Summary
यहाँ, हम चूहों के अधोजत्रुक नस से रक्त के नमूने लेने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
माउस मानव रोग और मानव स्वास्थ्य के अध्ययन के लिए अग्रणी स्तनधारी मॉडल है । हालांकि शोध कार्य में चूहों से रक्त का नमूना संग्रह चुनौतीपूर्ण है । पूंछ रक्त संग्रह एक लोकप्रिय तरीका है जब रक्त के नमूने की एक छोटी राशि की जरूरत है । नेत्रगुहा धमनी पर विचार किया जा सकता है अगर रक्त की एक बड़ी राशि की जरूरत है, लेकिन इस रक्त संग्रह विधि नैतिक मुद्दों है । पूर्व में, हम चूहों में अधोजत्रुक नस पंचर के माध्यम से रक्त नमूना संग्रह की व्यवहार्यता और सुरक्षा का प्रदर्शन किया, और यहाँ हम इस विधि चूहों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि जांच । हम रिपोर्ट करते हैं कि यह तरीका चूहों में रक्त संग्रह के लिए सुरक्षित और व्यावहारिक है । चूहों में अधोजत्रुक नस पंचर के माध्यम से रक्त संग्रह दैनिक अनुसंधान कार्यों में एक सुविधाजनक तरीका हो सकता है ।
Introduction
अधिकांश शोध प्रयोगशालाओं में चूहों से रक्त नमूना संग्रह आवश्यक है । चूहों में रक्त संग्रह के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण पूंछ काटने जब नमूना की तुलना में कम १०० μL है1की जरूरत है । हालांकि, यदि एक गैर टर्मिनल समय बिंदु पर १०० μL से अधिक रक्त की आवश्यकता होती है, तो retroकक्षीय, अवअधोहनुज रक्तस्राव या submental रक्त संग्रह सबसे अधिक माना जाता है तकनीक2। कुछ अवसरों में, सर्जिकल चीरा के माध्यम से जुगुलर शिरा कैकैटेराइजेशन को वैकल्पिक विधि3के रूप में अपनाया गया था ।
इसके बावजूद उपरोक्त तरीके चूहों के लिए नुकसानदेह हैं । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, retroorbital विधि जटिलताओं के संभावित जोखिम के कारण व्यापक रूप से स्वीकार नहीं किया है4,5. ऑपरेशन से संबंधित आघात न केवल दृश्य क्षेत्र6,7में होता है, बल्कि6कक्षा के भीतर भी गहरा होता है । इसके अलावा, अवअधोहनुज रक्त संग्रह8 तनावपूर्ण है और अत्यधिक रक्तस्राव2,9के साथ जुड़ा हो सकता है । हमारे पूर्व अनुसंधान के आधार पर10,11, यहां हम चूहों में अधोजत्रुक नस से रक्त संग्रह के लिए एक नई रणनीति का परिचय । सुरक्षा, व्यवहार्यता, और इस तकनीक के साथ प्राप्त रक्त की मात्रा प्रस्तुत कर रहे है और चर्चा की ।
Protocol
इस अध्ययन को केंद्रीय दक्षिण विश्वविद्यालय एथिक्स कमेटी फॉर एनिमल रिसर्च ने द्वितीय Xiangya अस्पताल (चांग्शा, चीन) से अनुमोदित किया । पांडुलिपि आने के अनुसार तैयार किया गया था (पशु अनुसंधान: Vivo में प्रयोग की रिपोर्टिंग) दिशानिर्देश12.
1. सामग्री और पशु
- आवश्यक सामग्री तैयार करें: ७५% इथेनॉल, चिपकने वाला टेप, एपिलेट एजेंट, 2 मिलीलीटर ट्यूब, १.० मिलीलीटर सिरिंज सुई (26G), इलेक्ट्रॉनिक स्केल, हेपरिन और नमकीन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ जुड़े ।
- पशु: 10 कुनमिंग चूहों, 6-8 सप्ताह पुराने और वजन 21.6-283 जी तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) । देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार चूहों को बनाए रखने13.
2. संज्ञाहरण और पशु पोजिशनिंग
- चतनाशूंय करनेवाली औषधि एजेंट की आवश्यक खुराक की गणना करने के लिए माउस तौलना ।
- सामान्य संज्ञाहरण14 (चित्र 1) को प्रेरित करने के लिए intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से सोडियम pentobarbital (६० मिलीग्राम/किलो) इंजेक्शन । प्रक्रिया के शुरू में एक बाँझ आँख स्नेहन मरहम लागू आंखों को नुकसान को रोकने के लिए ।
नोट: चूहों पेडल निकासी पलटा, पूंछ चुटकी, या पेट की त्वचा चुटकी के परीक्षण के लिए कोई मोटर प्रतिक्रिया दिखाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनीकृत माना जाता है. - आपरेशन टेबल में एक लापरवाह स्थिति में माउस प्लेस और 2-4 सेमी दूर मेज के किनारे से नस पंचर की सुविधा के लिए (चित्रा 2) । पैरों को एक आरामदायक स्थिति में ठीक करें जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है । पूरी प्रक्रिया में कोई इंटुबेशन या मैकेनिकल वेंटिलेशन की जरूरत नहीं है ।
- एक कपास झाड़ू के साथ अवलावकीय अंतरिक्ष के आसपास एपिलेटिंग एजेंट लागू करें ।
- तीन मिनट बाद, एक गीली कपास झाड़ू के साथ एपिलेट एजेंट धोने के लिए फर और किसी भी दिखाई गंदगी को दूर ।
- ७५% इथेनॉल के साथ अवलाकालीय अंतरिक्ष जीवाणुरहित और फिर साफ धुंध के साथ सूख ।
3. subclavian नस पंचर और रक्त संग्रह
- हंसली हड्डी और सुपीरियर स्टर्नल खात एक उंगली के साथ की स्थिति की पहचान ।
- हंसली हड्डी के बीच के पास पंचर साइट का पता लगाएँ और यह करने के लिए पुच्छ. त्वचा और चमड़े के नीचे ऊतक (चित्र 3) को ठीक करने के लिए बाईं अनुक्रमणिका उंगली को पंचर साइट पर पार्श्व रखें ।
- सुई को ऊपर की ओर और क्रैनसारिता से सुपीरियर स्टर्नल खात में ले जाएँ । एक बार जब सुई चमड़े के नीचे ऊतक में प्रवेश करती है, तो दाहिने हाथ की अनामिका को पीछे की ओर ले जाकर ऋणात्मक दाब बनाती है (चित्र 3) ।
नोट: इस चरण के दौरान, ऑपरेटर के दाहिने हाथ की स्थिति आपरेशन तालिका की तुलना में थोड़ा कम होना चाहिए करने के लिए सुई ऊपर की ओर ले जाने और क्षैतिज विमान के लिए बेहतर बनाने के लिए । यही कारण है कि जानवर मेज के किनारे के पास रखा गया है । - सिरिंज आगे 3-4 मिमी ले जाएँ, लेकिन अगर वहाँ सिरिंज में कोई रक्त नाली है बंद करो. फिर धीरे से सिरिंज को वापस ड्रा करें और उसमें निगेटिव प्रेशर रखें । ज्यादातर मौकों में वापस ड्राइंग करने पर खून सिरिंज में घुस जाता था ।
- एक बार रक्त सिरिंज में प्रवेश करती है, सिरिंज को ठीक करने और रक्त की आवश्यक मात्रा (२०० μL) सिरिंज में एकत्र किया जाता है जब तक नकारात्मक दबाव बनाए रखने.
- रक्त संग्रह के बाद, पंचर सुई वापस लेने, और 1-2 मिनट के लिए एक कपास झाड़ू थोड़ा के साथ पंचर साइट खून बह रहा रोकने के लिए दबाएं । इसके बाद चूहों को पिंजरे में लौटाएं ।
नोट: कभी-कभार, एक अपने पहले प्रयास में रक्त प्राप्त नहीं कर सका । सुई laterally की दिशा को समायोजित करें और दोहराएँ कदम 3.3-3.5. यदि 3 प्रयास करने के लिए रक्त का नमूना प्राप्त करने में विफल, दूसरी तरफ स्विच । - एक heparinized ट्यूब में रक्त के नमूने हस्तांतरण ।
4. चूहों वसूली
- जबकि pentobarbital संज्ञाहरण प्रभाव में है, जब तक माउस फिर से बढ़ रहा है गर्मी समर्थन प्रदान करके गति वसूली ।
Representative Results
हम 10 कुनमिंग चूहों में इस प्रक्रिया को दोहराया (पुरुष n = 5, महिला n = 5, वजन २५.४ ± २.० g) । नौ प्रक्रियाएं सही दिशा में सफल हुईं । एक मामला सही पक्ष में 3 प्रयासों के भीतर विफल रहा है और रक्त संग्रह बाईं ओर सफल रहा । समय कोर्स (पंचर से आवश्यक रक्त की मात्रा प्राप्त करने के लिए) 35-126 सेकंड (औसत ६८.४ ± २६.४ एस) के बीच लेकर । रक्त संग्रह की मात्रा लगभग २०० μL (औसत २०३ ± ११.६ μL) के लिए सेट किया गया था । 1 से 4 प्रयासों के भीतर रक्त संग्रह सफल रहा । रक्त नमूना दो चूहों में पहली कोशिश पर सफल रहा और एक माउस में 4 प्रयास के बाद; नमूनाकरण ने अन्य चूहों में 2-3 प्रयास किए । सभी आंकड़े सारणी 1में दर्शाए गए हैं । खून की सैंपलिंग के बाद 30 मिनट के भीतर सभी जानवर बच गए और बरामद हुए । सभी स्वीकार्य पैरामीटर्स (तालिका 1) के लिए लिंगों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था ।
चित्रा 1 : Intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से सामान्य संज्ञाहरण इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : चूहे की लापरवाह स्थिति । नोट हाशिया और माउस के बीच की दूरी 2-4 सेमी है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : पंचर साइट और ऑपरेटर के हाथों की मुद्रा । ध्यान दें कि दाहिने हाथ की रिंग फिंगर नकारात्मक दबाव बनाने के लिए पीछे की ओर घूमती है । त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतकों को ठीक करने के लिए बाएं हाथ को पंचर साइट के पार्श्व में रखा गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 : अधोजत्रुक नस, हंसली हड्डी और सुपीरियर स्टर्नल खात के स्थान । सबक्लेनेवियाई शिरा, हंसली अस्थि के नीचे तथा नालियों को सुपीरियर स्टर्नल खात के नीचे बेहतर वेना कावा में प्रवाहित करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : प्रक्रिया के दौरान पोत दीवार और सुई के बीच संबंध । (क) उपक्लोनेवियाई शिरा की दीवारें एक-दूसरे से संलग्न होती हैं क्योंकि सुई आगे की ओर बढ़ती है, इसलिए कोई रक्त बाहर नहीं निकाला जा सकता । (ख) सुई को पीछे हटाने के दौरान, दीवारें एक-दूसरे से अलग हो जाती हैं और रक्त बाहर निकाला जा सकता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
| चर | कुल (n = 10) | पुरुष (n = 5) | मादा (n = 5) | P मान |
| शरीर के वजन (जी) | २५.३ ± २.२ | २५.३ ± ३.० | २५.४ ± १.३ | ०.९२६ |
| रक्त की मात्रा (μL) | २०३.० ± ११.६ | २०८ ± १३.० | १९८ ± ८.४ | ०.१८७ |
| समय कोर्स (s) | ६८.४ ± २६.४ | ७०.६ ± ३५.१ | ६६.२ ± १८.० | ०.८०९ |
| निकासी | २.३ ± ०.९ | २.४ ± १.१ | २.२ ± ०.८ | ०.७६० |
| सभी स्वीकार्य पैरामीटर्स के लिए कोई महत्वपूर्ण लिंग अंतर नहीं थे, सभी P मान > 0.05 । | ||||
तालिका 1: लिंगों के बीच पैरामीटर्स का अवलोकन किया
Discussion
यह रिपोर्ट चूहों में11अधोजत्रुक नस पंचर के माध्यम से रक्त नमूने पर पिछले अनुसंधान के विस्तार का प्रतिनिधित्व करता है । माउस के रूप में सबसे अधिक इस्तेमाल किया अनुसंधान जानवर है, यह देखने के लिए अगर इस तकनीक को भी चूहों के लिए लागू किया जा सकता है मूल्यवान होगा । चुनौती अधोजत्रुक नस के अपेक्षाकृत छोटे व्यास से आता है ।
वर्तमान अनुसंधान में, हमने पाया कि चूहों में अधोजत्रुक पंचर रक्त इकट्ठा करने के लिए एक व्यवहार्य और विश्वसनीय तरीका है । पूंछ नस काटने या कक्षीय रक्त संग्रह के रूप में पारंपरिक तरीकों की तुलना में, वहां वर्तमान विधि के कोई नैतिक मुद्दों रहे हैं । लगभग २०० μL रक्त निष्कर्षण के बाद तरल की खुराक के बिना इस प्रक्रिया के बाद सभी जानवरों बच गया, और पशुओं आगे प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सैद्धांतिक रूप से, कुल नमूना मात्रा निष्कर्षण कुल परिसंचारी रक्त की मात्रा प्रत्येक समय और एक वयस्क जानवर की कुल मात्रा का 10% से अधिक तक नहीं पहुंच सकता है ५५ ७० मिलीलीटर/ इस शोध में इस्तेमाल चूहों के लिए (21.6-283 जी), अधिकतम मात्रा निष्कर्षण के आसपास होना चाहिए २०० μL. हम इस प्रकार प्रत्येक माउस के लिए २०० μL के आसपास रक्त नमूना राशि सेट । रक्तचाप को मापने में असमर्थता, दिल की दर, और अन्य तनाव मापदंडों इस रिपोर्ट की मुख्य सीमाएं हैं.
पर्याप्त सामान्य संज्ञाहरण एक और महत्वपूर्ण मुद्दा पंचर की सफलता की गारंटी है । चूहों को पंचर की प्रक्रिया के दौरान चुप रहना चाहिए ताकि सुई द्वारा पोत को घायल करने के जोखिम से बचा जा सके । हमने पाया है कि pentobarbital सोडियम पर ६० मिलीग्राम/किलोग्राम सामान्य संज्ञाहरण के लिए संज्ञाहरण की आदर्श गहराई को पूरा कर सकता है । इस एजेंट के एक नकारात्मक पक्ष अपेक्षाकृत लंबी वसूली समय है (लगभग 30 मिनट के औसत) । कुछ संस्थानों में, isoflurane सांस लेना कम वसूली समय के लिए प्रयोग किया जाता है और एक वैकल्पिक संज्ञाहरण विकल्प के रूप में विचार में लिया जाना चाहिए15।
अवक्लेनेवियाई शिरा का स्थान चित्र 4में दर्शाया गया है । पतली दीवार और नस में कम दबाव की वजह से, पूर्वकाल और पीछे की दीवार अधोजत्रुक नस एक सुई के दबाव में एक दूसरे को देते हैं, जबकि सुई आगे बढ़ रहा है (चित्र 5a) । प्लंजर को पीछे की ओर निकालते समय, संलग्न दीवारें अनायास ही अलग हो जाएंगी, और सुई की नोक पोत की सही गुहा में प्रवेश कर सकती है और रक्त सिरिंज में निरंतर ऋणात्मक दाब के नीचे बह सकता है (चित्र 5B) । एक वैक्यूम रक्त संग्रह प्रणाली16 का उपयोग भी रक्त संग्रह एहसान हो सकता है । चूहों अधोजत्रुक नस के अपेक्षाकृत छोटे व्यास के कारण, वहां भी एक अनुभवी ऑपरेटर के लिए विफलताओं हो सकता है । एक नौसिखिया के लिए, हम चूहों में अधोजत्रुक नस पंचर की सिफारिश के रूप में11की सूचना दी । चूहों में कई सफल पंचर प्रयास के बाद, चूहों में अधोजत्रुक नस पंचर की सफलता दर काफी बढ़ाया जा सकता है । सुनिश्चित करें कि सही पंचर स्थान बस हंसली हड्डी के बीच में पुच्छ है । ऊपर की ओर और बेहतर स्टर्नल खात करने के लिए कपाल चलती सुई अंय महत्वपूर्ण बिंदुओं के लिए एक सफल पंचर गारंटी रहे हैं ।
अंत में, अधोजत्रुक नस पंचर चूहों में रक्त संग्रह के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी तरीका है । पूंछ नस काटने और रेट्रो-कक्षीय जाल रक्त संग्रह के अलावा, इस विधि संभव है, सुरक्षित, और चूहों में कई समय बिंदुओं पर अवलोकन शोधों के लिए उपयुक्त है ।
Disclosures
किसी ने घोषित नहीं किया ।
Acknowledgments
इस काम को चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन नंबर ८१६७०२६९, नंबर ८१५००३५५ और नंबर ८१५००२२६ से मिलने वाले ग्रांट ने सपोर्ट किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
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