Summary
Une série de méthodes pour déterminer le taux potentiel de DNRA sur la base de 14NH4+/15NH4+ analyses est fournie en détail. NH4+ est converti en N2O par plusieurs étapes et analysé à l’aide de la chromatographie au gaz quadrupole– spectrométrie de masse.
Abstract
L’importance de comprendre le sort du nitrate (NO3−), qui est l’espèce dominante de N transférée des écosystèmes terrestres aux écosystèmes aquatiques, a augmenté parce que les charges mondiales d’azote ont considérablement augmenté à la suite de l’industrialisation. La réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium (DNRA) et la dénitrification sont deux processus microbiens qui utilisent no3− pour la respiration. Par rapport à la dénitrification, les déterminations quantitatives de l’activité de la DNRA n’ont été effectuées que dans une mesure limitée. Cela a conduit à une compréhension insuffisante de l’importance de la DNRA dans les transformations no3− et des facteurs régulateurs de ce processus. L’objectif du présent document est de fournir une procédure détaillée pour la mesure du taux potentiel de DNRA dans les échantillons environnementaux. En bref, le taux potentiel de DNRA peut être calculé à partir du taux d’accumulation d’ammonium étiqueté 15N (15NH4+) dans 15NO3− incubation ajoutée. La détermination des 14concentrations de NH4+ et 15NH4+ décrites dans le présent document comprend les étapes suivantes. Tout d’abord, le NH4+ dans l’échantillon est extrait et piégé sur un filtre en verre acidifié comme sel d’ammonium. Deuxièmement, l’ammonium piégé est éluturé et oxydé à NO3− par oxydation du persulfate. Troisièmement, le NO3− est converti en N2O via un dénitrificateur déficient en réductase N2O. Enfin, le N2O converti est analysé à l’aide d’un système quadripolaire de spectrométrie par spectrométrie de masse précédemment développé. Nous avons appliqué cette méthode aux sédiments des marais salés et calculé leurs taux potentiels de DNRA, démontrant que les procédures proposées permettent une détermination simple et plus rapide par rapport aux méthodes décrites précédemment.
Introduction
La synthèse artificielle de l’engrais azoté et son application généralisée ont grandement perturbé le cycle mondial de l’azote. On estime que le transfert d’azote réactif des systèmes terrestres vers les systèmes côtiers a doublé depuis l’époque préindustrielle1. Une partie importante des engrais appliqués à un champ donné est emportée du sol vers les rivières ou les eaux souterraines, principalement sous le nomde NO 3− 2. Cela peut causer des problèmes environnementaux tels que la pollution de l’eau potable, l’eutrophisation et la formation d’hypoxie. NO3− dans les milieux aquatiques est retiré ou conservé dans l’écosystème par l’assimilation biologique et divers processus dissimilatoires microbiens. La dénitrification et l’anammox sont connus pour être des processus d’ablation microbienne majeurs pour no3−. La dénitrification est la réduction microbienne du NO3− aux produits gazeux N (NO, N2O et N2)couplée à l’oxydation d’un donneur d’électrons, tels que les substances organiques, réduisant ainsi le risque des problèmes susmentionnés. Anammox produit également N2 à partir de NO2− et NH4+; par conséquent, il élimine le N inorganique d’un écosystème. Inversement, la DNRA travaille à conserver le N dans un écosystème; il est généralement admis que la DNRA est effectuée principalement par des bactéries fermentatives ou des bactéries chimiolithoautotrophiques et qu’elles réduisent le N°3dissimilatoire− à la biodisponibilité et moins mobile NH4+.
Des études sur la DNRA ont été principalement réalisées dans des écosystèmes marins ou estuariens, tels que les sédiments océaniques ou estuariens et l’eau, le sol des marais salés ou saumâtres et le sol des mangroves. Les écosystèmes côtiers ou marins sont importants en tant que réservoirs pour enlever no3− des écosystèmes terrestres, et dans des études précédentes, DNRA a été montré pour contribuer sur un très large éventail de NO3− enlèvement (0–99%)3,4,5,6,7,,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. En outre, l’existence de la DNRA a été démontrée dans un large éventail d’environnements, y compris les milieux d’eau douce19, les sols paddy de riz20, et les sols forestiers21. Bien que ces études aient montré que la DNRA est potentiellement comparable à la dénitrification pour l’élimination du NO3− , les études mesurant l’activité du DNRA sont encore très limitées par rapport à celles mesurant la dénitrification.
Le taux de DNRA a été évalué à l’aide de 15techniques d’étiquetage N en conjonction avec l’analyse des données au moyen de modèles analytiques ou numériques. Une solution analytique pour calculer le taux de DNRA est basée sur l’augmentation de l’enrichissement de 15N du pool NH4+ après l’ajout de 15NO3− comme traceur. 15 N-étiqueté NO3− est ajouté à un échantillon et incubé, et le taux de DNRA peut alors être calculé à partir des variations de concentration et de rapport isotopique dans NH4+ avant et après une certaine période de temps. Dans cet article, une méthode de quantification de la concentration de NH4+ et du rapport isotopique, qui sont nécessaires pour calculer le taux de DNRA, est décrite en détail. Fondamentalement, la méthode rapportée ici est une combinaison de plusieurs techniques précédemment rapportées22,23,24,25,26 avec des modifications ajoutées à certaines procédures. La méthode est composée d’une série de cinq procédures composantes : (1) incubation d’un échantillon environnemental avec modification d’un traceur d’isotopes stables, 15NO3−, (2) extraction et récupération de NH4+ à l’aide d’une « rocédeur de diffusion » avec modifications, (3) oxydation du persulfate de NH4+ dans l’échantillon, composé de NH indigènes4+ et 15NH4+ dérivés de 15NO3− via l’activité DNRA, en N°3− et 15NO3−, (4) transformation microbienne ultérieure de NO3− et 15NO3− à N2O isotopomères par la méthode de dénitrification modifiée, et (5) quantification des isotopomères N2O utilisant la chromatographie gazeuse–spectrométrie de masse (GC/MS). Dans la section suivante, d’abord, la préparation des procédures (2) et (4) est décrite, puis, par la suite, les cinq procédures des composantes sont décrites en détail.
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Protocol
1. Préparation d’une enveloppe PTFE pour la capture quantitative de NH3 gazeux
- Placer un morceau de ruban de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 60 mm (25 mm de largeur) sur une petite feuille de papier d’aluminium (environ 300 mm x 450 mm de taille, essuyé avec de l’éthanol).
- Cendres un filtre en fibre de verre (10 mm de diamètre avec une taille de pore de 2,7 μm) à 450 °C pour 4 h dans un four à silencieux. Placez le filtre en fibre de verre un peu au-dessus du point médian de l’axe plus long de la bande (Figure 1a).
- Placez 20 μL de 0,9 mol/L H2SO4 au centre d’un filtre GF/D, et pliez immédiatement la bande PTFE à l’aide de deux pinces à épiler : une pince à timbre à fin plate et une pince à épiler à fin droite. Les étapes suivantes, les étapes 1.4 à 1.7, sont indiquées à la figure 1 et doivent être effectuées rapidement.
- Retournez la bande PTFE sur le filtre GF/D à la ligne pointillée indiquée à la figure 1a pour former la forme indiquée à la figure 1b.
- Sceller les deux côtés en pliant puis en appuyant étroitement sur le bord avec la pince à épiler (Figure 1c). N’appuyez pas trop fort et ne grattez pas la bande PTFE.
- Pliez l’extrémité ouverte avec la pince à épiler, puis appuyez sur le bord avec la pince à épiler (Figure 1d).
- Sceller l’extrémité ouverte en appuyant étroitement sur le bord avec la pince à épiler (Figure 1e). Le filtre GF/D ne doit pas être appuyé pendant cette procédure.
2. Préparation de la biomasse d’un dénitrificateur déficient en oxyde nitreux, Pseudomonas chlororaphis subsp. auréofaciens ATCC13985, pour la méthode de dénotrificateur
- Streak a 20% glycérol stock of Pseudomonas chlororaphis subsp. auréofaciens ATCC13985 on 1/4 strength tryptone soy broth (TSB) agar plates. Incuber les plaques à 25 °C pendant 2 à 3 jours.
- Transférer une colonie de P. chlororaphis dans un petit tube à essai contenant 5 ml de milieu et de culture du BST autoclavés (sans trembler) pendant une journée à 25 °C dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il obtienne une croissance maximale; cela sera utilisé comme la préculture.
- Transférer 3 ml de la préculture dans une bouteille de 1 L avec un bouchon en caoutchouc de silicium contenant 1 L de TSB modifié autoclavé fraîchement préparé complété par 10 mmol/L KNO323. Incuber la bouteille tout en agitant à l’aide d’un agitateur dans des conditions sombres à 25 °C. Après avoir cultivé pendant 8 h, remplacer le bouchon en caoutchouc de silicium par un bouchon à vis et fermer hermétiquement. Continuer la culture en anoxie pendant la nuit.
- Centrifuge la culture à 18 800 x g pendant 15 min à 4 °C pour obtenir des granulés de biomasse.
- Laver la biomasse emballée trois fois avec 30 mL de saline tamponnée de phosphate (D-PBS(-), pH 7.5 de Dulbecco), pour éliminer complètement le NO3−. Les conditions de la centrifuge sont les mêmes que dans l’étape 2.3.
- Après le lavage, re-suspendre la biomasse emballée avec 30 mL de D-PBS(-). Utilisez 1 mL de la suspension pour déterminer la densité cellulaire en mesurant OD600. Pipette 1 mL aliquots de la suspension restante en cryocials stériles contenant 0,8 mL de glycérol à 45%. Conserver les stocks de glycérol préparés à −80 °C jusqu’à l’utilisation (voir la section 6).
3. Élimination de l’oxygène, du nitrite et du nitrate des sédiments échantillonnés
- Peser 3,0 g (poids humide) de sédiments dans un flacon de verre de 20 m L et ajouter 9,0 mL d’eau de surface pour le suspendre (25 % w/w de lisier).
- Sceller le flacon avec un bouchon en caoutchouc butyle noir (lavé à l’eau échangée par ions et stérilisé par autoclavage) et un bouchon en aluminium.
- Purger la suspension et remplacer l’air de l’espace de tête par Ar (>99.99%) à 0,6 L/min pendant 20 min à l’aide d’un collecteur.
- Remplacer le gaz d’espace de tête Ar par ultra-pur (>99.99995%) Il en passant l’aspirateur pendant 90 s et en lui facturant 30 s. Répétez cette procédure quatre fois. Réglez la pression de gaz de l’espace de tête à 1,5 atm.
- Incuber les flacons à 20 °C pendant la nuit en secouant à 150 tr/min dans des conditions sombres à l’aide d’un shaker à température constante pour éliminer le reste de l’oxygène, du nitrate et du nitrite dans la suspension des sédiments et le gaz de l’espace de tête.
4. Expérience de cours de temps pour déterminer le taux de DNRA
- Remplacer le gaz d’espace de tête par un air frais ultra-pur Il utilise la même procédure qu’à l’étape 3.5 mais sans les quatre répétitions.
- Ajouter des substrats étiquetés et non étiquetés à chaque flacon selon le tableau 1 à l’aide d’une seringue étanche au gaz. Purger les solutions de substrat préalablement préparées dans des flacons de verre de taille adéquate à l’aide d’un lui ultra-pur avec la pression de l’espace de tête réglé à 1,5 atm pour éviter la contamination de l’air. Évitez l’injection involontaire de toute quantité d’air pendant les procédures d’injection.
- Incuber les flacons à 20 °C avec secousse à 150 tr/min. Ajouter les substrats à chaque flacon selon le tableau 1 et incuber pendant 1 h, 3 h et 5 h. Après l’arrêt de l’incubation, soumettre la suspension des sédiments dans les flacons aux procédures suivantes : étapes 4.4–4.9.
- Retirez le bouchon en aluminium et le bouchon en caoutchouc butyle de chaque flacon. Ensuite, ajouter le KCl (cendré à 450 °C pendant 4 h) jusqu’à une concentration finale d’environ 2 mol/L pour assurer la récupération du NH4+ des sédiments. Fermer les flacons à l’aide d’un bouchon en caoutchouc butyle et d’une fermeture en aluminium.
- Agiter les sédiments à 150 tr/min pendant 1 h à 4 °C dans des conditions sombres pour extraire le NH4+.
- Transférer l’ensemble de la suspension sédimentaire dans le flacon dans un tube de centrifugeuse en plastique de 50 mL et la centrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Rincez la paroi interne d’une seringue jetable de 10 mL fraîchement ouverte et attachez-la à un filtre à membrane d’acétate jetable fraîchement ouvert (taille des pores 0,22 μm, 25 mm de diamètre). Ensuite, rincez le filtre membranal avec 1 mL de supernatant. Placez l’unité de filtre à seringues rincées sur une bouteille de polypropylène à grande bouche (PP) de 20 m L.
- Filtrer le surnatant restant à travers un filtre à membrane d’acétate dans la bouteille pp de 20 mL. Conserver les extraits à −20 °C jusqu’à une analyse plus poussée.
5. Capture diffuse NH4+ en 2M H2SO4 absorbé au filtre GF/D dans l’enveloppe PTFE et l’oxydation du persulfate de NH4+ à NO3−
- Préparer des solutions standard de 14NH4Cl avec des gradients de concentration de 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L et 500 μmol/L. Pour l’analyse du ratio 15N, fixer la concentration totale de NH4+ à 200 μmol/L et préparer des rapports isotopiques de 100:0, 99,5:0,5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 et 10:90 avec des solutions standard pures 14NH4Cl et 15NH4Cl.
- Transférer 30 mg de MgO (cendré à 450 °C pendant 4 h) dans un flacon en verre de 20 mL et placer l’enveloppe PTFE dans le flacon.
- Transférer 5 mL d’un échantillon ou d’une norme dans le flacon contenant le MgO et l’enveloppe PTFE, et fermer immédiatement avec un bouchon en caoutchouc butyle gris. Sceller avec un bouchon en aluminium. Si la concentration de NH4+ devrait dépasser 500 μmol/L, diluer l’échantillon à moins de 500 μmol/L.
- Agiter les flacons à 150 tr/min pendant 3 h à 4 °C dans des conditions sombres.
- Retirez le bouchon en aluminium et le bouchon en caoutchouc butyle. Retirez l’enveloppe de PTFE de la fiole à l’aide de pinces à pointes, rincez soigneusement l’enveloppe et les pinces à épiler avec de l’eau échangée par ions, essuyez-les avec un papier d’essuyage, puis placez l’enveloppe sur un papier d’essuyage frais.
- Ouvrez l’enveloppe PTFE avec quelques pinces (l’utilisation des pinces à bout plat et à bout de point est recommandée) dans l’ordre inverse exact du pliage effectué aux étapes 1.4–1.7.
- Tenez la zone périphérique du filtre GF/D, où le H2SO4 est censé être non absorbé, avec les pinces à épiler à plat, et transférez-la dans un tube à vis de 11 mL avec un bouchon doublé PTFE. Rincer les pinces à épiler avec de l’eau échangée par ions et les essuyer avec du papier d’essuyage.
- Répétez les étapes 5.5–5.7 pour les enveloppes restantes.
- Ajouter 1 mL d’eau échangée par ions à chacun des tubes à essai, fermer le bouchon à vis et le maintenir sans trembler pendant au moins 30 min à température ambiante pour éliminer complètement le NH4+ du filtre GF/D. Au cours de cette étape, effectuez l’étape suivante (étape 5.10) en parallèle.
- Préparer le réactif de la solution d’oxydation du persulfate (POR)25,26.
- Parce qu’il ne peut pas être stocké, préparer la quantité exacte de POR nécessaire pour le traitement d’une seule journée d’échantillons.
- Pour préparer le POR pour traiter 50 échantillons, versez 100 ml d’eau échangée par ions dans une bouteille à vis de 200 mL et ajoutez 1,52 g de NaOH (catégorie d’analyse des composés azotés), 3 g d’acide borique et 5 g de K2S2O8 (catégorie d’analyse de l’azote et du phosphore) dans cet ordre. Immédiatement après l’ajout de chaque réactif, secouer la solution jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
- Si nécessaire, tremper la bouteille dans de l’eau chaude pour aider à la dissolution des produits chimiques; toutefois, il convient d’accorder une attention particulière à la contamination du no3− parce que l’eau du robinet contient normalement le no3−.
- Après l’étape 5.8, ouvrez le bouchon à vis, ajoutez 2 ml du réactif POR au tube à essai et fermez le tube hermétiquement à l’aide d’un bouchon à vis pour éviter toute perte ou contamination pendant les étapes suivantes.
- Tenez les tubes à essai sur une grille, enveloppez-les dans du papier d’aluminium à double couche et autoclavez-les pendant 1 h à 121 °C. Gardez les tubes en position verticale pendant cette étape et évitez les changements rapides de température après avoir terminé l’autoclaving.
6. Détermination du NO3− converti à partir de NH4+ par la méthode de dnitrifier à l’aide de quadrupole GC/MS
- Mélanger 100 mL de tampon stérile de phosphate de 40 mmol/L (pH 7,2) et 100 mL de glucose stérile de 30 mmol/L aseptiquement (phosphate de 20 mmol/L et 15 mmol/L glucose; finale).
- Ajouter un volume de 1/7,2 de glycérol de P. chlororaphis à 200 ml de la solution de glucose tamponnée par phosphate dans une fiole Erlenmeyer de 300 mL, et purger avec un He ultra-pur (>99.995%) flux pendant 1 h.
- Distribuer 2,0 mL de la suspension de denitrifier dans chaque flacon de 5 mL. Plafonnez les flacons d’un bouchon en caoutchouc butyle gris et d’une fermeture en aluminium.
- Remplacez l’air de l’espace-tête par un Ultra-pur He en passant l’aspirateur pendant 3 min et en chargeant le He pendant 1 min. Réglez la pression positive au gaz de l’espace de tête à 1,3 atm pour éviter une contamination involontaire de l’air.
- Injecter 1 mL d’un échantillon ou d’une norme à l’aide d’une seringue jetable de 1 mL. Notez la quantité exacte de l’échantillon effectivement injecté.
- Incuber les flacons pendant la nuit à 25 °C dans des conditions sombres.
- Injecter 0,3 mL de 6 mol/LL NaOH pour arrêter la dénitrification et absorber l’espace de tête CO2, ce qui perturbera par ailleurs sérieusement l’analyse N2O par GC/MS parce que le CO2 et le N2O ont le même poids moléculaire.
- Déterminer les quantités de 44N2O, 45N2O et 46N2O dans le gaz de l’espace de tête à l’aide du quadrupole GC/MS avec un port d’injection modifié25. Les conditions d’exploitation utilisées pour l’analyse GC/MS sont indiquées au tableau 2.
7. Analyse des données
- Dérivez la courbe d’étalonnage du NH4+ concentration de la relation linéaire entre la concentration connue de 14NH4+ et les intensités mesurées du signal du total produit 44N2O + 45N2O + 46N2O. Dérivez la courbe d’étalonnage pour le contenu de 15N de la relation linéaire entre l’atome connu %(c.-à-d.. 15N/14N+15N) et l’atome calculé% à l’aide d’une équation précédemment fournie27. Calculer la concentration de 15NH4+ en multipliant le total NH4+ par le rapport de 15N de NH4+.
- Calculer le taux potentiel de DNRA à l’aide d’équations fournies ailleurs28,29,30.
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Representative Results
Les résultats représentatifs présentés dans cet article ont été tirés de 15expériences de traçage de N sur les sédiments des marais salés. Le marais salé échantillonné a été récemment créé à la suite du tremblement de terre de 2011 dans la région de Moune de la ville de Kesen-numa dans la préfecture de Miyagi, au Japon. En septembre 2017, des sédiments de surface (0 à 3 cm) ont été collectés à deux sites dans les zones subtidales et intertidales. Tout d’abord, immédiatement après la collecte, les sédiments ont été tamisés à travers un maillage de 4 mm pour enlever les racines des plantes, les débris de coquillages et les décombres, puis homogénéisés. Les échantillons ont été stockés à 4 °C jusqu’à ce que l’analyse DNRA soit effectuée.
Les procédures d’incubation du 15NO3− et la détermination simultanée des concentrations de 14NH4+ et 15NH4+ ont été effectuées comme décrit dans la section du protocole. Une augmentation de la concentration de 15NH4+ tout au long de la période d’incubation a été observée pour tous les sédiments (figure 2). Nous avons calculé les taux de DNRA en divisant le taux d’accumulation de 15NH4+ par le rapport isotopique du N°3− pool29. Les taux calculés se situent dans la fourchette de 24,8 à 177 nmol-N g−1 sol sec h−1 (tableau 3) et étaient comparables aux valeurs trouvées dans les études précédentes. Cette gamme de taux obtenus est supérieure aux valeurs déclarées dérivées d’environnements similaires, y compris ceux des sédiments intertidales17, des marais salés5,16et d’autres environnements estuariens18,33,34, ainsi que d’environnements eutrophiques tels qu’un estuaire de rivière peu profond en Caroline du Nord31 et les réseaux urbains de la rivière de Shanghai32. À l’inverse, Fernandes et coll.13 ont signalé des taux potentiels plus élevés de DNRA dans les terres de mangroves riches en agriculture biologique en Inde. En général, DNRA est pensé pour être favorisé par un rapport élevé de disponible C aux accepteurs d’électrons35,36,37. Les échantillons démontrant les résultats représentatifs ont été prélevés dans un marais salé nouvellement créé par un tremblement de terre, qui avait été utilisé à l’origine comme champ de culture. Cette caractéristique particulière des échantillons peut contribuer au taux élevé observé de DNRA. Conformément à cette spéculation, le taux de DNRA dans la zone intertidale, qui est riche en composés organiques (données non indiquées) par rapport à la zone subtidale, était plus élevé que dans la zone subtidale (figure 2, tableau 3).
Figure 1 : Préparation d’une enveloppe PTFE pour la capture du NH3gazeux . L’enveloppe PTFE utilisée dans la procédure de diffusion est préparée en pliant la bande PTFE suivant les instructions indiquées dans les panneaux (A)–(E). Le filtre acidifié à l’intérieur de l’enveloppe capture le gazeux NH3. Ces étapes doivent être effectuées rapidement. Les informations détaillées sont fournies aux étapes 1.2–1.7 de la section protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Variation de la concentration de 15NH4+ par l’incubation anaérobie des sédiments. Les incubations de 15traceurs N des échantillons de sédiments ont été effectuées en double. La concentration de 15N-NH4+ est indiquée en nmol par poids sec des sédiments. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exemple de courbe d’étalonnage de faible concentration N2O. La zone de pointe de N2O a été obtenue par la somme de la zone de pointe de m/z 44, m/z 45 et m/z 46. Les configurations pour l’analyse GC/MS sont indiquées dans le tableau 2. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de ce chiffre.
| 15 Substrats étiquetés N et non étiquetés ajoutés à chaque flacon | ||
| 100mM | 100mM | |
| NH4Cl | K15NO3 | |
| Volume (μL) de la solution de stock de 100 mM ajoutée à chaque flacon | 24 | 60 |
| Concentration finale (μmol/L)* | >230§ | 570 |
| *les valeurs indiquées sont calculées en supposant que la teneur en eau des sédiments est de 50 % | ||
| §en fonction de la concentration d’ammonium de fond | ||
Tableau 1 : Combinaisons de substrats modifiés en flacons conservant environ 11 mL de la suspension des sédiments. Les échantillons ont été préparés en double et soumis à d’autres analyses après 1 h, 3 h et 5 h d’incubation.
| Équipement | |
| quadrupole GCMS | Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra |
| Colonne | CP-PoraBONDQ 25m; φ 0,32 mm; épaisseur du film, 5μm |
| Conditions analytiques | |
| temp de colonne | 40 °C |
| température du port d’injection | 100 °C |
| flux de gaz porteur | Débit total, 47,1 mL•min-1 débit dans la colonne, 2,10 mL•min-1 |
| rapport sprit | 20 |
| tension de détection | 1,5 kv |
| Sensibilité de N2O | |
| limite inférieure de détection (LOD)* | 1,42 h 42 |
| limite inférieure de quantification (LOQ)* | 16h58 |
| *LOD et LOQ ont été déterminés par une relation linéaire entre une dilution en série de N2O (0,97, 1,94, 2,91, 4,75, 9,50, 14,3 ppm) dans He, réponses correspondantes dans la zone de pointe, et rapport S/N. LOD et LOQ ont été calculés comme des concentrations équivalentes à S/N=3 et S/N=10, respectivement. |
Tableau 2 : Conditions de l’analyse GC/MS.
| Sédiments | Taux de la DNRA | enrichissement du N°3- * |
| nmol-N g-1 h-1 | atome% | |
| Intertidal 1 | 177 | 99.9 |
| Intertidal 2 | 129 | 99.0 |
| Subtidal 1 | 39.3 | 99.9 |
| Subtidal 2 | 24.8 | 99.0 |
| *même que l’atome% de KNOajouté 3; l’élimination complète et aucune nitrification dans des conditions d’incubation utilisées n’a été testée précédemment. |
Tableau 3 : Taux potentiels de DNRA des sédiments intertidales et subtidales testés.
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Discussion
Le rapport concentration et isotope du NH4+ pour l’analyse DNRA a été quantifié à l’aide de plusieurs méthodes. Les concentrations et les rapports isotopiques de NH4+ sont généralement mesurés séparément. La concentration de NH4+ est généralement mesurée à l’aide de méthodes colorimétriques, y compris un autoanalyseur4,10,15,16,17. La mesure du rapport isotopique présente de grandes variations selon sa méthode deconversion, de piégeage et d’instrumentation NH4+ pour l’analyse. Les méthodes typiques incluent les méthodes suivantes :
(1) Le NH4+ dans l’échantillon est converti en NH3 via l’ajout de MgO ou NaOH. Après être passée de la phase liquide à la phase gazeuse, le NH3 est piégé sur un filtre à verre acidifié ou dans une solution acide. Après séchage, le filtre est brûlé et analysé comme N2 à l’aide d’un spectromètre de masse elétéral analyseur/isotope (EA-IRMS)11,18,22,38. Alternativement, le NH4+ capturé dans une solution acide est recueilli sur un adsorbent (par exemple, zéolite) et est brûlé et analysé via EA-IRMS10,12.
(2) NH4+ est oxydé à N2 par oxydation hypobromite. La composition isotopique de la N2 évoluée est mesurée par IRMS4,14,39 ou spectrométrie de masse d’introduction de membrane (MIMS)16,17.
(3) La concentration de NH4+ est déterminée à l’aide d’une chromatographie liquide haute performance sans aucune conversion. Parce que l’équilibre de NH4+ et NH3 est légèrement différent pour 15NH4+ et 14NH4+ près du pH de pKa, le 14NH4+ et 15NH4+ concentrations peuvent être déterminées sur la base d’un petit décalage dans le temps de rétention6,19,40.
La méthode décrite dans ce document est essentiellement la même que l’approche (1) énumérée ci-dessus, c’est-à-dire l’étape de récupération NH4+ comme NH3 sur un filtre en verre dans des conditions alcalines; toutefois, il est différent par rapport aux étapes séquentielles de conversion NH4+ suivantes. Ces étapes de conversion sont basées sur des études antérieures avec des modifications supplémentaires pour raccourcir le temps requis pour une série d’expériences. Tout d’abord, nous avons apporté quelques modifications à la méthode de détirificateur d’origine. Après que la biomasse de P. chlororaphis soit préparée comme décrit précédemment23,24, nous cultivons des bactéries et préservons la suspension concentrée de cellules comme stock de glycérol. Cette suspension cellulaire dense peut être directement utilisée pour l’analyse des isotopes en la mélangeant avec une solution tampon parce que l’activité de dnitrification a déjà été suffisamment induite. Même si des recherches plus poussées sont nécessaires, cette modification peut améliorer la reproductibilité de l’analyse car la méthode présentée permet la culture en masse de cellules dénitrificateurs, qui sont directement disponibles pour les analyses. Nous avons également modifié la composition de la solution pour suspendre les cellules bactériennes, d’un milieu basé sur le BST à une solution de glucose tamponnée par phosphate, afin d’exclure les composants inutiles tels que la peptone dans le milieu d’origine. Cette modification peut réduire la contamination par N blanc parce que la solution de glucose tamponnée par phosphate ne contient pas de N, contrairement au milieu d’origine utilisé dans les études précédentes; ceci devrait être testé par des analyses plus poussées. Dans l’étape de collecte NH4+ via la méthode de diffusion, nous avons raccourci la période d’incubation et abaissé la température pour minimiser la dégradation de N organique et toute conversion défavorable ou la perte de NH4+. La validité de cette modification a été vérifiée à l’aide de la linéarité de la courbe d’étalonnage. Nous avons également vérifié que la température modifiée et la période d’incubation n’ont pas affecté la récupération de NH4+ (données non indiquées).
Un autre avantage de cette méthode est que NH4+ est finalement converti en N2O, qui a un fond atmosphérique faible et peut être mesurée à l’aide quadrupole GC / MS, qui est moins cher et plus facile à gérer que IRMS. Dans la condition indiquée dans le tableau 2, le CO2 (m/z 44) et le N2O (m/z 44) sont complètement séparés par GC; le temps de rétention de ces gaz est de 1,15 et 1,07 min, respectivement. Étant donné que la concentration atmosphérique de N2O est de l’ordre de ppb, le N2O peut être mesuré avec une interférence atmosphérique négligeable, même en faibles concentrations. La courbe d’étalonnage du N2O passe presque à travers l’origine, démontrant l’influence sur la concentration de N2O due à la contamination atmosphérique est très limitée (Figure 3). Cette méthode a également l’avantage de quantifier les 14NH4+ et 15NH4+ concentrations ensemble; les méthodes canoniques, à l’exception de l’approche (3) énumérée ci-dessus, nécessitent des analyses individuelles pour la concentration et le rapport isotopique.
Dans l’ensemble, les limites de détection et de quantification du NH4+ utilisant cette méthode étaient d’environ 0,03 μmol et 0,09 μmol, respectivement, et ces valeurs sont équivalentes à 6 μmol/L et 18 μmol/L, si 5 mL de la solution échantillon (c.-à-d. l’extrait de sédiments dans ce cas) est utilisé pour la procédure de diffusion telle que décrite dans le présent document. Même si l’utilisation de la méthode colorimétrique est recommandée pour déterminer la concentration de NH4+ d’échantillons dont le NH4+est faible , la méthode proposée détermine efficacement le rapport isotopique NH4+ et la concentration dans les échantillons avec des concentrations relativement élevées d’ammonium.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Naoto Tanaka d’avoir aidé à la collecte de données et d’avoir développé le protocole. La collecte d’échantillons a été appuyée par le numéro de subvention 17K15286 de JSPS KAKENHI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
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