Summary
Burada, fare subklavian ven kan örnekleri almak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Fare insan hastalığı ve insan sağlığını incelemek için en önde gelen memelilerden modeldir. Ancak, farelerden kan numune toplama araştırma çalışmaları zordur. Kuyruk kanı toplama küçük bir miktar kan örneği gerektiğinde popüler bir yöntemdir. Orbital arter kan büyük miktarda gerekli ancak bu kan toplama yöntemi etik konularda düşünülebilir. Eskiden, biz farelerde subklavian ven delinme yoluyla kan numune toplama fizibilite ve güvenlik göstermiştir, ve burada bu yöntemin fareler kullanılabilir olup olmadığını araştırmak. Bu yöntemin farelerde kan toplama için güvenli ve pratik olduğunu bildiriyoruz. Farelerde subklavian ven delinme yoluyla kan toplama günlük araştırma çalışmaları uygun bir yöntem olabilir.
Introduction
Farelerden kan numunesi toplama çoğu araştırma laboratuarında esastır. Farelerde kan toplama için konvansiyonel yaklaşımlar, 100 μL örneğinden az1gerektiğinde kuyruk kesmesi olur. Ancak, terminal dışı bir zaman noktasında 100 μL 'den fazla kan gerekiyorsa, retroorbital, submandibular kanama veya submental kan toplama en yaygın olarak kabul edilen tekniklerdir2. Bazı durumlarda, cerrahi kesi yoluyla juguler ven kateterizasyon alternatif bir yöntem olarak kabul edildi3.
Bununla birlikte, yukarıdaki Yöntemler fareler için zararlı. Bilgimizin en iyisini yapmak için, arkasındaki Yöntem4,5komplikasyonların potansiyel riski nedeniyle yaygın olarak kabul edilmez. Operasyon ile ilgili travma sadece görünür alan6,7, aynı zamanda yörünge6içinde derin olur. Ayrıca, submandibular kan toplama stresli8 ve aşırı kanama ile ilişkili olabilir2,9. Bizim önceki araştırma dayanarak10,11, burada farelerde subklavian ven kan toplama için yeni bir strateji tanıtmak. Bu teknikle güvenlik, fizibilite ve elde edilen kan hacmi sunulmuştur ve tartışılmaktadır.
Protocol
Bu çalışma, Ikinci Xiangya Hastanesi 'nden (Changsha, Çin) Orta Güney Üniversitesi hayvan Araştırmaları Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. El yazması, VARıŞ (Hayvansal araştırmalar: In vivo deneylerinin raporlanması) kuralları12' ye göre hazırlanmıştır.
1. malzeme ve hayvan
- Gerekli malzemeleri hazırlayın: 75% etanol, yapışkan bant, epilasyon ajanı, 2 mL Tüp, 1,0 mL şırınga ile bağlı iğne (26G), elektronik ölçek, heparin ve tuzlu (bkz. malzeme tablosu).
- Hayvanlar: hazırlamak 10 Kunming fareler, 6-8 hafta ve tartmak 21.6-28.3 g ( malzeme tablosunabakın). Laboratuvar hayvanlarının bakım ve kullanımı kılavuzu 'Na uygun olarak fareler koruyun13.
2. anestezi ve hayvan konumlandırma
- Anestezik ajanın gerekli dozajı hesaplamak için fareyi tartın.
- Genel anestezi vermek için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla sodyum pentobarbital (60 mg/kg) enjekte14 (Şekil 1). Maruz kalan gözleri zarar görmesini önlemek için prosedürün başlangıcında steril bir göz yağlama merhem uygulayın.
Not: fareler, pedal çekilme refleks, Kuyruk tutam veya karın cilt tutam test etmek için hiçbir motor yanıtı gösterirken yeterince anestezize olarak kabul edilir. - Fare, ameliyat masasına bir sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve 2-4 cm uzakta damar delinmesi kolaylaştırmak için tablonun kenarından (Şekil 2). Şekil 2' de gösterildiği gibi rahat bir pozisyonda ekstremite düzeltin. Tüm prosedürde herhangi bir entübasyon veya mekanik havalandırma gerekmez.
- Bir pamuklu çubuk ile infraclaviküler boşluk etrafında epilasyon aracı uygulayın.
- Üç dakika sonra, kürk ve görünür kir kaldırmak için bir ıslak pamuk çubuk ile epilasyon Ajan yıkayın.
- İnfraclaviküler alanı 75% etanol ile sterilize edin ve sonra temiz gazlı bez ile kurutun.
3. subklavian ven delinme ve kan toplama
- Köprücük kemik konumunu ve bir parmak ile üstün sternal fossa belirleyin.
- Klavikula kemiğinin ortasına yakın delinme sitesi bulun ve onu kaudal. Deri ve subkutan dokusunu düzeltmek için sol işaret parmağını delinme sitesine lateral koyun (Şekil 3).
- İğneyi yukarı ve kransal olarak üstün sternal fossa doğru taşıyın. İğne subkutan dokusuna girdiğinde, negatif basınç oluşturmak için sağ elin yüzük parmağını geriye doğru hareket ettirin (Şekil 3).
Not: Bu adımda, operatörün sağ elinin konumu, iğne yukarı ve yatay düzlemde üstün hareket etmek için operasyon masasına göre biraz daha düşük olmalıdır. Bu yüzden hayvan masanın kenarına yakın yerleştirilir. - Şırıngayı ileri 3-4 mm 'ye taşıyın ama şırıngaya kan drenajı olmazsa dur. Sonra yavaşça şırınga geri çizin ve içinde negatif basınç tutmak. Çoğu durumda, kan geri çizerken şırınga girer.
- Kan şırıngaya girdiğinde, şırıngayı düzeltin ve şırınga içinde gerekli hacim (200 μL) kan toplanıncaya kadar negatif basıncı koruyun.
- Kan toplama işleminden sonra, delinme iğnesini çekin ve 1-2 dakika boyunca kanamayı durdurmak için bir pamuklu çubukla delinme sitesine basın. Sonra fareler kafese dönün.
Not: Bazen, bir ilk girişimi kan elde olamazdı. İğne yönünü yanal olarak ayarlayın ve 3.3-3.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Eğer 3 girişim kan örneği elde etmek için başarısız olursa, diğer tarafa geçin. - Kan örneğini heparinize bir tüpün içine aktarın.
4. fareler kurtarma
- Pentobarbital anestezi yürürlükte iken, fare tekrar hareket edene kadar ısı desteği sağlayarak hız kurtarma.
Representative Results
Biz 10 Kunming fareler (erkek n = 5, kadın n = 5, ağırlık 25,4 ± 2,0 g) bu prosedürü tekrarladık. Sağ tarafta dokuz prosedür başarılı oldu. Bir vaka, sağ tarafta 3 deneme içinde başarısız oldu ve kan toplama sol tarafta başarılı oldu. Zaman kursu (delinme gelen gerekli kan hacmi almak için) arasında değişmektedir 35-126 saniye (ortalama 68,4 ± 26,4 s). Kan toplama hacmi 200 μL (ortalama 203 ± 11,6 μL) civarında ayarlandı. Kan toplama 1 ila 4 denemeler içinde başarılı oldu. Kan örnekleme iki farede ilk girişimi başarılı ve bir fare 4 girişimleri sonra; örnekleme diğer fareler 2-3 girişimleri aldı. Tüm veriler Tablo 1' de gösterilmiştir. Tüm hayvanlar kan örnekleme sonra 30 dakika içinde hayatta ve kurtarıldı. Gözlenen tüm parametreler için cinsiyeler arasında önemli bir fark yoktu (Tablo 1).
Şekil 1 : İntraperitoneal enjeksiyon Ile genel anestezi Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Mouse 'un sırtüstü pozisyonu. Kenar boşluğu ve fare arasındaki uzaklığı 2-4 cm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 3 : Delinme sitesi ve operatörün elleriyle duruş. Sağ elin yüzük parmağının negatif basınç oluşturmak için geriye doğru hareket ettiğini unutmayın. Sol el deri ve subkutan dokularda düzeltmek için delinme sitesine lateral yerleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Subklavian ven yeri, klavikula kemik ve üstün sternal fossa. Köprücük kemiğinin altındaki subklavian ven kursları ve üstün sternal fossa altında Üstün Vena Cava içine akar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Prosedür sırasında damar duvarı ile iğne arasındaki ilişki. (A) subklavian ven duvarları birbirine iğne ileri hareket olarak eklemek, böylece hiçbir kan çizilmiş olabilir. (B) iğne geri çekilirken, duvarlar birbirlerinden ayrı ve kan çekilmiş olabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Değişken | Toplam (n = 10) | Erkek (n = 5) | Kadın (n = 5) | P değeri |
| Vücut ağırlığı (g) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 |
| Kan hacmi (μL) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 |
| Zaman kursu (lar) | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 |
| Para çekme | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 |
| Gözlenen tüm parametreler için önemli bir cinsiyet farkı yoktu, tüm P değeri > 0.05. | ||||
Tablo 1: cinsiyeler arasında gözlenen parametreler
Discussion
Bu rapor, sıçan11' de subklavian ven delinmesi yoluyla kan örnekleme konusunda önceki araştırmaların bir uzantısını temsil eder. Fare en sık kullanılan araştırma hayvanı olduğu için, bu tekniğin fareler için de uygulanabilir olup olmadığını görmek değerli olacaktır. Zorluk subklavian ven nispeten daha küçük çaplı gelir.
Şu anda araştırmada, farelerde subklavian delinmesi kan toplamak için uygulanabilir ve güvenilir bir yoldur. Kuyruk ven kesme veya orbital kan toplama gibi konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırıldığında, mevcut yöntemin etik sorunları yoktur. Bu prosedürün ardından tüm hayvanlar hayatta kalan sıvı takviyeleri yaklaşık 200 μL kan ekstraksiyon ve hayvanlar daha deneysel çalışmalar için kullanılabilir. Teorik olarak, toplam örnek hacim ekstraksiyon toplam dolaşım kan hacmi her zaman% 10 ' dan fazla ulaşamadı ve bir yetişkin hayvanın toplam hacmi 55 olduğunu 70 mL/kg vücut ağırlığı5. Bu araştırmada kullanılan fareler için (21.6-28.3 g), maksimum hacim ekstraksiyon 200 μL civarında olmalıdır. Böylece her fare için 200 μL civarında kan örnekleme miktarını ayarlayacağız. Kan basıncı, kalp hızı ve diğer stres parametreleri ölçmek için yetersizlik bu raporun ana sınırlamalardır.
Yeterli genel anestezi, delinme başarısını garanti etmek için önemli bir konudur. Fareler, iğne tarafından gemi yaralanması riskini önlemek için delinme prosedürü sırasında sessiz kalmalı. Biz 60 yılında pentobarbital sodyum bulundu genel anestezi için mg/kg anestezi ideal derinlemesine tatmin olabilir. Bu ajanın dezavantajı nispeten uzun iyileşme süresi (yaklaşık 30 dakika ortalaması). Bazı enstitülerde, isofluran inhalasyonu kısa iyileşme süresi için kullanılır ve alternatif anestezi seçimi olarak dikkate alınmalıdır15.
Subklavian ven konumu Şekil 4' te gösterilir. İnce duvar ve damardaki düşük basınç nedeniyle, subklavian ven anterior ve posterior duvara iğne ileri hareket ederken bir iğne basıncı altında birbirine iliştirmek (Şekil 5A). Piston yavaşça geriye doğru çekilirken, bağlı duvarlar kendiliğinden ayrılır ve iğne ucu damar ve kanın gerçek boşluğuna girebilir ve sürekli negatif basınç altında şırınga içine drenaj olabilir (Şekil 5B). Bir vakum kan toplama sisteminin kullanımı16 da kan toplama lehine olabilir. Fareler subklavian ven nispeten küçük çapı nedeniyle, deneyimli bir operatör için bile arızalar olabilir. Bir acemi için,11bildirilen gibi fareler subklavian ven delinme öneririz. Fareler birkaç başarılı delinme girişimleri sonra, farelerde subklavian ven delinme başarı oranı önemli ölçüde geliştirilebilir. Tam delinme konumu sadece köprücük kemik ortasına kaudal olduğundan emin olun. Üstün sternal fossa yukarı ve kranial hareket iğne başarılı bir delinme garanti etmek için diğer önemli noktalarıyla.
Sonuç olarak, subklavian ven delinme fareler kan toplama için güvenli ve etkili bir yöntemdir. Kuyruk ven kesme ve Retro orbital plekkana kan toplama yanı sıra, bu yöntem, uygulanabilir, güvenli ve farelerde birkaç zaman noktalarında gözlemsel araştırmalar için uygundur.
Disclosures
Hiç bildirilmedi.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin No. 81670269, No. 81500355 ve No. 81500226 Ulusal Doğal Bilim Vakfı 'ndan hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
