Summary
여기서, 우리는 마우스의 쇄 골 정 맥 으로부터 혈액 샘플을 채취 하는 프로토콜을 제시 한다.
Abstract
마우스는 인간의 질병과 인간의 건강을 연구 하기 위한 가장 중요 한 포유류 모델입니다. 그러나, 쥐에서 혈액 샘플 수집은 연구 작업에서 도전적입니다. 꼬리 혈액 수집은 소량의 혈액 샘플이 필요할 때 인기 있는 방법입니다. 많은 양의 혈액이 필요 하지만이 혈액 수집 방법은 윤리적 문제가 있는 경우 궤도 동맥을 고려할 수 있습니다. 이전에는 쥐에서 쇄 골 정 맥 천자를 통해 혈액 샘플 수집의 타당성과 안전성을 입증 했으며, 여기에서이 방법이 쥐에 사용 될 수 있는지 여부를 조사 합니다. 이 방법은 생쥐의 혈액 채취에 안전 하 고 실용적 이라고 보고 합니다. 생쥐의 쇄 골 정 맥 천자를 통한 혈액 채취는 일상적인 연구 작업에서 편리한 방법이 될 수 있다.
Introduction
마우스에서 혈액 샘플 수집은 대부분의 연구 실험실에서 필수적입니다. 마우스에서 혈액 수집을 위한 종래의 접근법은 샘플의 100 µ L 미만이 필요한 경우 꼬리 절단이 필요하다. 그러나, 비 말단 시간 지점에서 혈액의 100 µ L 이상이 요구 되는 경우에, 레트로바이러스, 턱 밑 출혈 또는 정신 혈액 수집은 가장 일반적으로 고려 되는 기술2입니다. 어떤 경우에, 외과 적 절 개를 통한 경 정 맥 도관은 대안적인 방법3으로 채택 되었다.
그럼에도 불구 하 고, 상기 방법은 생쥐에 게 유해 합니다. 우리의 지식의 최고에, 레트로 궤도 방법은 합병증의 잠재적인 위험 때문에 널리 받아들여지지 않는다4,5. 수술 관련 외상은 가시 영역 (6)에서 발생 뿐만 아니라, 깊이 궤도 내에서6. 게다가, 턱 아래 혈액 수집은 스트레스가8 이 고 과도 한 출혈2,9와 관련 될 수 있습니다. 우리의 이전 연구10,11에 기초 하 여, 여기에 우리는 쥐에 있는 쇄 골 정 맥에서 혈액 수집을 위한 새로운 전략을 소개 합니다. 이 기술을 사용 하 여 안전, 타당성 및 얻은 혈액 부피를 제시 하 고 논의 합니다.
Protocol
이 연구는 두 번째 시앙 야 병원 (중국 창사)에서 동물 연구를 위한 중앙 남 대학교 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 원고는 도착 (동물 연구: 생체 내 실험의 보고) 가이드라인12에 따라 제조 하였다.
1. 재료와 동물
- 필요한 재료를 준비 하십시오: 75% 에탄올, 접착 테이프, 제 모기, 2ml 튜브, 1.0 주사기 (26G), 전자 저울, 헤 파 린 및 생리 식 염 수가 연결 되어 있습니다 ( 재료 표참조).
- 동물: 6-8 주, 쿤밍 쥐 10 개를 준비 하 고, 무게 21.6g( 재료 표참조) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 따라 마우스를 유지13.
2. 마 취 및 동물 포지셔닝
- 마 취 제의 필요한 복용량을 계산 하기 위해 마우스를 무게.
- 전신 마 취를 유도 하기 위해 복 강 내 주사를 통해 나트륨 pentobarbital (60 mg/kg)을 주입 한다 (도 1). 노출 된 눈에 손상을 방지 하기 위해 절차의 시작 부분에 무 균 눈 윤 활 연 고를 적용 합니다.
참고: 마우스는 페달 철수 반사, 꼬리 핀치, 또는 복 부 피부 핀치의 테스트에 모터 반응을 표시 하지 않는 경우 충분히 마 취 되는 것으로 간주 됩니다. - 마우스를 작업 테이블에 배치 하 고 테이블 가장자리에서 2-4 센티미터 떨어진 곳에서 정 맥 천자를 용이 하 게 합니다 (그림 2). 그림 2와 같이 편안한 자세로 사지를 고정 합니다. 전체 절차에는 삽 관 또는 기계 환기가 필요 하지 않습니다.
- 면봉으로 infraclavicular 공간 주위에 제 모를 바릅니다.
- 3 분 후, 제 모를 젖은 면봉으로 씻은 후 털과 눈에 보이는 먼지를 제거 하십시오.
- Infraclavicular 공간을 75% 에탄올로 소독 한 다음 깨끗 한 거 즈로 말립니다.
3. 쇄 골 정 맥 천자 및 혈액 채취
- 손가락으로 쇄 골 뼈의 위치와 우수한 흉 포를 식별 합니다.
- 쇄 골 뼈의 중간에 가까운 펑크 사이트를 찾아 그것을 꼬리. 피부와 피하 조직을 고정 하기 위해 왼쪽 검지 손가락을 천자 부 위에 놓습니다 (그림 3).
- 바늘을 위로 이동 하 고 뛰어난 흉 골을 향해 크랭크 합니다. 바늘이 피하 조직에 들어가면 오른손의 링 핑거를 뒤로 움직여 부 압을 형성 합니다 (그림 3).
참고:이 단계 동안, 연산자 ´ s 오른손의 위치는 바늘이 수평 평면 보다 위쪽으로 이동 하기 위해 작업 테이블 보다 약간 낮은 해야 합니다. 동물이 테이블의 가장자리 근처에 배치 되는 이유입니다. - 주사기를 앞쪽으로 3-4 mm로 이동 하 되 주사기에 혈액이 배출 되지 않는 경우에는 멈 추 십시오. 그런 다음 주사기를 천천히 다시 그려 음수 압력을 유지 합니다. 대부분의 경우, 혈액은 다시 그릴 때 주사기에 들어갑니다.
- 혈액이 주사기에 들어가면 주사기를 고정 하 고 필요한 양 (200 µ L)이 주사기에 수집 될 때까지 음압을 유지 합니다.
- 혈액 수집 후, 찔린 바늘을 철회 하 고 출혈을 멈추게 하려면 1-2 분 동안 면봉으로 펑크 부위를 누르십시오. 그런 다음 마우스를 케이지에 반환 합니다.
참고: 때때로, 하나는 그/그녀의 첫 번째 시도에서 혈액을 얻을 수 없습니다. 바늘의 방향을 횡 방향으로 조정 하 고 3.3-3.5 단계를 반복 합니다. 3 번의 시도가 혈액 샘플을 얻지 못하면 다른 쪽으로 전환 하십시오. - 혈액 샘플을 혈장 튜브에 옮겨 넣습니다.
4. 생쥐 회복
- Pentobarbital 마 취가 적용 되는 동안 마우스가 다시 움직일 때까지 열 지원을 제공 하 여 회복 속도를 향상 시킵니다.
Representative Results
이 과정을 10 번의 쿤밍 마우스에서 반복 하였다 (남성 n=5, 암컷 n=5, 중량 25.4 ± 2.0 g). 오른쪽에 9 개의 절차가 성공 했습니다. 한 케이스는 오른쪽에 있는 3 개의 시도에서 실패 하 고 혈액 수집은 왼쪽에 성공 했습니다. 시간 과정 (펑크에서 필요한 혈 중 량을 얻기까지)이 35-126 초 (평균 68.4 ± 26.4 s)에 해당 합니다. 혈액 채취 량은 약 200 µ L (평균 203 ± 11.6 µ L)으로 설정 하였다. 혈액 수집은 1 ~ 4 회 시도에 성공 했습니다. 혈액 샘플링은 두 마우스의 첫 번째 시도에 성공 하 고 한 번의 마우스에서 4 시도 후; 샘플링은 다른 마우스에서 2-3 시도를 했다. 모든 데이터는 표 1에 예시 하였다. 모든 동물은 혈액 채취 후 30 분 이내에 생존 하 고 회복 했습니다. 모든 관찰 된 매개 변수에 대 한 남녀 사이에 큰 차이가 없었다 (표 1).
그림 1 : 복 강 내 주사를 통한 전신 마 취 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 마우스의 부정사 위치. 참고: 여백 및 마우스 사이의 거리는 2-4 cm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 펑크 사이트와 운전자 손의 자세. 오른손의 링 핑거는 뒤로 이동 하 여 부 압을 형성 합니다. 왼손은 피부와 피하 조직을 고정 하기 위해 펑크 부 위에 횡 방향으로 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 쇄 골 조류 정 맥의 위치, 골 지 뼈 및 우수한 흉 선 포 사. 쇄 골의 정 맥에 있는 코스는 골 지 뼈 아래에 있으며 수 페리 어 포 사 아래에 있는 수 페리 어에 게 배출 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 시 술 중 용기 벽과 바늘 사이의 관계. (A) 쇄 골 정 맥의 벽은 바늘이 앞으로 이동함에 따라 서로 부착 되므로 혈액이 인출 될 수 없습니다. (B) 바늘을 뒤로 후퇴 시키면서, 벽은 서로 분리 되 고 피는 밖으로 인출 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 변수 | 합계 (n=10) | 수 놈 (n=5) | 암컷 (n=5) | P 값 |
| 본체 중량 (g) | 25.3 ± 2.2 | 25.3 ± 3.0 | 25.4 ± 1.3 | 0.926 |
| 혈액 량 (μ l) | 203.0 ± 11.6 | 208 ± 13.0 | 198 ± 8.4 | 0.187 |
| 시간 코스 | 68.4 ± 26.4 | 70.6 ± 35.1 | 66.2 ± 18.0 | 0.809 |
| 인출 | 2.3 ± 0.9 | 2.4 ± 1.1 | 2.2 ± 0.8 | 0.760 |
| 모든 관찰 된 매개 변수에 대 한 중요 한 성 차이가 없었다, 모든 P 값은 0.05 >. | ||||
표 1: 남녀 간의 관찰 된 매개 변수
Discussion
이 보고서는 쥐 (11)에 있는 쇄 골 정 맥 천자를 통한 혈액 샘플링에 대 한 이전 연구의 확장을 나타낸다. 마우스가 가장 일반적으로 사용 되는 연구 동물 이기 때문에,이 기술은 또한 마우스에 적용 할 수 있는지 확인 하는 것이 가치가 있을 것 이다. 도전은 쇄 골 정 맥의 상대적으로 더 작은 직경에서 옵니다.
본 연구에서, 우리는 쥐에 있는 쇄 골 조류 천자가 혈액을 수집 하는 것이 가능 하 고 신뢰할 수 있는 방법 임을 발견 했습니다. 꼬리 정 맥 절단 또는 궤도 혈액 채취와 같은 종래의 방법과 비교 하 여, 본 방법의 윤리적 문제가 없다. 모든 동물은 혈액 추출의 약 200 µ L 후에 액체 보충 없이이 절차 후에 살아 나 고, 동물은 추가 실험 연구를 위해 이용 될 수 있었습니다. 이론적으로, 총 시료 부피 추출은 총 순환 혈 량의 10% 이상에 도달 하지 못하고 성인 동물의 총 부피는 55 내지 70의 몸 무게 이다. 이 연구에서 사용 된 쥐에 대 한 (21.6-28.3 g), 최대 부피 추출은 약 200 µ L 이어야 한다. 우리는 따라서 각 마우스에 대 한 200 µ L 주위 혈액 샘플링 금액을 설정. 혈압, 심 박수 및 기타 스트레스 매개 변수를 측정 할 수 없다는 것이이 보고서의 주요 제한 사항입니다.
충분 한 전신 마 취는 펑크의 성공을 보장 하는 또 다른 중요 한 문제입니다. 쥐는 바늘에 의해 혈관을 인 발 하는 리스크를 피하기 위하여 펑크 절차 도중 조용히 남아 있어야 합니다. 우리는 pentobarbital 나트륨에서 전신 마 취를 위한 60 밀리 그램/kg의 이상적인 마 취 깊이를 만족 시킬 수 있음을 발견 했습니다. 이 에이전트의 단점은 상대적으로 긴 복구 시간 (평균 약 30 분)입니다. 몇몇 기관에서, 아이 소 루 레인 흡입은 짧은 회복 시간을 위해 이용 되 고 대체 무감각 선택15로 고려 되어야 합니다.
쇄 골 정 맥의 위치는 도 4에 나타내 었 다. 정 맥의 얇은 벽과 저압 때문에, 쇄 골 정 맥의 전방 및 후방 벽은 바늘이 전진 하는 동안 바늘의 압력 하에 서로 부착 됩니다 (그림 5a). 플런저를 천천히 거꾸로 철회 하는 동안, 부착 된 벽은 자발적으로 분리 되 고, 바늘의 끝이 용기의 진정한 공동에 진입 할 수 있었고 혈액은 지속적인 부 압 하에서 주사기로 배출 될 수 있습니다 (그림 5b). 진공 혈액 수집 시스템의 사용16 또한 혈액 수집을 선호 수 있습니다. 생쥐의 쇄 골 정 맥의 직경이 상대적으로 작기 때문에 숙련 된 운전자 에게도 고장이 발생할 수 있습니다. 초보자를 위해, 우리는 보고 된 쥐에 쇄 골 정 맥 천자를 권장11. 쥐에서 여러 성공적인 펑크 시도 후, 쥐에서 쇄 골 정 맥 천자의 성공률은 크게 향상 될 수 있었다. 정확한 천공 위치는 쇄 골 뼈의 중간에 꼬리 있는지 확인. 위쪽으로 움직이는 바늘과 우수한 흉 골에 두개골은 성공적인 펑크를 보장 하는 다른 핵심 포인트입니다.
결론적으로, 쇄 골 정 맥 천자는 생쥐의 혈액 채취를 위한 안전 하 고 효과적인 방법입니다. 꼬리 정 맥 절단 및 복고풍 궤도 신경 총 혈액 수집 외에도이 방법은 실행 가능 하 고 안전 하며 마우스의 여러 시간 지점에서 관측 연구에 적합 합니다.
Disclosures
선언 되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에서 보조금에 의해 지원 되었다 81670269, No. 81500355 및 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
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