Summary
Biz bozulmamış fare iskelet kasları kullanarak küçük açılı X-ışını dikeslenme denemeleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. İnsan hastalıkları için transgenik fare modellerinin geniş kullanılabilirlik ile, bu deneysel platform genetik kas hastalıklarının yapısal temeli aydınlatılmasına için yararlı bir test yatağı oluşturabilir
Abstract
Transjenik fare modelleri, iskelet kası da dahil olmak üzere insan hastalıkları için genotip fenotip ilişkisini incelemek için önemli araçlar olmuştur. Fare iskelet kası, üçüncü nesil senkrotron beaylines üzerinde yüksek kaliteli X-ışını dikesasyon desenleri üretmek için bir fırsat belirlenmesi tarafından sağlık ve hastalığın fonksiyonel fenotipleri genotip düzeyinde değişiklikleri bağlamak için gösterilmiştir Genetik değişikliklerin yapısal sonuçları. Numunelerin hazırlanması, X-Ray desenlerini toplamak ve bu tür denemeleri kendileri için yapmak isteyen deney elemanlarına yardımcı olabilecek X-Ray desenlerinden ilgili yapısal parametreleri ayıklamak için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.
Introduction
Synchrotron küçük açılı X-ışını kırınması, fizyolojik koşullarda kas preparatlarının aktif olarak taahhüt edilmesi için Nm-ölçek yapısını incelemek için tercih edilen yöntemdir. Daha da önemlisi, yaşam veya tenli kas preparatlarının yapısal bilgileri, kas kuvveti ve uzunluk değişiklikleri gibi fizyolojik verilerle senkron olarak elde edilebilir. Sarkomerik proteinlerde nokta mutasyonları temelinde kalıtsal kas hastalıklarının yapısal temelini incelemek için bu tekniği uygulayarak ilgi artmaktadır. Kas Biyofizik topluluk yapısal çalışmalar için ideal test yatakları sağlayabilir bu insan hastalığı koşulları için transgenik fare modelleri üreten çok aktif olmuştur. Bizim grup1,2,3 ve diğerleri4,5 gelen son yayınlar, fare ekstansiyon Digitorum longus (EDL) ve soleus kasları X-Ray desenleri tüm sağlayabilir belirtti gibi kurbağa ve tavşan psoas iskelet kas gibi daha geleneksel model organizmaların kullanılabilir dikesasyon bilgileri. Fare iskelet kas hazırlama avantajı diseksiyon kolaylığı ve temel membran-bozulmamış, tüm kas fizyolojik deneyler gerçekleştirme. Disseke kas boyutları çok kısa x-ışını pozlama süreleri (kare başına ~ milisaniyelik) son derece ayrıntılı kas desenleri vermek için yeterli kütle var üçüncü nesil X-Ray beaylines.
Kas X-ışını kırıcılık desenleri ekvatoryal yansımalar, merasonal yansımaları yanı sıra katman çizgi yansımaları oluşur. Ekvator yoğunluğu oranı (1, 1 ve 1, 0 Ekvator yansımaları yoğunluğunun oranı, ben11/i10), yakından bağlı çapraz köprüler sayısına korelasyon, hangi kuvvet fare iskelet kas oluşturulan orantılı olan 2. kalın ve ince filamat içinde rapor periodicities Meridional yansımaları filament genişletilebilirlik1,3,6,7tahmin etmek için kullanılabilir. Meridyen ve Ekvator üzerinde olmayan parçalanma özellikleri, kalın filament omurgası yüzeyinde yaklaşık helisel sipariş miyosin kafaları yanı sıra yaklaşık helisel sipariş ince filaminler ortaya katman hatları denir. Miyosin tabaka çizgilerinin yoğunluğu, çeşitli koşullar altında miyozin kafaları sipariş derecesi ile yakından ilişkilidir2,8. Tüm bu bilgiler, sağlık ve hastalık içinde situ içinde sarcomerik proteinlerin davranışları çalışma kullanılabilir.
Kas Synchrotron X-ışını kırılabilirlik tarihsel olarak son derece uzmanlaşmış uzmanlar ekipleri tarafından yapılan ama teknoloji gelişmeler ve yeni veri azaltma araçları mevcudiyeti bu gerek her zaman durumda olmadığını gösterir. Gelişmiş foton kaynak BioCAT Beayline 18ID, Argonne Ulusal Laboratuvarı bu teknikleri kullanarak başlamak alana yeni gelenler yardımcı olabilir kas X-ışını dikeslenme deneyler gerçekleştirmek için personel ve destek tesisleri adamıştır. Birçok kullanıcı resmi olarak BioCAT personeli ile işbirliği yapmayı tercih, ancak artan sayıda kullanıcı onlar deneyleri yapabilir ve kendilerini Beam hattı personeli üzerindeki yükü azaltarak analiz bulabilirsiniz. Bu makalenin birincil amacı, BioCAT beayline ya da etrafında diğer yüksek Flux beaylines ya da fare iskelet kas sistemi üzerinde deneyler planlamak ve yürütmek için gereken bilgileri ile potansiyel deneyler sağlayan eğitim sağlamaktır Bu deneylerin mümkün olacağını dünya.
Protocol
Tüm hayvan deneyler protokolleri Illinois Institute of Technology kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (protokol 2015-001, onay tarihi: 3 Kasım 2015) tarafından onaylanmış ve NıH izledi "bakım ve laboratuar hayvanların kullanımı için Kılavuzu"9 .
1. ön deney hazırlığı
- Hazırlamak 500 mL ringer çözeltisi (içerir: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mm CAcl2, 10,0 mm HEPES, 11 mm glikoz, pH 7,4) taze her gün için deneme.
- 200 mL 'Lik bir sprey şişesinde Ringer çözümünü doldurun ve 4 °C ' de buzdolabında saklayın. Bir petri tabağı (10 cm çapında) ile ringer çözeltisi ve serpmek ile 100% oksijen bir akvaryum hava taşı bir oksijen silindirden tüp bağlayarak. Petri yemekleri ("diseksiyon yemekleri") daha önce diseksiyon sırasında iğne takmasını sağlamak için bir elastomer bileşiği ile kaplanmıştır.
- Metal montaj kancaları hazırlayın. İki adet paslanmaz çelik tel kesme, 0,5 mm çapında, uygun uzunluğa kadar ve her iki ucunda da tel bükülür. Tüm diseksiyon araçları, makas, dikiş bağlama forseps, mikro-makas kullanım için kullanışlı düzenleyin.
Not: Kanca parçası yaklaşık 3 mm uzunluğunda olmalıdır. Uzun tel (bir kanca biten) yaklaşık 5 cm uzunluğunda olmalıdır, ve kısa tel (aynı zamanda bir kanca sona erdirmek) yaklaşık 1 cm uzunluğunda olmalıdır özel odalar biocat kullanılan sığacak şekilde ve dönüştürücü kolu için hareket yeterli bir dizi için izin. -
Tüm donanımları bağlayın ve açın. Bu bir kombine motor/kuvvet Dönüştürücüsü, motor/kuvvet dönüştürücü denetleyici yüksek güçlü bi-fazik akım stimülatör ve bir bilgisayar kontrollü veri edinme/kontrol sistemi içerir.
- Veri alma sistemini açın ve deneme10' a başlamadan önce kalibre edin. Kısaca, bir dizi bilinen ağırlık ekleyerek kuvvet kalibre, doğrusal bir ilerlemenin kuvvet dönüştürücü tarafından ölçülen maksimum kuvvet% 50 kadar kaplayan, kuvvet dönüştürücü üzerinde ve çıkış voltajı değişiklikleri kayıt. Kol koluna bilinen bir çıkış voltajı kümesi uygulayarak ve kolun uzunluk değişiksini ölçerek uzunluğu kalibre edin.
- Hortumları, numune tutucusunun termal bloğundan soğutulmuş bir sirkülasyon banyosuna bağlayın ve sıcaklığı 10 °C ile 40 °C arasında yer alan istenilen sıcaklığı korumak için ayarlayın. Bu ampirik bir sıcaklık aralığı için dolaşım banyosu ayarlayarak ve bir termokupla odasında sıcaklık ölçümü öncesinde önceden belirleyin.
2. Kas hazırlama
-
Fare ötenize
- Servikal dislocation takip karbon dioksit inhalasyon tarafından fare ötenize.
- Soğuk ringer çözeltisi ile arka ekstremite üzerinde cilt sprey hazırlık içine üfleme saç önlemek için. İnce Diseksiyon makas kullanarak uyluk etrafında kesme ve hızlı bir şekilde kasları açığa çıkarmak için #5 forseps kullanarak cilt aşağı çekerek cilt çıkarın.
- Arka ekstremite amputate ve oxygenized Ringer çözümü ile dolu olan bir diseksiyon çanak aktarmak ve sonra bir dürbün diseksiyon mikroskop altında yer.
-
Bir soleus kas hazırlanması
- Gasronemius kas yukarı bakan ile diseksiyon çanak aşağı arka ekstremite pin. Gastrorocnemius/soleus kas grubunun distal tendon kes ve ince makas kullanarak Gastroknemius kas her iki tarafında fasya kesip yavaşça ve yavaşça kasları kaldırın. Soleus kasının proksimal tendon serbest sonra ekstremite gelen gastrocnemius/soleus kas grubunu izole.
- Gasronemius kas ve distal tendon içeren kas grubu diseksiyon çanak aşağı pin. Proksimal tendon yoluyla yavaşça soleus kas kaldırın ve mümkün olduğunca soleus distal tendon kadar bırakarak Gastroknemius kas ayrı.
-
Bir ekstansiyon digitorium longus (EDL) kas hazırlanması
- Tibialis anterior kas yukarı bakan ile diseksiyon çanak aşağı arka ekstremite pin. Tibialis anterior (TA) kas boyunca fasya kes ve forseps kullanarak net çekin. TA kasının distal tendonu belirleyin ve keser. TA kas kaldırın ve EDL kas çekmeden dikkatle kesip.
- Diz lateral tarafı açık Cut ve iki tendon açığa. Kesme proksimal tendon, mümkün olduğunca tendon kadar hala kas bağlı bırakarak, ve EDL kas Lift (medial kas) yavaşça tendon çekerek. Maruz kaldığında distal tendonu kes.
-
Kas montajı
- Tendonlar üzerinden kas pin, ve mümkün olduğunca uzakta tüm ekstra yağ, fasya ve tendon Trim. Önceden bağlanmış bir düğüme bir tendon takın ve sütür bağlama forseps ile sıkıca kravat. Metal kanca etrafında ikinci düğüm bağlayın.
- Tendon diğer ucunda uzun kanca ile aynı prosedürü tekrarlayın. Kasların gövdesinin hiçbirinin dikişler ile temasa geçdiğinden emin olun. Bu hazırlık zarar verecektir.
- Kısa kancayı deneysel odanın altına ve uzun kancaya Çift mod kuvvet dönüştürücü/motora takın. 100% oksijen ile deneysel odasında kabarcık çözüm.
-
Stimülasyon protokolleri ve kas uzunluğunu optimize etme
- En iyi uyarıcı parametreleri bulmadan önce 15 ila 20 MN arasında bir temel gerginlik oluşturmak için dönüştürücü/motora bağlı Mikromanipülatör ayarlayarak kas Stretch. Stimülasyon voltajını 40 V 'ye ayarlayın. Uyarma akımı, Twitch kuvvetinde ek bir artış olmadığında sistematik olarak artar. En yüksek akım% 50 oranında artırıldı.
- En uygun uzunluğu bulmak, L0, kas uzunluğu artırarak ve aktif kuvvet (tepe kuvvet eksi temel kuvvet) kadar tek bir Twitch ile kas aktive ederek, maksimum Twitch kuvvet vermek olarak tanımlanan ısı artan durur.
- Montajı test etmek için kısa bir tetanik kasılma (1 s aktivasyon) gerçekleştirin ve gerekirse kasını optimum temel kuvvete geri uzat. Bir Dijital kaliper ile mm olarak kas uzunluğunu kaydedin.
3. X-ışını kırması
Not: Aşağıdaki açıklama, Gelişmiş foton kaynağında BioCAT beayline 18ID küçük açı X-ışını kırılama enstrüman kullanılarak yapılan X-ışını kırılama deneyler için, Argonne Ulusal Laboratuvarı ama benzer yöntemler diğer Beam hatları üzerinde istihdam edilebilir gibi ID 02 ESRF (Fransa) ve BL40XU at SPring8 (Japonya). Beayline 18ID, tam kiriş saniyede ~ 1013 fotonların bir olay akı Ile 12 keV (0,1033 nm dalga boyu) sabit bir X-ışını ışın enerjisi ile çalıştırılır.
- Dedektör mesafesine (kamera uzunluğu) bir numune seçin. 2,8 Nm Meridional yansımaları gibi 2,7 Nm aktin ve yüksek sipariş miyozin yansımaları inceleyerek deneyler için 1,8 m kamera uzunluğu kullanın. Öncelikle meridyen ve katman hatları üzerinde ince ayrıntılarla ilgilenen diğer deneyler için 4-6 m kamera kullanın
-
Numunenin ışın içinde konumunu optimize etme
- X ışınlarına yanıt olarak karanlık bir nokta üreten X ışını hassas kağıt parçası kullanarak kiriş konumunu belirlemek ("bir yanık"). Sonra kağıt üzerinde yanık işareti ile hizalanmış bir çapraz saç oluşturmak için bir video çapraz saç jeneratör kullanın ya da sadece bir işaret kalemi ile video ekranında bir işareti yapmak.
- Kullanarak BioCAT sağlanan grafik kullanıcı arayüzü örnek Pozisyoner için kas kiriş konumuna ortalanmış olmak için hareket ettirin. Pozlama sırasında kas üzerinde X-ışını dozu yaymak için örnek aşaması hareket ettirerek ~ 10-20 mm/s örnek odası osilat. Bu fasya büyük bölgeler önlemek için hareket gibi örnek gözlemlemek (dikesleme desenleri kirletecek kollajen içerir) ve onun seyahat tüm yol boyunca aydınlatılmış kalmasını sağlamak için.
Not: Bölüm 3,3 ve 3,4 gerekli ayarları ve eylemleri beayline tarafından sağlanan grafik kullanıcı arabirimini kullanarak yapmak için gerekli tam adımlar Beam hattı ve dedektör spesifik olacaktır. Bu işlemlerin nasıl gerçekleştirileceği konusunda Beam hattı personeline sorun.
-
Tanımlanan statik durumlardaki Kasdan (dinlenme veya izometrik kasılma sırasında) yüksek çözünürlüklü desenler için CCD (şarj bağlantılı cihaz) dedektörü ayarlama
- Pozlama süresini ve pozlama süresini grafik kullanıcı arabiriminde kontrol yazılımına ayarlayın. Pozlama almadan önce karanlık bir arka plan görüntüsü alın ve her 2 saat veya Dedektör okuma elektroniği herhangi bir drift düzeltmek için pozlama süresi değiştirdikten sonra bu prosedürü tekrarlayın.
- X-Ray ışını, pozlama için istenilen değere hafifletin. Sonra bir görüntü alın. Bu dedektör ile görüntü dizileri almak mümkün değildir. CCD dedektörü de tek bir görüntüyü okumak için birkaç saniye gerekir.
-
Zaman çözülen bir deneme için piksel dizi dedektörü ayarlama
- Grafik Kullanıcı arabiriminde görüntü sayısını, pozlama süresini, pozlama süresini ayarlayın. Burada kullanılan piksel dizi dedektörü, okuma için en az 1 MS gereklidir. Foton sayım dedektörü için maksimum kare frekansı 500 Hz 'dir. X-ışını deklanşöre kontrol etmek için foton sayım dedektörü çıkış sinyalini kullanın.
- Işını istenilen yoğunluğa karşı zayıflatın. Dedektör kolu ve veri edinme sisteminden tetikleyici bekleyin. Mekanik ve röntgen verilerini aynı anda tetikleyerek senkronize edin. X-ışını desenleri, 1 MS pozlama süresi ve 2 ms pozlama süresi ile protokol boyunca sürekli olarak toplanır.
Not: Tam pozlama süresi ve maruz kalma süresi, istenilen bilgiler ve ışın içindeki numunenin gözlenen ömrü nedeniyle bir durumda belirlenmelidir. Seçilen pozlama döneminde analizlenebilir veriler sağlamak için gerekli olandan daha fazla X-Ray ışını kullanmak için ışın zayıflatmak.
4. Post-deney kas tedavisi
- Kurtarma ve her mekanik ve röntgen deneyi sonra kas tartmak. Ölçülen kas uzunluğu ve kas kütlesini kullanarak kas kesit alanını hesaplayın11 bir kas yoğunluğu varsayarak 1,06 g/ml12.
- Kas deneysel uzunlukta Stretch ve 10 dk için% 10 formalin içinde kas düzeltmek. sabit kas tüm kas çapraz bölüm3boyunca konumlardan seçilen fiber demetleri bir dizi içine ayırın.
- Bir video sarkomer uzunluğu ölçüm sistemi kullanarak sarkomer uzunluğunu ölçün.
Representative Results
Izometrik tetanik kasılma. Her türlü klasik kas mekanik deney, izometrik veya izotonik kasılmalar gibi, X-Ray desenleri eşzamanlı edinimi ile yapılabilir. Şekil 1 A , mekanik ve X-Ray denemeleri için deneysel kurulum gösterir. Şekil 1B'de izometrik tetanik kasılma için örnek bir kuvvet izi gösterilir. Kas 1 s için aktive önce 0,5 s için istirahat yapıldı. Mekanik kayıt uyarıcı sonra 1 s durur. X-ışını desenleri, 500 Hz 'de 1 MS pozlama süresi içinde protokol boyunca sürekli olarak toplanır.
X-ışını kırması desenleri. Kas X-ışını dikesasyon deseni sarcomere içindeki yapılardan nanometre çözünürlüğü yapısal bilgi verebilir. Kas X-ışını kırıklar desenleri Ekvator ve meridyen tarafından bölünmüş dört eşdeğer dörtgen oluşur. Ekvator deseni lif eksenine dik sarkomer içinde myofilament ambalajından doğar, merasyal desenler kas ekseni boyunca myofilamler yapısal bilgileri rapor ederken. Ekvator veya Meridyen üzerinde kalan yansımalar katman hatları olarak adlandırılır. Katman hatları (örn. Şekil 2A'da MLL4 ve ALL6 etiketli Özellikler), kalın filaminler ve ince filamin içeren aktin içeren miyosin içindeki moleküler alt unsurların yaklaşık olarak helisel olarak düzenlenmesini ortaya çıkar. Miyosin bazlı katman hatları, dinlenme kasından (Şekil 2A) gelen desenlerle güçlü ve keskindir, ancak actin tabanlı katman hatları, kasların akından gelen desenlerle daha belirgindir (Şekil 2B). Dinlenme desenini taahhüt deseninden çıkararak elde edilen fark desenleri (Şekil 2C) sağlıklı ve hastalıklı kaslarda kuvvet gelişimi sırasında yapısal değişikliklere ışık tutabilir. Kas kasılma sırasında moleküler olayların milisaniyelik zaman ölçeğinde Bu yapısal değişiklikleri takiben, X-ışını dikesasyon desenleri önemli yapısal bilgileri ortaya çıkarabilir (Şekil 2D).
MuscleX kullanarak veri analizi. Burada MuscleX paketinde "Ekvator" rutini kullanarak Ekvatorik yansıma analizinin bir örneğidir (Şekil 3). MuscleX, BioCAT13' de geliştirilen açık kaynaklı bir analiz yazılım paketidir. Ekvatorik yoğunluk oranı (ı1, 1/i1, 0), miyozin 'in dinlenme kasındaki aktin yakınlık göstergesidir (Şekil 3A), ancak sözleşmeli bağlı çapraz köprüler sayısı ile yakından ilişkilidir ( Şekil 3B) murine iskelet kas2. Yoğunluk oranı, ben1, 1/ı1, 0, yaklaşık 0,47 dinlenme kas ve yaklaşık 1,2 taahhüt kas. İki 1, 0 yansıma (2 * S1, 0) arasındaki uzaklık inter-filament aralığı için ters ilişkilidir. MuscleX için ayrıntılı belgeler ve kılavuzlar online13mevcuttur.
Şekil 1 : Mekanik ve X-ışını deneyi kurulumu ve protokolü. (A) kas deneysel oda içinde bir kanca bir ucuna ve diğer ucunda bir çift mod motor/kuvvet dönüştürücü monte edilir. X-ışınlarının geçmesine izin vermek için iki Kapton film pencereleri arasında tutulur. Oda, deneme boyunca% 100 oksijeni olan Ringer 'in çözeltisi ile doludur. (B) tetanik kasılma sırasında bir kas üzerinde X-ışını deneyleri için mekanik protokol. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : EDL X-ışını kırması desenleri. EDL kas X-ışını dikesasyon deseni dinlenme (A) ve taahhüt (B) Kas. (C) dinlenme ve taahhüt deseni arasındaki fark deseni. Mavi bölge, dinlenme deseninde yüksek yoğunluğa sahip olmakla beraber, sarı bölge taahhüt deseninde yüksek yoğunluğu temsil eder. (D) EDL kas ile 1 MS pozlama X-ışını dikesasyon deseni. MLL1 = Ilk sipariş miyosin katman çizgisi; MLL4 = dördüncü sipariş miyosin katman çizgisi; ALL1 = Ilk sipariş akin katman çizgisi ALL6 = altıncı sipariş akin katman çizgisi; ALL7 = yedinci sipariş aktin katman çizgisi; TM = tropomyosin yansıması (beyaz kutuyla gösterilir); M3 = üçüncü sipariş Meridional yansıma; M6 = altıncı sipariş Meridional yansıma. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : MuscleX kullanarak Ekvator desenleri veri analizi. Arka planda Ekvator yoğunluk oranı profili (alan) ve ilk beş sipariş (yeşil çizgiler) her zirvede yoğunluğunu hesaplamak için uygun idi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bizim gruptan son yayınlar, fare iskelet kas X-ışını desenleri sağlık ve hastalık kas sarkomerik yapısal bilgi ışık tutmak için kullanılabilir gösterdi1,2,3 özellikle çeşitli miyopatiler için genetik modifiye fare modellerinin artan kullanılabilirliği. Tek liflerde yüksek çözünürlüklü mekanik çalışmalar veya X-ışını kırması ile birlikte küçük paketler en iyi uzmanlar tarafından yapılır. Ancak, daha mütevazı mekanik bilgi amaçlarınız için yeterli olacaktır, tüm kas hazırlama basit bir hazırlık ayrıntılı X-Ray desenleri toplama sağlar.
Temiz bir diseksiyon başarılı bir kombine mekanik ve X-ışını deneyi için anahtarıdır. Bu kas parçaları gözyaşı ve düşük kuvvet yol olabilir beri diseksiyon sırasında soleus veya EDL kaslar ile ilgili hedef kas yanı sıra diğer kaslar çekmek için çok önemlidir. Ayrıca X-ışını desenlerini düşürebilecek hasarlı iç yapıya yol açabilir. Her şey X-ışını ışınında dağılacaktır beri, herhangi bir ekstra yağ uzak temizlik önemlidir, fasya içinde kollajen yanı sıra herhangi bir saç veya doku gevşek bit aşağıdaki Protokolü yaparken. Kas hazırlama ek uyumluluğu azaltmak için, aynı zamanda güvenli bir şekilde kas vücuda mümkün olduğunca yakın, kanca için tendonları kravat önemlidir.
Farklı X-ışını pozlama süreleri aynı kas bilgi farklı türde sağlayabilir. 18ID üzerinde tam kiriş kullanarak, bir analiz edilebilir Ekvator deseni 1 MS pozlama elde edilebilir (bkz. Şekil 2D). Bir çözümlenebilir ilk miyozin katman çizgi yansıma için, 10 MS toplam pozlama süresi genellikle gereklidir. M15 gibi daha yüksek sipariş Meridional yansımaları toplamak için (2,8 Nm miyosin Meridional yansıma) ve 2,7 Nm aktin Meridional yansıma, genellikle en az 1 s toplam pozlama gereklidir ama daha fazla 2 s toplam pozlama yüksek doğruluk için tavsiye edilir Ölçüm.
Deney için optimal röntgen dedektörü seçimi önemlidir. En ayrıntılı X-ışını desenleri için bir özelleştirilmiş CCD dedektör, BioCAT olarak CA. 40 μm piksel ve ~ 65 μm nokta Spread fonksiyonları phosphor, yüksek dinamik aralığı ve iyi uzamsal çözünürlüğü ile desenler sağlayabilir ama sadece bir seferde bir çerçeve alabilir. Zaman çözülen deneyler için, BioCAT 'taki foton sayma piksel dizi dedektörü 500 Hz 'de X ışını desenleri toplayabilir. Ancak bu dedektör ile 172 μm piksel boyutu, meridyenin iç kısmının ayrıntılı çalışmaları için yeterli uzamsal çözünürlük sağlamaz, ancak diğer amaçlar için yeterlidir. Biocat, 9.000 Hz 'lik maksimum kare hızında 75 μm gerçek çözünürlük sağlayan yüksek çözünürlüklü foton sayım dedektörü satın aldı. bu türün benzer dedektörleri önümüzdeki birkaç yıl içinde kas çalışmaları için akım dedektörleri yerini bekleniyor.
Üçüncü nesil synchrotrons X-ışınları çok yüksek Cereyanlar ile, radyasyon hasarı ciddi bir sorundur. İstediğiniz kırınım özelliklerini gözlemlemek için gerekli olandan daha fazla kiriş teslim etmek için kiriş hafifletmek için her zaman iyi bir seçimdir. Aynı toplam X-ışını pozlama, pozlama süresini zayıflatılmış bir ışından uzatarak elde edilebilir. Foton sayma piksel dizi dedektörleri bir avantajı bireysel Çerçeveler birlikte hiçbir gürültü cezası ile toplanır olabilir. O zaman bile radyasyon hasarı mümkündür. Radyasyon hasarı belirtileri kasılma maksimum kuvvet damla içerir, katman çizgi yansımaları bulaşmış, kas rengi bile değiştirmek.
Bozulmamış fare iskelet kas hazırlama sınırlamalarından biri deneyler sırasında bozulmamış kas sarkomer uzunluğu elde zorluk. Kaslar, video mikroskobu ve lazer kırması için çok kalın. Gelecekteki gelişmelerle birlikte, sarkomer uzunluğunu doğrudan kırılacak desenler14' ten tahmin etmek mümkün olabilir, yakın dönemde tek seçenek, burada açıklandığı gibi deneyden sonra ölçmek.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma Gelişmiş foton kaynak, ABD Enerji Bakanlığı (DOE) ofisi bilim Kullanıcı tesisi DOE ofis bilim tarafından Argonne Ulusal Laboratuvarı tarafından Sözleşme No altında işletilen kaynakları kullandı. DE-AC02-06CH11357. Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü 'nden Grant P41 GM103622 tarafından destekleniyordu. Pilatus 3 1M Dedektör kullanımı, NIGMS 'den Grant 1S10OD018090-01 tarafından sağlandı. İçerik yazarlar sadece sorumluluğundadır ve mutlaka ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü veya sağlık Ulusal Enstitüleri resmi görüşlerini yansıtmaz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | WPI | 500342 | |
| 4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
| Aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
| Data acquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
| Elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
| High-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
| Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro scissor | WPI | 503365 | |
| Motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
| Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
| Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
| Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |
References
- Ma, W., et al. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Kiss, B., et al. Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).
- Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).
- Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q). Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).
- Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle. Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).
- Wakabayashi, K., et al. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).
- Anderson, R., et al. Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
- National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). , National Academies Press. (2011).
- Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/ (2017).
- Alexander, R. M. V. A. The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert. Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).
- Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb. Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).
- Jiratrakanvong, J., et al. MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).
- Reconditi, M., et al. Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).
