Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקחת דגימות דם. מווריד התת-קלאובי של העכברים
Abstract
העכבר הוא מודל היונקים המוביל ביותר לחקר מחלות אנוש ובריאות האדם. עם זאת, אוסף דגימת דם מעכברים הוא מאתגר בעבודת מחקר. איסוף דם זנב הוא שיטה פופולרית כאשר כמות קטנה של דגימת דם נדרש. עורק מסלולית יכול להיחשב אם כמות גדולה של דם נדרשת אבל זה שיטת איסוף הדם יש בעיות אתיות. לשעבר, הדגמנו את הכדאיות ואת הבטיחות של איסוף דגימת דם באמצעות ניקוב ורידים ריחי בחולדות, וכאן אנו חוקרים אם ניתן להשתמש בשיטה זו בעכברים. אנו מדווחים כי שיטה זו היא בטוחה ומעשית עבור איסוף דם בעכברים. איסוף דם דרך ניקוב הווריד ריחי בעכברים יכול להיות שיטה נוחה בעבודות המחקר היומי.
Introduction
אוסף דגימת דם מעכברים חיוני ברוב מעבדות המחקר. הגישות קונבנציונאלי עבור איסוף הדם בעכברים הוא חיתוך זנב כאשר פחות מ 100 μL של המדגם נדרש1. עם זאת, אם יותר מ-100 μL של דם נדרשים בנקודת זמן לא מסוף, retroorbital, דימום תת הלסת או איסוף דם תת-מנטלי הם הנפוצים ביותר טכניקות2. במקרים מסוימים, צנתור וריד הצוואר דרך חתך כירורגי אומץ כשיטה חלופית3.
למרות זאת, השיטות שלעיל מזיקות לעכברים. למיטב ידיעתנו, שיטת הרטרוביטל אינה מתקבלת באופן נרחב בשל הסיכון הפוטנציאלי לסיבוכים4,5. טראומה קשורה למבצע לא מתרחשת רק באזור הנראה6,7, אלא גם עמוק בתוך המסלול6. חוץ מזה, אוסף דם תת הלסת הוא מלחיץ8 ויכול להיות משויך דימום מופרז2,9. בהתבסס על המחקר הקודם שלנו10,11, כאן אנו מציגים אסטרטגיה חדשה עבור איסוף דם מווריד ריחי בעכברים. הבטיחות, הכדאיות והשגת נפח הדם עם טכניקה זו מוצגים ודנים.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה המרכזית הדרומית לחקר בעלי חיים מבית החולים השני Xiangya (צ'אנג-שא, סין). כתב היד הוכן בהתאם להגעת (מחקר בעלי חיים: דיווח על ניסויים בVivo) הנחיות12.
1. חומר ובעלי חיים
- הכנת החומרים הדרושים: 75% אתנול, סרט דביק, סוכן אפילטינג, 2 מ"ל שפופרת, 1.0 mL מזרק מחובר עם מחט (26G), סולם אלקטרוני, הפארין ותמיסת מלח (ראה טבלת חומרים).
- בעלי חיים: להכין 10 עכברים קונמינג, 6-8 בן שבועות ושקילה 34.7-28.3 g (ראה טבלת חומרים). שמור על עכברים בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה13.
2. מיצוב בעלי חיים והרדמה
- שוקלים את העכבר כדי לחשב את המינון הנדרש של סוכן הרדמה.
- הכנס נתרן פנטוברביטל (60 mg/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך הצפק כדי לגרום הרדמה כללית14 (איור 1). להחיל משחה העין סטרילי בתחילת ההליך כדי למנוע נזק לעיניים חשופות.
הערה: עכברים נחשבים להיות מורדם מספיק כאשר מראים שום תגובה מוטורית לבדיקה של רפלקס נסיגה הדוושה, צביטה בזנב, או לצבוט בעור הבטן. - מניחים את העכבר בטבלת הפעולות במיקום פרקדן ו 2-4 ס מ רחוק מקצה השולחן כדי להקל על ניקוב וריד (איור 2). תקן את הגפיים במצב נוח כפי שמוצג באיור 2. אין צורך בצנרור או באוורור מכני בתהליך כולו.
- החלת הסוכן אפילטינג סביב החלל הגדול עם ספוגית כותנה.
- שלוש דקות מאוחר יותר, לשטוף את הסוכן האפיגטיבי עם מנקה כותנה רטובה כדי להסיר את הפרווה וכל לכלוך גלוי.
- לחטא את החלל הגדול עם 75% אתנול ואז יבש עם גזה נקייה.
3. ניקוב והפקלבי ואיסוף דם
- זהה את המיקום של עצם הבריח ופוסות מעולה עם אצבע.
- אתר את אתר הניקוב קרוב לאמצע עצם הבריח ולקדאל. הניחו את האצבע השמאלית לרוחב למקום הניקוב כדי לתקן את העור ואת הרקמה התת עורית (איור 3).
- הזיזו את המחט כלפי מעלה וכלפי הגולגולת לפוסות הסטראלי העליונות. ברגע שהמחט נכנסת לרקמה התת עורית, הזז את האצבע הטבעת של יד ימין לאחור כדי ליצור לחץ שלילי (איור 3).
הערה: במהלך שלב זה, המיקום של האופרטור ́s יד ימין צריך להיות מעט נמוך יותר מאשר טבלת הפעולה כדי להפוך את המחט לנוע כלפי מעלה מעולה למישור האופקי. זו הסיבה שהחיה ממוקמת. ליד קצה השולחן - להעביר את המזרק קדימה 3-4 מ"מ אבל לעצור אם אין ניקוז דם לתוך המזרק. ואז לאט למשוך לאחור את המזרק ולשמור על לחץ שלילי בו. ברוב המקרים, הדם היה נכנס. למזרק כאשר הוא מושך לאחור
- ברגע שהדם נכנס למזרק, תקן את המזרק ושמור על לחץ שלילי עד שעוצמת הקול הדרושה (200 μL) של הדם נאספה במזרק.
- לאחר איסוף הדם, למשוך את המחט ניקוב, ולחץ על האתר ניקוב עם משטח כותנה מעט 1-2 דקות כדי להפסיק את הדימום. ואז, עכברים להחזיר לכלוב.
הערה: לעיתים לא ניתן היה להשיג את הדם בניסיון הראשון. התאם את כיוון המחט לכיוון ההפוך וחזור על שלבים 3.3-3.5. אם 3 ניסיונות להיכשל להשיג דגימת דם, לעבור לצד השני. - העבירו את דגימת הדם. לתוך צינור הסוכר
4. עכברים שחזור
- בעוד ההרדמה פנטוברביטל הוא בתוקף, מהירות התאוששות על ידי מתן תמיכה בחום עד העכבר נע שוב.
Representative Results
חזרנו על הליך זה 10 העכברים בקונמינג (זכר n = 5, נקבה n = 5, משקל 25.4 ± 2.0 g). תשע הליכים הצליחו בצד ימין. מקרה אחד נכשל בתוך 3 ניסיונות בצד ימין ואיסוף הדם הצליחו בצד שמאל. קורס הזמן (מתוך ניקוב להשגת נפח הדם הנדרש) נע בין 35-126 שניות (ממוצע 68.4 ± 26.4 s). נפח איסוף הדם הוגדר כ סביב 200 μL (ממוצע 203 ± 11.6 μL). איסוף הדם הצליח בתוך 1 עד 4 ניסיונות. דגימת הדם הצליחה בניסיון הראשון בשני עכברים ולאחר 4 נסיונות בעכבר אחד; הדגימה לקחה 2-3 ניסיונות בעכברים האחרים. כל הנתונים היו מומחש בטבלה 1. כל החיות שרדו והתאוששו תוך 30 דקות לאחר דגימת הדם. לא היה הבדל משמעותי בין המינים לכל הפרמטרים הנצפים (שולחן 1).
איור 1 : הרדמה כללית באמצעות זריקת הצפק אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : את המיקום פרקדן של העכבר. שימו לב שהמרחק בין השוליים לבין העכבר הוא 2-4 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : אתר הניקוב ותנוחת הידיים של המפעיל. שים לב שאצבע הטבעת של יד ימין נעה אחורה כדי ליצור לחץ שלילי. היד השמאלית ממוקמת לרוחב לאתר הניקוב כדי לתקן את העור ורקמות תת עורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : מיקומו של הווריד התת-קלאובי. עצם הבריח ופוסות מעולה ומנקז לתוך הווריד העליון. מתחת לפוסות מעולה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : הקשר בין קיר כלי הקיבול למחט במהלך הניתוח. (א) קירות וריד המשנה מתחברים זה לזה כשהמחט נעה קדימה, כך שלא ניתן יהיה לשאוב דם. (ב) תוך הסגת המחט לאחור, הקירות נפרדים זה מזה והדם יכול להיות מצויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שתנה | סה כ (n = 10) | זכר (n = 5) | נקבה (n = 5) | ערך P |
| משקל גוף (גר') | 25.3 ± 2.2 | 25.3 ± 3.0 | 25.4 ± 1.3 | 0.926 |
| נפח דם (μL) | 203.0 ± 11.6 | 208 ± 13.0 | 198 ± 8.4 | 0.187 |
| קורס (ים) | 68.4 ± 26.4 | 70.6 ± 35.1 | 66.2 ± 18.0 | 0.809 |
| שיכות | 2.3 ± 0.9 | 2.4 ± 1.1 | 2.2 ± 0.8 | 0.760 |
| לא היו הבדלים משמעותיים המין עבור כל הפרמטרים נצפתה, כל ערך P > 0.05. | ||||
שולחן 1: הפרמטרים הנצפים בין המינים
Discussion
דו ח זה מייצג הרחבה של מחקר קודם על דגימת דם דרך ניקוב הווריד התת-קלאובי בחולדות11. כמו העכבר הוא חיה המחקר הנפוץ ביותר, זה יהיה יקר לראות אם טכניקה זו ניתן גם להחיל על עכברים. האתגר נובע מהקוטר הקטן יחסית של הווריד התת-קלאובי.
במחקר הנוכחי, מצאנו כי ניקוב ריחי בעכברים היא דרך אפשרית ואמינה לאסוף דם. לעומת השיטות הקונבנציונליות כגון חיתוך וריד הזנב או איסוף דם מסלולית, אין בעיות אתיות של השיטה הנוכחית. כל החיות שרדו לאחר הליך זה ללא תוספי נוזלים לאחר כ 200 μL של חילוץ הדם, ובעלי חיים יכולים לשמש למחקרים ניסיוניים נוספים. תיאורטית, מיצוי הנפח הכולל לדוגמה לא הצליח להגיע ליותר מ -10% מנפח הדם במחזור הכולל בכל פעם והנפח הכולל של בעל חיים מבוגר הוא 55 ל70 mL/ק"ג משקל גוף5. עבור העכברים המשמשים במחקר זה (34.7-28.3 g), החילוץ המקסימלי העוצמה צריך להיות סביב 200 μL. כך אנו להגדיר את כמות דגימת הדם סביב 200 μL עבור כל עכבר. חוסר היכולת למדוד לחץ דם, קצב הלב, ופרמטרי מתח אחרים הם המגבלות העיקריות של דו ח זה.
הרדמה כללית מספיקה היא עוד בעיה חשובה כדי להבטיח את הצלחת הניקוב. העכברים צריכים להישאר שקטים במהלך הליך הניקוב כדי למנוע את הסיכון של פגיעה בכלי על ידי המחט. מצאנו כי פנטוברביטל נתרן ב 60 מ"ג/ק"ג להרדמה כללית יכול לספק עומק אידיאלי של הרדמה. חיסרון של סוכן זה הוא זמן ההחלמה הארוך יחסית (בממוצע כ -30 דקות). במוסדות מסוימים משתמשים באינהלציה לזמן קצר, ויש לקחת בחשבון את האפשרות לקבל הרדמה חלופית15.
המיקום של וריד ריחי מוצג באיור 4. בגלל הקיר הדק והלחץ הנמוך בווריד, הקיר הקדמי והאחורי של הווריד ריחי היה לצרף אחד את השני תחת לחץ של מחט בזמן המחט הוא נע קדימה (איור 5a). בזמן הסגת הבוכנה באיטיות, הקירות המחוברים יפרידו באופן ספונטני, וקצה המחט יכול לחדור לתוך המזרק האמיתי של כלי הדם והדם, והוא יכול לנקז את מזרק תחת לחץ שלילי מתמשך (איור 5B). שימוש של מערכת איסוף דם ואקום16 אולי גם לטובת איסוף הדם. בשל הקוטר הקטן יחסית של העכברים התת-כהאליים, עלולים להיות כישלונות אפילו עבור מפעיל מנוסה. לטירון, אנחנו ממליצים על ניקוב. ורידים בחולדות שדווחו על11 לאחר מספר ניסיונות ניקוב מוצלח בחולדות, שיעור ההצלחה של ניקוב הווריד ריחי בעכברים יכול להיות משופר באופן משמעותי. ודא כי המיקום ניקוב מדויק הוא רק caudal באמצע עצם הבריח. המחט נעה כלפי מעלה והגולגולת לפוסה מעולה הם נקודות מפתח אחרות כדי להבטיח ניקוב מוצלח.
לסיכום, ניקוב וריד ריחי הוא שיטה בטוחה ויעילה עבור איסוף דם בעכברים. פרט לחיתוך וריד הזנב, רטרו-מסלולית אוסף דם, שיטה זו היא אפשרית, בטוח, מתאים מחקרים תצפית בכמה נקודות זמן בעכברים.
Disclosures
. אף אחד לא הוכרז
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המענק של הקרן הלאומית למדע הטבע של סין No. 81670269, מס ' 81500355 ו-No 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
