereiste volume (200 µ L) van het bloed wordt verzameld in de spuit.
- Na bloedafname, trek de punctie naald, en druk op de punctie site met een wattenstaafje iets voor 1-2 minuten om te stoppen met bloeden. Dan, terug muizen naar de kooi.
Opmerking: af en toe, kon men niet verkrijgen van het bloed bij zijn/haar eerste poging. Pas de richting van de naald lateraal aan en herhaal stap 3.3-3.5. Als 3 pogingen niet te verkrijgen bloedmonster, overschakelen naar de andere kant. - Breng het bloedmonster in een heparinized buis.
4. muizen herstel
- Terwijl de pentobarbital anesthesie is in feite, snelheid herstel door het verstrekken van warmte-ondersteuning totdat de muis weer in beweging is.
Representative Results
We herhaalden deze procedure in 10 Kunming muizen (mannelijk n = 5, vrouw n = 5, gewicht 25,4 ± 2,0 g). Negen procedures slaagden aan de juiste kant. Één geval ontbrak binnen 3 pogingen in de juiste kant en bloedinzameling slaagde aan de linkerkant. De tijd cursus (van punctie aan het verkrijgen van vereiste bloedvolume) varieerde tussen 35-126 seconden (gemiddeld 68,4 ± 26,4 s). De inzameling van het bloedvolume werd geplaatst aan rond 200 µ L (gemiddelde 203 ± 11,6 µ L). De inzameling van het bloed slaagde binnen 1 tot 4 pogingen. Bloedbemonstering geslaagd op de eerste poging in twee muizen en na 4 pogingen in een muis; de bemonstering nam 2-3 pogingen in de andere muizen. Alle gegevens zijn geïllustreerd in tabel 1. Alle dieren overleefden en teruggewonnen binnen 30 minuten na de bloedbemonstering. Er was geen significant verschil tussen geslachten voor alle waargenomen parameters (tabel 1).
Figuur 1 : Algemene anesthesie door intraperitoneale injectie Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : De liggende positie van de muis. Let op de afstand tussen de marge en de muis is 2-4 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : De punctie site en de houding van de handen van de exploitant. Merk op dat de ringvinger van rechterhand naar achteren gaat om negatieve druk te vormen. De linkerhand is geplaatst lateraal van de punctie site om de huid en onderhuidse weefsels vast te stellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : De locatie van de subclavia ader, clavicula Bone en superieure sternal Fossa. De subclavia ader cursussen onder de clavicula bot en afvoeren in de superieure Vena Cava onder de superieure sternale Fossa. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : De relatie tussen de vaatwand en de naald tijdens de procedure. (A) de wanden van de subclavia ader hechten aan elkaar als de naald naar voren beweegt, zodat er geen bloed kan worden getrokken uit. (B) terwijl de naald terug te trekken, de muren gescheiden van elkaar en het bloed kan worden getrokken uit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Variabele | Totaal (n = 10) | Mannelijk (n = 5) | Vrouw (n = 5) | P-waarde |
| Lichaamsgewicht (g) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 |
| Bloed volume (l) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 |
| De cursus van time (s) | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 |
| Opnames | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 |
| Er waren geen significante geslachtsverschillen voor alle waargenomen parameters, alle P waarde > 0.05. | ||||
Tabel 1: waargenomen parameters tussen de geslachten
Discussion
Dit rapport is een uitbreiding van eerdere onderzoek naar bloedbemonstering door de subclavia ader punctie bij ratten11. Als de muis is het meest gebruikte onderzoek dier, zou het waardevol om te zien of deze techniek kan ook worden toegepast op muizen. De uitdaging komt van de relatief kleinere diameter van de subclavia ader.
In het huidige onderzoek, vonden we dat subclavia punctie in muizen is een haalbaar en betrouwbare manier om bloed te verzamelen. Vergeleken met de conventionele methoden, zoals staart ader snijden of orbitale bloedafname, zijn er geen ethische kwesties van de huidige methode. Alle dieren overleefden na deze procedure zonder vloeibare supplementen na rond 200 µ L van bloed extractie, en de dieren zouden voor verdere experimentele studies kunnen worden gebruikt. Theoretisch, de totale monstervolume extractie niet kon bereiken meer dan 10% van de totale circulerende bloedvolume elke keer en het totale volume van een volwassen dier is 55 tot 70 mL/kg lichaamsgewicht5. Voor de muizen die in dit onderzoek (21.6-28.3 g) worden gebruikt, zou de maximumvolume extractie rond 200 µ L moeten zijn. We stellen dus de bloedbemonstering bedrag rond 200 µ L voor elke muis. Het onvermogen om de bloeddruk te meten, hartslag, en andere stress parameters zijn de belangrijkste beperkingen van dit rapport.
Voldoende algemene anesthesie is een andere belangrijke kwestie om het succes van de punctie te garanderen. De muizen moeten stil blijven tijdens de punctie procedure om het risico van verwonding van het schip door de naald te voorkomen. Wij vonden dat pentobarbital natrium bij 60 mg/kg voor algemene anesthesie ideale diepte van anesthesie kon tevredenstellen. Een nadeel van deze agent is de relatief lange hersteltijd (gemiddeld ongeveer 30 minuten). In sommige instituten, Isofluraan inhalatie wordt gebruikt voor de korte hersteltijd en moet in aanmerking worden genomen als een alternatieve anesthesie keuze15.
De locatie van subclavia ader is weergegeven in Figuur 4. Vanwege de dunne wand en lage druk in de ader, de voorste en achterste wand van de subclavia ader zou hechten aan elkaar onder de druk van een naald, terwijl de naald vooruit beweegt (figuur 5a). Terwijl het terugtrekken van de plunjer langzaam achteruit, zal de aangrenzende muren spontaan scheiden, en het uiteinde van naald kon de ware holte van schip ingaan en het bloed kon in de spuit onder aanhoudende negatieve druk uitlekken (Figuur 5b). Gebruik van een vacuüm bloedafname systeem16 kan ook het voordeel van de bloedafname. Door de relatief kleine diameter van de muizen subclavia ader, kan er zelfs mislukkingen voor een ervaren exploitant. Voor een beginner, raden wij subclavia ader punctie bij ratten zoals gerapporteerd11. Na een aantal succesvolle punctie pogingen bij ratten, kan het slagingspercentage van subclavia ader punctie in muizen aanzienlijk worden verbeterd. Zorg ervoor dat de exacte punctie locatie is gewoon caudale naar het midden van de clavicula bot. De naald bewegende opwaartse en craniale naar de superieure sternale Fossa zijn andere belangrijke punten om een succesvolle punctie te garanderen.
Tot slot, subclavia ader punctie is een veilige en effectieve methode voor bloedafname bij muizen. Naast staart ader snijden en retro-orbitale plexus bloedafname, deze methode is haalbaar, veilig, en geschikt voor observationele onderzoeken op verschillende tijdstippen in muizen.
Disclosures
Geen verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de toelage van de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China nr. 81670269, nr. 81500355 en nr. 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
