Summary
Her presenterer vi en protokoll for å ta blodprøver fra arteria vene av mus.
Abstract
Musen er den fremste pattedyr modellen for å studere menneskelig sykdom og menneskers helse. Imidlertid er blodprøve samling fra mus utfordrende i forskningsarbeid. Hale blod samling er en populær metoden når en liten beløpet av blod eksemplar er behøvde. Orbital arterien kan vurderes hvis en stor mengde blod er nødvendig, men dette blod innsamlings metoden har etiske problemstillinger. Tidligere viste vi gjennomførbarhet og sikkerhet for blodprøve samling gjennom arteria vene punktering i rotter, og her undersøker vi om denne metoden kan brukes i mus. Vi rapporterer at denne metoden er trygg og praktisk for blod samling hos mus. Blod samling gjennom arteria vene punktering i mus kan være en praktisk metode i daglig forskning fungerer.
Introduction
Blodprøve samling fra mus er viktig i de fleste forskningslaboratorier. De konvensjonelle tilnærmingene for blod samling hos mus er hale skjæring når mindre enn 100 μL av prøven er nødvendig1. Men hvis mer enn 100 μL av blod er nødvendig på et nonterminal tidspunkt, retroorbital, submandibular blødning eller submental blod samling er de hyppigst betraktet teknikker2. I noen tilfeller, den hals vene catheterization gjennom et kirurgisk snitt ble vedtatt som en alternativ metode3.
Likevel, de ovennevnte metodene er skadelige for mus. Etter beste viten, er retroorbital metoden ikke allment akseptert på grunn av den potensielle risikoen for komplikasjoner4,5. Operasjon relaterte traumer ikke bare skjer i det synlige området6,7, men også dypt inne i bane6. Dessuten er submandibular blod samling stressende8 og kan være forbundet med overdreven blødning2,9. Basert på vår tidligere forskning10,11, her introduserer vi en ny strategi for blod samling fra arteria vene i mus. Sikkerhet, gjennomførbarhet, og innhentet blod volum med denne teknikken er presentert og diskutert.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Central South University etikk komité for Animal Research fra The Second Xiangya Hospital (Changsha, Kina). Manuskriptet ble utarbeidet etter ankomst (Animal Research: rapportering av in vivo eksperimenter) retningslinjer12.
1. materiale og dyr
- Forbered nødvendige materialer: 75% etanol, teip, epileringshodet middel, 2 mL rør, 1,0 mL sprøyte forbundet med nål (26G), elektronisk skala, heparin og saltvann (se tabell over materialer).
- Dyr: Forbered 10 mus, 6-8 uker gamle og veiing 21.6-28.3 g (se tabell over materialer). Oppretthold mus i samsvar med veiledningen for Stell og bruk av Laboratoriedyr13.
2. anestesi og dyr posisjonering
- Veie musa til å beregne den nødvendige dosen av anestesi middel.
- Injiser natrium pentobarbital (60 mg/kg) gjennom intraperitoneal injeksjon for å indusere generell anestesi14 (figur 1). Påfør en steril øye smøring salve ved starten av prosedyren for å hindre skade på eksponerte øyne.
Merk: mus anses å være tilstrekkelig anesthetized når viser ingen motorrespons på testing av pedalen tilbaketrekking refleks, hale knipe, eller abdominal hud klemme. - Plasser musen i operasjonsbordet i en liggende posisjon og 2-4 cm fra kanten av bordet for å lette vene punktering (figur 2). Fest lemmer i en komfortabel stilling som vist i figur 2. Ingen intubering eller mekanisk ventilasjon er nødvendig i hele prosedyren.
- Påfør epileringshodet agent rundt infraclavicular plass med en bomullspinne.
- Tre minutter senere, vask epileringshodet agent med en våt bomullsdott for å fjerne pelsen og eventuelle synlige smuss.
- Sterilisere infraclavicular plass med 75% etanol og tørk med rent gasbind.
3. arteria vene punktering og blod samling
- Identifiser plasseringen av krageben bein og overlegen sternal Fossa med en finger.
- Finn punktering området nær midten av krageben bein og caudal til det. Sett venstre pekefinger lateral til punktering stedet for å fikse hud og under Huds vev (Figur 3).
- Beveg nålen oppover og cranially mot den overlegne sternal Fossa. Når nålen kommer inn i subkutan vev, Flytt ringfingeren på høyre hånd bakover for å danne negativt trykk (Figur 3).
Merk: under dette trinnet skal posisjonen til operatørens høyre hånd være noe lavere enn operasjonsbordet for å få nålen til å bevege seg oppover og bedre enn det horisontale planet. Det er derfor dyret er plassert nær kanten av bordet. - Beveg sprøyten forover 3-4 mm, men stopp hvis det ikke er noen blod avløp i sprøyten. Deretter trekker du langsomt tilbake sprøyten og holder negativt trykk i den. I de fleste tilfeller vil blodet komme inn i sprøyten når du trekker tilbake.
- Når blodet kommer inn i sprøyten, fest sprøyten og opprettholde negativt trykk til det nødvendige volumet (200 μL) av blod er samlet i sprøyten.
- Etter blod samling, trekke ut punktering nål, og trykk på punktering stedet med en bomullsdott litt i 1-2 minutter for å stoppe blødning. Deretter tilbake mus til buret.
Merk: noen ganger kunne man ikke få blodet på hans/hennes første forsøk. Juster retningen på nålen sideveis og gjenta trinn 3.3-3.5. Hvis 3 forsøk ikke klarer å få blodprøve, Bytt til den andre siden. - Overfør Blodprøven til et heparinisert rør.
4. mus utvinning
- Mens pentobarbital anestesi er i kraft, hastighet utvinning ved å gi varme støtte til musen beveger seg igjen.
Representative Results
Vi gjentok denne prosedyren i 10 Kunming mus (hann n = 5, hunn n = 5, vekt 25,4 ± 2,0 g). Ni prosedyrer lyktes på høyre side. Ett tilfelle mislyktes innen 3 forsøk på høyre side og blod samlingen lyktes på venstre side. Tiden kurset (fra punktering å skaffe nødvendig blod volum) varierte mellom 35-126 sekunder (gjennomsnittlig 68,4 ± 26,4 s). Blod innsamlings volumet ble satt til rundt 200 μL (gjennomsnittlig 203 ± 11,6 μL). Blod samlingen lyktes innen 1 til 4 forsøk. Blood prøvetaking lyktes på det første forsøket i to mus og etter 4 forsøk i én mus; prøvetaking tok 2-3 forsøk på de andre musene. Alle data ble illustrert i tabell 1. Alle dyr overlevde og utvinnes innen 30 minutter etter blodprøve. Det var ingen signifikant forskjell mellom kjønnene for alle observerte parametre (tabell 1).
Figur 1 : Narkose gjennom intraperitoneal injeksjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Den liggende posisjonen til musen. Legg merke til avstanden mellom marg og mus er 2-4 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Punktering området og holdning av operatørens hender. Legg merke til at ringfingeren på høyre hånd beveger seg bakover for å danne negativt trykk. Venstre hånd er plassert lateral til punktering stedet for å fikse hud og under Huds vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Plasseringen av arteria vene, krageben bein og overlegen sternal Fossa. Den arteria vene kurs under krageben bein og avløp i overlegen vena cava under overlegen sternal Fossa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Forholdet mellom fartøyets vegg og nål under inngrepet. (A) veggene i arteria vene feste til hverandre som nålen beveger seg fremover, slik at ingen blod kunne trekkes ut. (B) mens du trekker nålen bakover, kan veggene atskilt fra hverandre og blodet trekkes ut. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Variabel | Totalt (n = 10) | Mann (n = 5) | Kvinne (n = 5) | P-verdi |
| Kroppsvekt (g) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 for alle |
| Blod volum (μL) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 for alle |
| Tidsforløp (r) | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 for alle |
| Uttak | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 for alle |
| Det var ingen vesentlige kjønnsforskjeller for alle observerte parametre, alle P-verdi > 0,05. | ||||
Tabell 1: observerte parametre mellom kjønnene
Discussion
Denne rapporten representerer en forlengelse av tidligere forskning på blod prøvetaking gjennom arteria vene punktering i rotter11. Som musen er den mest brukte forskningen dyr, ville det være verdifullt å se om denne teknikken kan også brukes på mus. Utfordringen kommer fra den relativt mindre diameter på arteria vene.
I dagens forskning, fant vi at arteria punktering i mus er en mulig og pålitelig måte å samle blod. Sammenlignet med konvensjonelle metoder som hale blodåre skjæring eller orbital blod samling, er det ingen etiske problemstillinger av denne metoden. Alle dyrene overlevde etter denne fremgangsmåte uten flytende komplettere etter i nærheten 200 μL av blod trekking, og dyrene det kan brukes for fremme eksperimentelle studier. Teoretisk sett kan den totale prøven volum ekstraksjon ikke nå mer enn 10% av totalt sirkulerende blod volum hver gang og det totale volumet av en voksen dyr er 55 til 70 mL/kg kroppsvekt5. For musene som brukes i denne forskningen (21.6-28.3 g), bør den maksimale volum utvinningen være rundt 200 μL. Vi setter dermed blodprøve beløpet rundt 200 μL for hver mus. Manglende evne til å måle blodtrykk, hjertefrekvens, og andre stress parametre er de viktigste begrensningene i denne rapporten.
Tilstrekkelig generell anestesi er en annen viktig sak å garantere suksessen til punktering. Musene skal forbli stille under punktering prosedyren for å unngå risikoen for å skade fartøyet ved nålen. Vi fant at pentobarbital natrium på 60 mg/kg for generell anestesi kunne tilfredsstille ideell dybde av anestesi. En downside av denne agenten er relativt lang utvinning tid (i snitt ca 30 minutter). I noen institutter, isoflurane inhalasjon brukes til kort utvinning tid og bør tas i betraktning som en alternativ anestesi valg15.
Plasseringen av arteria vene er vist i Figur 4. På grunn av den tynne veggen og lavt trykk i venen, ville den fremre og bakre vegg av arteria vene festes til hverandre under trykket av en nål mens nålen beveger seg fremover (figur 5a). Mens trekke stempelet sakte bakover, vil de vedlagte veggene skille spontant, og tuppen av nålen kunne gå inn i den sanne hulrom i fartøy og blod kan renne inn i sprøyten under vedvarende negativt trykk (figur 5B). Bruk av et vakuum blod innsamlingssystem16 kan også favorisere blod samlingen. På grunn av den relativt lille diameteren på mus arteria vene, kan det være feil selv for en erfaren operatør. For en nybegynner, anbefaler vi arteria vene punktering i rotter som rapportert11. Etter flere vellykkede punktering forsøk på rotter, kan suksessen rate på arteria vene punktering i mus bli betydelig forbedret. Sørg for at den nøyaktige posisjonen til punktering bare caudal til midten av krageben benet. Nålen beveger seg oppover og skallen til overlegen sternal Fossa er andre viktige punkter for å garantere en vellykket punktering.
Avslutningsvis er arteria vene punktering en trygg og effektiv metode for blod samling i mus. I tillegg til hale blodåre skjæring og retro-orbital plexus blod samling, denne metoden er gjennomførbart, trygg, og egnet for observasjons undersøkelser på flere tid poeng i mus.
Disclosures
Ingen deklarert.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av stipendet fra National Natural Science Foundation i China no. 81670269, no. 81500355 og no. 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
