Teknisk aspekt av automatisert syntese og Real-Time Kinetic evaluering av [¹¹C] SNAP-7941

Summary

Her representerer vi en protokoll for helautomatisk radioaktiv merking av [¹¹C] SNAP-7941 og analysen av sanntids-Kinetics av dette pet-Tracer på P-GP uttrykke og ikke-uttrykker celler.

Abstract

Positron utslipps tomografi (PET) er en essensiell molekyl bildeteknikk som gir innsikt i stier og brukerspesifikke målrettede radioligands for in vivo-undersøkelser. Innenfor denne protokollen, en robust og pålitelig fjernstyrte radiosynthesis av [¹¹C] SNAP-7941, en motstander av melanin-konsentrere hormon reseptor 1, er beskrevet. Den radiosynthesis starter med cyclotron produsert [¹¹C] co₂ som senere reagerte via en gass-faseovergang til [¹¹C] ch₃OTf. Deretter er denne reaktive mellomliggende introdusert til forløperen løsningen og danner de respektive radiotracer. Kjemisk så vel som radio kjemisk renhet bestemmes ved hjelp av RP-HPLC, rutinemessig implementert i radiofarmaka kvalitetskontrollprosessen. I tillegg er molar aktiviteten beregnet som det er en nødvendighet for følgende sanntids kinetisk etterforskning. Videre [¹¹C] SNAP-7941 brukes til MDCKII-WT og MDCKII-hMDR1 celler for å evaluere virkningen av p-glykoprotein (p-GP) uttrykk på celle akkumulering. Av denne grunn er P-GP uttrykker cellelinje (MDCKII-hMDR1) enten brukes uten eller med blokkering før eksperimenter ved hjelp av P-GP substrat (±)-verapamil og resultatene er sammenlignet med de observert for wildtype celler. Den generelle eksperimentelle tilnærmingen demonstrerer viktigheten av en presis tid-ledelse som er avgjørende for hver prekliniske og klinisk studie med PET Bevegelsesuskarphet radiomerket med kortvarig nuclides, slik som Carbon-11 (halveringstid: 20 min).

Introduction

[¹¹C] SNAP-7941 ble utviklet som den første positron utslipp tomografi (PET)-Tracer rettet mot melanin-konsentrasjon hormon reseptor 1 (MCHR1)-en reseptor hovedsakelig involvert i den sentrale regulering av appetitt og matinntak¹. Carbon-11 merking av snap-7941, en godt karakterisert MCHR1 motstander, gitt den autentiske pet-Tracer^2,3,4,5. Imidlertid er helautomatisk radiosynthesis svært utfordrende når det gjelder tid effekt og reproduserbarhet med den kortvarige radionuklidet Carbon-11 som tilbyr en halveringstid på 20 min⁶. Den generelle syntese tid bør holdes på et minimum, og som en tommelfingerregel bør ikke overstige 2-3 halv-liv (dvs. rundt 40-60 min for Carbon-11)⁷. Spesielt, syntese prosedyrer for radiotracers målgruppe reseptor systemer med lav uttrykk tettheten må være grundig optimalisert for å oppnå tilstrekkelig avkastning og følgelig høy molar aktivitet⁸. Den syntetiske strategien følger ofte radionuklidet produksjon innen en cyclotron og frigjøring av [¹¹C] co₂ til synthesizer. Der, [¹¹c] co₂ er først redusert til [¹¹c] ch₄ og deretter reagerte med jod å gi [¹¹c] ch₃i via gass-fase metoden^9,10. Videre behandling med sølv triflate gir [¹¹C] ch₃OTf direkte on-line. Etterpå blir denne reaktive karbon-11-merket mellomliggende innført i en løsning som inneholder Forløperen molekylet. En automatisert radiosynthesis innebærer i tillegg en rensing prosess med semi-preparativ RP-HPLC inkludert påfølgende formulering av produktet egnet for prekliniske og kliniske studier.

Uavhengig av halveringstiden av radionuklidet og tiden innsats av radiosynthesis, den farmakokinetiske av en radiofarmaka er den mest kritiske delen som skal evalueres under PET-Tracer utvikling. Inne pris av neuroimaging, hjerne komme inn av det PET-Tracer er det hovedavdeling forutsetning. Men, blod hjerne barrieren (BBB), en "sikkerhet grensen" av hjernen, svært uttrykker utstrømming transportører som kan losse små molekyler (f. eks, PET-Bevegelsesuskarphet) og effektivt hemme deres anvendelse.

En stor ulempe under prekliniske evaluering er uventede interaksjoner mot disse utstrømming transportører, som ofte ugjenkjennelig i in vitro eksperimenter og fører til svikt i PET-Tracer in vivo, som observert for [¹¹C] SNAP-7941. μPET Imaging i rotter viste lav hjerne opphopning, som økte dramatisk etter administrering av P-GP inhibitor tariquidar¹¹. Disse dataene antydet at [¹¹C] SNAP-7941 er et substrat for dette utstrømming transportør systemet som hindrer ligand binding til sentrale MCHR1. Dessverre er det fortsatt en mangel på tilstrekkelig in vitro-modeller slik at prediksjon av BBB penetrasjon i et tidlig stadium av Tracer utvikling.

Her beskriver vi automatisert syntese av [¹¹C] SNAP-7941 bruker en synthesizer for Carbon-11 methylations. Vekten av dette arbeidet er å gi en oversikt over hvordan du organiserer en sammenhengende eksperimentell tilnærming inkludert automatisert syntese, kvalitetskontroll samt suksessive in vitro evaluering med svært kortvarig Nuklide Carbon-11.

For det første beskrives de viktigste trinnene for en vellykket radiosynthesis med minimale tids utgifter og maksimal utbytte. Deretter er en pålitelig kvalitetskontrollprosedyre satt opp gjør radiotracer tilgjengelig for potensielle kliniske studier og møte kriteriene for den europeiske farmakopé¹². Kvantifisering av molar konsentrasjon og beregning av den respektive molar aktiviteten er en viktig forutsetning for de påfølgende kinetisk målingene.

Endelig, en ny og grei in vitro metoden evaluere [¹¹C] snap-7941's interaksjoner mot utstrømming transportør, P-GP (hMDR1), er presentert. Den foreslåtte kinetisk modell bruker en lett-å-håndtere enhet som tillater en umiddelbar data tolkning og krever minimalt cellekultur innsats¹³.

Protocol

FORSIKTIG: i følgende protokoll er det involvert flere trinn som krever håndtering og manipulering av radioaktivitet. Det er viktig at hvert skritt er enige med Strålingssikkerhet Institutt for instituttet og de respektive nasjonale lovgivende forsamling. Det er obligatorisk å minimere eksponering for ioniserende stråling for operatørene som er involvert etter prinsippet om ALARA («så lavt som rimelig oppnåelig»).

1. tidsstyring og planlegging av eksperimentet

Merk: den korte halveringstiden til Carbon-11 krever en nøyaktig tidsstyring for å minimere tap av radioaktivitet (figur 1). Det er viktig at enhver person som er involvert kjenner sitt ansvarsområde og tidspunktet for de respektive handling. For å sette opp en sanntids kinetisk eksperiment av [¹¹C] SNAP-7941, rundt fire personer er nødvendig for en jevn prosess.

1. Organiser en produsent for [¹¹C] SNAP-7941.
2. Informer kvalitetskontroll operatøren utføre spesifikasjonen evaluering, beregning av masse konsentrasjon og molar aktivitet av syntesen starttid.
3. Hold Real-Time kinetisk eksperimentator klar for fortynning beregning og utføre eksperimentet.
4. Be løperen om å overføre radioaktiviteten til det respektive stedet på det respektive tidspunktet.

2. automatisert syntese av [¹¹C] SNAP-7941 for prekliniske bruk

1. Fremstilling av synthesizer (figur 2).
   1. Slå på synthesizer, nødvendige tekniske gasser (helium og hydrogen) og synthesizer kontrollprogramvare Tracerlab. Velg den respektive syntese sekvens snap.
   2. Vask v1-v3 en gang med vann og to ganger med aceton via REAKTOREN og HPLC ventilen enten på Last eller injisere posisjon i loop avfalls flaske.
   3. Tørk alle tilknyttede linjer inn og ut av reaktoren via injeksjons ventilen med en kontinuerlig helium strømning aktivert via V18.
   4. Heat [¹¹c] ch₃jeg felle så vel som [¹¹c] ch₃OTf Trap under en helium strøm av 100 ml · min^-1 opp til 200 ° c via v24, V25, v29, V15, v9, v17 og v32/V33 med frittliggende reaktor.
   5. Kontroller samme vei for lekkasjer (med vedlagt reaktor) med en helium flyt på 100 mL · min^-1. Tetthet er garantert når strømmen faller under 4 mL · min^-1.
   6. Slå på HPLC-pumpen (5-10 mL · min^-1) og vask HPLC-linjene og injeksjons ventilen med acetonitril/vann (50/50, v/v) samt HPLC-linjene med HPLC-væsken via v14 inn i pæren.
   7. Tøm pæren via V11 og V12 i avfallsflasken med en helium bekk via v19. Vask de respektive linjene med vann fra v6 igjen via V11 og V12 med en helium strøm via V18.
   8. Vask v5 med etanol og v4 med vann via V11 og V12 inn i hetteglasset for produkt samling (PCV) ved hjelp av en helium strøm via V18, og tøm deretter PCV via V13 inn i avfallsflasken med en helium strøm via V20.
   9. Slå HPLC pumpen av, bytte til løsemiddel for syntese ((vandig ammonium acetate (2,5 g · L^-1)/acetic syre 97.5/2.5 v/v; pH 3.5)/acetonitrile 75/25 v/v), fest semi-preparativ HPLC kolonne og likevekt kolonnen (strøm av 5 mL · min^-1).
   10. Fyll ut reagensene for syntese og rensing: 1,5 mL vann (v2), 4,5 mL 0,9% NaCl (v4), 0,5 mL av 96% etanol (v5), 10 mL vann (v6) og 90 mL vann (pære).
   11. Fest et nytt hetteglass med sløyfe; et produkt hetteglass (merket og utstyrt med en lufte nål) til V13 og flytende nitrogen.
   12. Forutsetning en SPE-kassett (solid fase ekstraksjon) med 10 mL 96% etanol og 20 mL vann og fest den mellom V11 og V12.
   13. Start pre-Run sekvensen 20 min før du starter syntesen, bestående av oppvarming [¹¹C] co₂ felle til 400 ° c og skylle fellen med en helium strøm av 50 ml · min^-1via V27 (2 min). Deretter pre-flush [¹¹C] co₂ Trap i 3 min med hydrogengass (120 ml · min^-1) og til slutt avkjøles til under 40 ° c.
   14. Oppløsning 1 mg forløper i 400 μL av acetonitril (for DNA-syntese, < 10 H₂O), Overfør løsningen til reaksjonen og tilsett 5,5 ΜL av TBAH (264 mg · ml^-1 i metanol). Fest reaktoren til sin respektive posisjon.
   15. Lukk den varme cellen og slå på under trykket på den varme cellen.
   16. Bekreft starten på kjøleprosessen til CH₄ -fellen med flytende nitrogen til-75 ° c.
   17. Slipp radioaktiviteten når temperaturen er nådd.
2. Cyclotron produksjon av [¹¹C] co₂
   Merk: trinn 2.2.1-2.2.4 utføres samtidig til utarbeidelse av radiosynthesis modulen (se også figur 1).
   1. Slå på magneten av cyclotron.
   2. Velg målet ¹¹C-co₂ og start strålen 65 μA.
   3. Bekreft starten av bestråling ved å trykke på knappen Start bestråling
   4. Stopp strålen og Bekreft utgivelsen av radioaktivitet i synthesizer ved å trykke på knappen levering, etter at den ønskede mengden av radioaktivitet er nådd (ca. 120 GBq etter 30 min).
3. Utførelse av helautomatisk radiosynthesis
   1. Bekreft at systemet er klart til å motta radioaktiviteten og starte den automatiserte prosessen
   2. Overvåking av følgende automatiserte prosess.
      1. Sjekk om [¹¹c] co₂ er automatisk overført fra cyclotron til syntese enhet via v26 (ca. 4 min) og at [¹¹c] co₂ er fanget på molekyl sil impregnert med nikkel som en katalysator ([ ¹¹ flere C] CO₂ Trap) ved romtemperatur.
      2. Spor hvis [¹¹C] co₂ Trap automatisk spyles først med helium (50 ml · min^-1) og deretter med hydrogengass (120 ml · min^-1). Observer deretter at V27 og V25 er lukket og at fanget [¹¹c] co₂ inkludert hydrogen gassen varmes opp til 400 ° c og at dannet [¹¹c] ch₄ er videre transportert til pre-avkjølt [¹¹c] ch₄ felle og fanget der.
      3. Monitor som v10 er lukket, v9 åpnet (mot jod kolonne) og [¹¹c] ch₄ er igjen sluppet ved oppvarming av [¹¹c] ch₄ Trap langsomt til 80 ° c og transporteres inn i sirkulasjons-enhet med en helium stream via V10 (eksos utgang). Og sjekk om [¹¹c] ch₄ er konvertert til [¹¹c] ch₃i innenfor sirkulasjons enheten, som varer i ca. 3 min og dannet [¹¹c] ch₃I er kontinuerlig fanget på [¹¹c] CH₃jeg felle.
      4. Pass på at eksos ventilen v16 er åpnet og [¹¹C] ch₃I fellen varmes opp til 90 ° c med en strøm av helium (20 ml · min^-1) via v24. Herved, mulig biprodukter fjernes og deretter v16 er lukket.
   3. Bekreft at [¹¹C] ch₃i er klar til å bli sluppet inn i reaktoren.
   4. Overvåk følgende automatiserte prosess: Kontroller om [¹¹c] ch₃I fellen varmes opp til 190 ° c og dannet [¹¹c] ch₃i er sluppet inn i reaktoren via [¹¹c] ch₃OTf Trap (v32 og V33, fortsatt på 200 ° C), v7 og V8 under en kontinuerlig helium strøm (10-25 mL · min^-1, v24). I løpet av denne prosessen, V21 og v23 (eksos utgang) må være åpen.
   5. Bekreft at radioaktiviteten ankom reaktoren, når mengden av radioaktivitet i reaktoren ikke øker lenger.
   6. Overvåking av følgende automatiserte prosess og klargjøring for manuell inngripen, om nødvendig
      1. Sjekk om v23, V21, og V8 blir automatisk stengt og reaksjonsblandingen varmes opp til 75 ° c. Etter 3 min. se om reaktoren kjøles med flytende nitrogen til temperaturen er under 35 ° c. Deretter må du sørge for at reaksjonsblandingen slukket med 1,5 mL vann via v2. I løpet av denne prosessen, V21 og v23 (eksos utgang) må være åpen.
      2. Spor om V21 og v23 er lukket og reaksjonsblandingen overføres til HPLC injeksjons ventil ved å passere gjennom en væske detektor i HPLC-sløyfen (5 mL). Spor om reaksjonsblandingen injiseres automatisk på HPLC-kolonnen.
   7. Observer kromatogram og kutt manuelt produktet peak via knappen peak Start. Trykk på peak-enden når produktets topp signal faller under ca. 400 CPS etter en oppbevaringstid på ca. 8-10 min (Flow: 5 ml · min^-1, Figur 3).
   8. Slå på en ekstra helium stream for å akselerere tømming av pære.
   9. Overvåk om lyspæren tømmes og observere avfallsflasken: Sjekk om pæren er tømt via V11, den spe kassetten og V12 i avfallet med en helium stream via v19 og en ekstra helium linje og hvis produktet beholder på spe kassetten.
   10. Bekreft at pæren er helt tom.
   11. Overvåking av automatiserte prosessen med SPE-rensing og produkt overføring
       1. Sjekk om SPE kassetten er vasket med 10 mL vann via V6, V11, og V12 i avfallet og hvis etanol elutes produktet inn i PCV via v5, V11, og V12. Til slutt, observere om 0,9% NaCl er lagt inn i PCV via v4, V11 og V12 å fortynne produktet.
       2. Pass på at produkt løsningen overføres via V13 og et sterilt filter inn i det endelige hetteglasset med en helium strøm via V20.
   12. Bekreft at produktet har blitt fullstendig overført.

3. kvalitetskontroll (QC)

Merk: kvalitetskontrollen til radiofarmaka inkluderer måling av følgende parametre:

• Radio kjemisk renhet og molar aktivitet (RP-HPLC)
• Rester av løsemidler (gass kromatografi, GC)
• Osmolalitet (damp trykks osmometer)
• pH (pH-meter)
• γ spektrum/radionuklidet renhet (γ-spektrometer)
• Halveringstid/radionuklidet renhet (dose kalibratoren)

Alle fysikalsk parametere fastsettes før produktet slippes ut, og verdiene må være i det definerte kvalitets parameterområdet.

1. Utarbeidelse av kvalitetskontroll utstyr
   1. Start forberedelsene 30 min før slutten av syntesen.
   2. Forbered en konisk hetteglass i en bly skjermet beholder og en skjermet 1 mL sprøyte med en vedlagt nål.
   3. Klargjør en referanse standard løsning for SNAP-7941 (10 μg · mL^-1) i vann til HPLC.
   4. Slå på pH-måleren, gass kromatografisk og de brukte gassene, osmometer og alle komponentene i HPLC.
   5. Slå på HPLC kontrollerende programvare og velg den dedikerte kolonnen og den respektive metoden for [¹¹C] SNAP-7941 (mobil fase: (vann/eddiksyre 97.5/2,5 v/v; 2,5 g. L^-1 ammonium acetate; pH 3.5)/acetonitrile 70/30 v/v; flyt: 1 ml · min ^-1) og skrive en eksempel liste med to målinger (standard og produkt). Start metoden for condition av kolonnen.
   6. Injiser 20 μL av en SNAP-7941 Referanseløsning med en Hamilton-sprøyte etter 10 min condition og start analyse kjøringen.
   7. Vask Hamilton-sprøyten to ganger med acetonitril og vann etter injeksjon.
   8. Start programvaren for GC-kontroll og skriv eksempel listen.
2. Utføre kvalitetskontroll
   1. Mål det absolutte radioaktive utbyttet av produktet etter slutten av syntese og overføring 100 μL av produktet i et reaksjons hetteglass med den klargjorte bly skjermet sprøyten for kvalitetskontroll.
      Merk: alle data innhentet fra kvalitetskontrollen må dokumenteres i samsvar med de nasjonale forskriftene.
   2. Analytisk HPLC: mål radio kjemisk renhet og kjemisk renhet og informere den som er ansvarlig for celle kulturen eksperimenter umiddelbart av resultatene.
      1. Trekk 40 μL av QC-prøven og Injiser til HPLC. Start kjøringen ved å bevege armen på injeksjons ventilen fra Last til injeksjon ( Figur 3).
         Merk: under kjøringen (8 min) kan andre målinger av protokollen utføres for å unngå så mye forfall som mulig.
      2. Åpne kromatogram og Integrer alle toppene i radiokanal kanalen. Sammenlign Oppbevaringstiden for produktet (5,0-7.0 min) med Oppbevaringstiden for referanse standarden. Sammenlign området under kurven i prosent av alle integrerte topper. Produktet peak må være mer enn 95% (radio kjemisk renhet) av de totale integrerte områder (radiokanal).
      3. Integrer signalet i UV-kanalen for å bestemme kjemisk renhet. De viktigste urenhet er vanligvis forløperen SNAP acid på 2.8-3.5 min. Konsentrasjonen av [^NATC] SNAP-7941 er beregnet fra kalibreringskurven etter integrering. Beregn konsentrasjonen av SNAP-7941 i mikromol · mL^-1 og Bestem molar aktiviteten ved hjelp av følgende ligning:
         
   3. For gass kromatografi, overføring 20 μL av kvalitetskontroll prøven i et dedikert hetteglass. Plasser den i autosampler og start målingen. Når målingen er fullført, åpner du kromatogram og skriver ned tallene for automatisk integrerte topper. Prøven skal ikke inneholde mer enn 410 ppm acetonitril og 10% etanol.
   4. Osmolalitet: Legg en papir Prøveplate på den dedikerte hul platen og påfør 10 μL av prøven. Trykk på lukke knappen for å måle osmolalitet. Etter 3 min viser enheten osmolalitet som må være i en rekke 190-500 mosm · kg^-1.
   5. pH: vask elektroden med vann. Mål pH ved å sette elektroden i prøven. PH må være i en rekke 5,0-8.5. Vask elektroden igjen etter måling og plasser elektroden i referanse pH-oppløsningen.
   6. γ-spektrum: sett QC-prøven i γ-spektrometer, åpne Kontrollprogramvaren og start målingen. Stopp målingen og skriv ned den målte energien som må være 511 keV (Range 420-520 keV). Åpne fil menyen og sikre filen med det respektive partinummeret. Recall det lagrede spekteret i dedikert programvare og skrive ut spekteret.
   7. Halveringstid: målaktiviteten til QC-prøven to ganger ved å bruke dose kalibratoren. Skriv ned de respektive tider og beregne halveringstiden av eksponentiell.
3. Utgivelsen
   1. Etter at alle parametrene er testet og resultatene er i samsvar med retningslinjene til de østerrikske myndighetene, frigjør du radiotracer. Operatøren må undertegne riktigheten av dataene.

4. evaluering av interaksjoner mot P-GP transporter

1. Cell kultur
   1. Start den laminær luftstrømmen (LEIV) til arbeidsbenken og rengjør benken minst 15 min før du begynner å arbeide.
   2. Bland celle kulturen medium under sterile forhold i LEIV med 10% av FCS (50 mL) og 0,5% av antibiotika (2,5 mL) med et sterilt volum pipette ved hjelp av en automatisert pipettering hjelpemiddel.
   3. Tin MDCKII-hMDR1 og MDCKII-WT celler og dyrke i en T75 eller T175 cellekultur kolbe 10-14 dager i forkant av eksperimenter under aseptisk forhold (LEIV).
   4. Endre mediet på neste dag for å fjerne alle ikke tilhenger og apoptotisk celler.
   5. Erstatt hver tredje dag mediet med frisk en (12 mL for T75 og 23 mL for T175 cellekultur kolbe, henholdsvis).
   6. Split cellene i henhold til tidsplanen for eksperimenter til friske flasker eller til cellekultur retter på en samløpet av 80% for å unngå bilayer voksende.
2. Celle klargjøring for eksperimenter
   1. Split cellene to dager før eksperimenter og frø i en konsentrasjon av 2,5 x 10⁵ celler per 2 ml i et skråplan av en cellekultur parabol (Figur 4). Bruk en automatisk celle teller enhet eller en Neubauer telling kammer å telle cellene og beregne riktig splitting ratio.
   2. Fjern mediet en dag før eksperimenter, vask cellene på kultur fatet med 4 mL DPBS og tilsett friskt 5 mL cellekultur medium. Plasser parabolen horisontalt i inkubator.
   3. Vask cellene med DPBS minst 0,5 h før eksperimenter og Erstatt med 2 mL FBS fri medium. Undersøk samløpet og celle morfologi med et mikroskop.
3. Utføre eksperimenter i tre forskjellige oppsett.
   1. Bruk Petri parabolen for eksperimenter som beskrevet i 4.2.3.
   2. Behandle cellene for 0,5 h før eksperimenter med 10 μM (±)-verapamil hydrochloride.
   3. Tilsett 0,98 μL av verapamil lagerløsning (20,4 mM (±)-verapamil hydrochloride i DMSO). Endelig DMSO-innhold er ≤ 0,05% under behandling.
   4. Ruge cellene for 0,5 h med kjøretøyets kontroll (DMSO). Bruk samme volum som brukes for behandling av legemidlet.
4. Eksperimenter av Real-Time analysen (for alle tre oppsett)
   1. Slå på enheten, datamaskinen og sørg for at de er riktig tilkoblet, og åpne deretter Kontrollprogramvaren.
   2. Velg ett mål alternativet, Lås opp malen og Juster følgende innstilling:
      Antall stillinger: 2 (to)
      Deteksjons tid (sek): 3 (tre)
      Deteksjons forsinkelsestid (r): 2 (to)
      Navn på den første fasen: Baseline
   3. Sett cellen kultur parabolen i tilbøyelig støtte til enheten, og pass på at cellen stangen er på undersiden og dekket med cellekultur medium.
   4. Starte det løpe via starte knapp. Systemet ber om å lagre filen. Velg et filnavn og en lagringsbane. Kontrollsenteret stiller opp og Baseline målingen begynner (cellen kultur parabolen støtte begynner å rotere).
   5. Velg under andre alternativer:
      Tidsskala: minutter
      Nuklide korreksjon: Carbon-11
   6. Merk av for alle boksene under kurver i graf (bakgrunn (rød), mål (blå) og mål minus bakgrunn (svart)).
   7. Få tak i kvalitetskontroll parametere: molar aktivitet [GBq. mikromol^-1] og aktivitet konsentrasjon [MBq.ml^-1] på slutten av syntese.
   8. Beregn de respektive sporings volumet for 15 nM i [^NATC] SNAP-7941 i analyse volumet på 2 ml.
      
      
   9. Klargjør pipette til det respektive volumet og en alikvot av [¹¹C] SNAP-7941 produktet i en bly skjerming.
   10. Klikk Stopp kjøring i kontrollsenter vinduet. Vent til rett rotasjon stopper og sidelinjen med tittelen midlertidig stanset og neste fase inntreffer.
   11. Åpne lokket på kinetisk enhet i sanntid. Drei kultur parabolen støtte 90 ° til venstre. Legg det beregnede volumet av Tracer og gå tilbake til utgangsposisjon. Lukk deretter lokket på enheten. Trykk umiddelbart på Fortsett -knappen for å starte eksperimentet.
   12. Avslutt eksperimentet etter 20 min ved å velge pause og deretter avslutte kjøringen (trykk end kjøre i sidebar).
5. Data analyse og prosessering ved hjelp av en statistikk programvare
   1. Åpne programvaren for sanntidskontroll. Falle i staver opp på åpen fil-størrelse å tilbakekalling det krevde Kinetics. Kinetics er illustrert i kontrollsenter vinduet.
   2. Velg ved å høyreklikke direkte på Kinetics eksport kurver. Lagre tekstfilen som inneholder rådata. Åpne statistikk programmet og lim inndatafilen for sann tids eksperimenter.
   3. Start med tiden (x-aksen) ved tilsetning av radiotracer (Ekskluder bakgrunns måling) og normalisere til prosent signal av maksimal CPS (teller per sekund).
   4. Last alle normalisert data til en ny GraphPad Prism fil.
   5. Beregn gjennomsnittsverdier og standardavvik.
   6. Illustrere innhentet data som grafen viser avviket (rate av økning) av Tracer opptak av alle tre sett ups.

Representative Results

Den helautomatiske radiosynthesis av [¹¹c] SNAP-7941 ga 5,7 ± 2,5 GBq (4,6 ± 2,0% ved EOB, 14,9 ± 5,9% basert på [¹¹C] ch₃OTf; n = 10) av formulert produkt. Den samlede syntese varte rundt 40 min, der 15 min var nødvendig for utarbeidelse av [¹¹C] ch₃OTf via gass fase metoden, en annen 5 min var nødvendig for radioaktiv merking av forløperen, etterfulgt av 10 min av semi-preparativ RP-HPLC rensing og 10 min for C18 kassetten solid fase ekstraksjon og formulering. Deretter ble en liten alikvot (ca. 100-200 μL) levert til den som var ansvarlig for kvalitetskontrollen, mens det opprinnelige produkt hetteglasset med den klare-til-bruk-Tracer ble overlevert til eksperimentator av kinetisk analyse i sanntid.

Kvalitetskontroll ble fullført innen 10 min etter slutten av syntese. Molar aktiviteten var i en rekke 72 ± 41 GBq/mikromol (n = 10) og radio kjemisk renhet var alltid > 95%. Alle andre parametre (pH, osmolalitet, gjenværende løsemidler) oppfylte Utgivelses kriteriene. For sanntids kinetisk analysen ble det valgt tre forskjellige eksperimentelle oppsett: (A) behandlet og ikke-behandlet (kjøretøy) MDCKII-WT-celler, (B) ikke-behandlet eller behandlet med kjøretøy MDCKII-hMDR1 celler og (C) sistnevnte cellelinje med blokkering før sanntids kinetisk analyse av transportøren med (±)-verapamil. Påføring [¹¹C] SNAP-7941 til den wildtype cellelinjen MDCKII-WT (p-GP ikke uttrykker) og MDCKII-HMDR1 (p-GP uttrykker) viser en annen kinetisk atferd, da det er en rask akkumulering til wildtype cellelinje, mens ingen akkumulering ble observert for MDCKII-hMDR1-cellene. Men blokkering av P-GP utstrømming transporter inMDCKII-hMDR1 celler med (±)-verapamil førte til en sammenlignbar sanntids kinetisk som allerede sett for wildtype cellelinjen (figur 5).

Figur 1: oversikt over arbeidsflyten. Arbeidsflyt av radiosynthesis, kvalitetskontroll og ytelsen til kinetisk måling i sanntid på [¹¹C] SNAP-7941. De svarte pilene viser transportmåten for radioaktiviteten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Radiosynthetic ordningen med den automatiserte synthesizer. Bytte krets av automatiserte synthesizer, starter med sirkulasjon enhet for [¹¹c] ch₃I/[¹¹C] ch₃OTf produksjon, reaktoren for innføring av AKTIVITETEN i forløperen løsning og spe rensing (spe = solid fase ekstraksjon; PCV = hetteglass for produkt samling). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: representative kromatogrammene for den helautomatiske radiosynthesis av [¹¹C] snap-7841. Den semi-preparativ RP-HPLC kromatogram er illustrert på toppen og analytisk en etter rensing på bunnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Cell kultur parabolen forberedelse for Real-Time eksperimenter. Trinn 1 inkluderer seeding på 2,5 x 10⁵ opp til 1 x 10⁶ avhengig av celle type og deres vekstrate. Deretter blir kulturen parabolen plassert i en skråplan (ca 30-45 °). Derfor kan den med følgende metall apparat eller lokket på en cellekultur parabol brukes i inkubator for å stabilisere skråstilling av parabolen. Dagen etter (24 h) fatet er justert horisontalt, og frisk cellekultur medium er lagt til helt dekke celleoverflaten. På dagen for eksperimentet, celle levedyktighet og samløpet er undersøkt. I henhold til den eksperimentelle protokollen, cellene vaskes med DPBS, er mediet erstattet av serum fritt medium (2 mL), og kulturen parabolen er flyttet til en skrå posisjon til starten av eksperimenter. Heretter kan cellene behandles med inhibitor eller kjøretøy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: kinetisk måling i sanntid av [¹¹C] SNAP-7941. Representative sanntid Kinetics av [¹¹C] snap-7941 er vist i tre forskjellige sett ups: ved hjelp av MDCKII-WT celler; MDCKII-hMDR1 celler pre-blokkert med (±)-verapamil som P-GP inhibitor og MDCKII-hMDR1 celler uten blokkering. Y-aksen illustrerer økningen av de pre-blokkerte MDCKII-hMDR1 og WT celler i forhold til resultatene av ubehandlet eller kjøretøy-behandlet MDCKII-MDR1 celler, henholdsvis (ingen opptak, 0%). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Radiosynthesis av [¹¹C] SNAP-7941 ble etablert på en kommersiell syntese modul. På grunn av muligheten til å automatisere Forberedelses prosedyren, radiosynthesis bevis for å være pålitelig, og forbedringer i forbindelse med strålevern av operatøren ble oppnådd. Utarbeidelse av synthesizer har en enorm innvirkning på kvaliteten på radiotracer, spesielt i form av molar aktivitet. Derfor er det viktig å arbeide kontinuerlig under inert forhold (f. eks, helium atmosfære), og å skylle alle linjer som ligger før reaksjons fartøyet (mållinjen, [¹¹C] ch₃I produksjonssyklus og reaktor (se figur 2)). Videre oppvarming av de respektive feller og ovner før starten av syntesen for å fjerne fuktighet og atmosfærisk karbon øker molar aktiviteten med fordel. Spesielt AgOTf kolonnen, impregnert med graphitized karbon, er ekstremt følsom for fuktighet. Selv mindre mengder av enhver kilde til fukt forstyrrer konverteringen av [¹¹c] ch₃i til [¹¹c] ch₃OTf. Før du starter syntesen, må [¹¹c] co₂ -fellen og [¹¹c] ch₃i-fellen kjøles ned til romtemperatur igjen for å muliggjøre påfølgende overlapping. Videre er det anbefalt å oppløse forløperen kort tid før du starter syntesen og å legge basen direkte inn i forløperen løsningen.

Kvalitetskontrollen for Carbon-11-radiotracers må være rasjonelt utformet for en kontinuerlig og rask arbeidsflyt. Men de viktigste parametrene for cellekultur studier er radio kjemisk renhet og molar aktivitet for å oppnå gyldige resultater. Korrekt evaluering av molar aktiviteten krever en robust analytisk HPLC-metode, og kalibreringskurven må dekke konsentrasjons området til sluttproduktet. Den utfordrende delen for radiotracers er å oppnå en konsentrasjon over grensen for kvantifisering (LOQ) på grunn av små mengder, som produseres under radiosynthesis. Derfor er kunsten å finne balansen mellom høy molar aktiviteter for å unngå reseptor metning og høy nok konsentrasjoner til å fortsatt være i stand til å kvantifisere det ikke-radioaktive signalet.

[¹¹C] SNAP-7941 ble bekreftet å være en potent substrat av den menneskelige P-GP transporter, som ingen akkumulering ble observert i ubehandlet eller kjøretøy-behandlet MDCKII-hMDR1 celler på grunn av rask utstrømming. I kontrast, både eksperimentelle sett ups (MDCKII-WT eller pre-blokkerte MDCKII-hMDR1 celler) gitt lignende resultater (akkumulering av [¹¹C] SNAP-7941), støtter allsidigheten til denne in vitro analysen. MDCKII-hMDR1 celler er svært egnet for LigandTracer eksperimenter på grunn av deres stabile transfeksjoner, rask vekst og vedvarende mot skjær stress forårsaket av roterende cellekultur parabolen. Mangelen på [¹¹C] SNAP-7941 opptak i rotte og mus hjernen kan derfor oppstå forårsaket av utstrømming gjennom P-GP transporter. På grunn av transfeksjoner av canine nyreceller med den menneskelige multi resistens protein 1 (hMDR-1, P-GP), den prediktiv verdi av denne metoden for utstrømming transportør binding hos mennesker er høy, noe som er gunstig i forhold til en fremtidig klinisk anvendelse. Men hittil har ikke selektivitet mot andre utstrømming transporter blitt verifisert. Derfor kan andre cellelinjer brukes, uttrykker ulike prominente utstrømming transportører som brystkreft resistens protein (BCRP) eller flere resistens protein-1 (MRP-1), for å studere interaksjoner mot disse transportører. Metoden er i forhold til klassisk akkumulering eller transport analyser svært enkel og gir umiddelbart kvalitative resultater. Videre er den største fordelen at denne teknologien muliggjør evaluering av direkte interaksjon av PET Tracer og målet i sanntid, i motsetning til det konvensjonelle eksperimentet ved hjelp av indirekte kvantifisering (for det meste forskyvning). I tillegg gir sanntids radioassay programvare eksperimentell fleksibilitet (for eksempel Nuklide forfall korreksjon, måling tid og posisjoner, etc.) og derfor høy frihet for brukerne. På den andre siden, begrensninger av metoden inkluderer en lav prøve gjennomstrømning, som bare en celle parabol kan måles om gangen. Videre bør det tas hensyn til et par andre tekniske og operasjonelle problemstillinger: Den beskrevne teknologien er svært følsom for bakgrunnsstråling; dermed bør strålingskilder holdes på avstand og vekt bør plasseres på bakgrunnen målingen før eksperimentet. En annen sak om eksperimenter ved høyere temperaturer enn romtemperatur, er oppvarming av tilbøyelig støtte: fordampning av cellen kultur medium kan påvirke detektoren. I stedet for oppvarming, er hele enheten fortrinnsvis plassert i inkubator. Videre er metoden begrenset til tilhenger cellelinjer. Gjennom rotasjon av cellen kulturen parabolen, skjær stress følsomme celler kan løsne fra fatet, noe som kan føre til ugyldige resultater.

Ikke desto mindre, hvis det eksperimentator betaler oppmerksomheten å disse mindre ulempene metoden leverer rask og pålitelig resultater for analysen av det kinetisk opptreden av prekliniske PET-Bevegelsesuskarphet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)