Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

14NH4+/15NH4+ Sıralı Dönüşüm Yoluyla N2O'ya Göre Amonyuma Nitrat Azaltma Nın Potansiyel Oranlarının Ölçülmesi

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/59562
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 4, 4, 5, 1
1Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Summary

14NH4+/15NH4+ analizlerine dayalı potansiyel DNRA oranını belirlemek için bir dizi yöntem ayrıntılı olarak verilmiştir. NH4+ birkaç adımla N2O'ya dönüştürülür ve quadrupole gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilir.

Abstract

Karasal ekosistemlerden sucul ekosistemlere aktarılan baskın N türü olan nitratın (NO3−)akıbetini anlamanın önemi, küresel azot yüklerinin sanayileşme sonrasında önemli ölçüde artması nedeniyle artmaktadır. Amonyuma (DNRA) ve denitrifikasyona kadar simizilar nitrat azaltma, solunum için NO3− kullanan mikrobik süreçlerdir. Denitrifikasyon ile karşılaştırıldığında, DNRA aktivitesinin kantitatif tayini sadece sınırlı ölçüde gerçekleştirilmiştir. Bu durum, DNRA'nın NO3− dönüşümlerde ve bu sürecin düzenleyici faktörlerinde öneminin yeterince anlaşılmasına yol açmıştır. Bu makalenin amacı, çevresel numunelerde potansiyel DNRA oranının ölçümü için ayrıntılı bir prosedür sağlamaktır. Kısaca, potansiyel DNRA oranı 15NO3- eklenen kuluçka 15N etiketli amonyum(15NH4+) birikim oranı hesaplanabilir. Bu yazıda açıklanan 14NH4+ ve 15NH4+ konsantrasyonlarının belirlenmesi aşağıdaki adımlardan oluşmaktadır. İlk olarak, Numunedeki NH4+ çıkarılır ve amonyum tuzu olarak asitlenmiş bir cam filtreüzerinde sıkışıp kalır. İkinci olarak, kapana kısılmış amonyum persülfat oksidasyonu yoluyla NO3−'e eluted ve oksitlenir. Üçüncü olarak, NO3− N 2 O2reductaze eksik denitrifier ile N2O dönüştürülür. Son olarak, dönüştürülmüş N2O daha önce geliştirilmiş bir quadrupole gaz kromatografisi-kütle spektrometresi sistemi kullanılarak analiz edilir. Bu yöntemi tuz bataklığı tortularına uyguladık ve önerilen prosedürlerin daha önce açıklanan yöntemlere göre daha basit ve daha hızlı bir belirleme sağladığını göstererek potansiyel DNRA oranlarını hesapladık.

Introduction

Azotlu gübrenin yapay sentezi ve yaygın uygulaması küresel azot döngüsünü büyük ölçüde tedirgin etti. Reaktif azotun karasal sistemlerden kıyı sistemlerine transferinin sanayi öncesi zamanlardan bu yana iki katına çıktığı tahmin edilmektedir1. Belirli bir alana uygulanan gübrelerin önemli bir kısmı topraktan nehirlere veya yeraltı sularına, öncelikle NO3− 2olarak yıkanır. Bu, içme suyu kirliliği, ötrofikasyon ve hipoksi oluşumu gibi çevresel sorunlara neden olabilir. NO3− su ortamlarında biyolojik asimilasyon ve çeşitli mikrobiyal sissimilatory süreçler ile ekosistemden çıkarılır veya korunur. Denitrifikasyon ve anammox NO3−için önemli mikrobiyal kaldırma işlemleri olduğu bilinmektedir. Denitrifikasyon NO3mikrobiyal azaltma - gaz N ürünleri (NO, N2O ve N2)organik maddeler gibi bir elektron donör oksidasyonu ile birleştiğinde, böylece yukarıda belirtilen sorunların riskini azaltarak. Anammox ayrıca NO2− ve NH4+n2 üretir; bu nedenle, bir ekosistemden inorganik N kaldırır. Tersine, DNRA bir ekosistemde N'yi korumak için çalışır; DNRA'nın öncelikle fermantif bakteriler veya chemolithootrofik bakteriler tarafından yapıldığı ve sentezsiz NO3− biyo-kullanılabilir ve daha az mobil NH4+azaltmak olduğu genel olarak kabul edilmektedir.

DNRA ile ilgili çalışmalar öncelikle okyanus veya haliç tortuları ve su, tuz veya acı bataklık toprağı ve mangrov toprağı gibi deniz veya haliç ekosistemlerinde yapılmıştır. Kıyı veya deniz ekosistemleri NO3- karasal ekosistemlerden kaldırmak için rezervuarlar olarak önemlidir, ve önceki çalışmalarda DNRA NO3çok geniş bir yelpazede katkıda bulunduğu gösterilmiştir− kaldırma (0-99%)3,4,5,6,,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Ayrıca, DNRA varlığı tatlı su ortamları19,pirinç çeltik toprakları20ve orman toprakları21dahil olmak üzere ortamlarda geniş bir yelpazede gösterilmiştir. Bu çalışmalar DNRA'nın NO3− kaldırma için denitrifikasyonla potansiyel olarak karşılaştırılabilir olduğunu gösterse de, DNRA aktivitesini ölçen çalışmalar denitrifikasyonu ölçenlerle karşılaştırıldığında hala çok sınırlıdır.

DNRA oranı analitik veya sayısal modeller aracılığıyla veri analizi ile birlikte 15N-etiketleme tekniği kullanılarak değerlendirilmiştir. DNRA oranını hesaplamak için bir analitik çözüm, 15NO3− bir izleyici olarak eklendikten sonra NH4+ havuzun 15N zenginleştirme deki artışa dayanır. 15.000 N etiketli NO3− bir numuneye eklenir ve kuluçkaya yatırılır ve DNRA oranı belirli bir süre den önce ve sonra NH4+ konsantrasyon ve izotop oranı değişikliklerinden hesaplanabilir. Bu yazıda, DNRA oranını hesaplamak için gerekli olan NH4+ konsantrasyonu ve izotop oranını ölçme yöntemi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Temel olarak, burada bildirilen yöntem birkaç daha önce bildirilen tekniklerin 22,23,,24,25,26 bazı prosedürlere eklenen değişiklikler ile bir kombinasyonudur. Yöntem beş bileşenli prosedürlerin bir dizi oluşur: (1) kararlı bir izotop tracer, 15NO3−, (2) ekstraksiyon ve NH4kurtarma ile bir çevre numunesinin kuluçka+ modifikasyonları ile bir "difüzyon prosedürü" kullanarak, (3) NH4+ persülfat oksidasyonu + örnek, yerli NH4+ ve 15NH4+ 15NO3türetilen - No3− ve 15 NO 3− ve 15NO3sonrakimikrobiyal dönüşüm içine -ve 15NO3− modifiye denittrimetre yöntemi ile N2O izotopomerlere ve (5) gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC/MS) kullanarak N2O izotopomerlerin niceleştirilmesine kadar. Aşağıdaki bölümde, ilk olarak, yordamlar (2) ve (4) için hazırlık açıklanır ve daha sonra, beş bileşen prosedürleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gazlı NH3'ü nicel olarak yakalamak için ptfe zarfının hazırlanması

  1. 60 mm'lik bir politetrafloroetilen (PTFE) bandı (25 mm genişliğinde) küçük bir alüminyum folyo levhaya (etanol ile silinmiş yaklaşık 300 mm x 450 mm) yerleştirin.
  2. 450 °C'de 4 50 °C'de bir boğucu fırında 4 saat boyunca cam elyaf filtresi (10 mm çapında ve 2,7 m'lik gözenek boyutunda) kül edin. Cam elyaf filtresini bandın uzun ekseninin orta noktasının biraz üzerine yerleştirin(Şekil 1a).
  3. GF/D filtrenin ortasında 0,9 mol/L H2SO4'ün 20 μL'sini tespit edin ve PTFE bandını hemen iki cımbız kullanarak katlayın: düz uçlu pul cımbızları ve düz uçlu cımbız. Aşağıdaki adımlar, 1.4-1.7 adımları Şekil 1'de gösterilmiştir ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
  4. PTFEbandını Şekil 1b'de gösterilen şekli oluşturmak için Şekil 1a'da gösterilen noktalı çizgideki GF/D filtresi nin üzerine çevirin.
  5. Her iki tarafı da katlama ve cımbızla sıkıca bastırarak mühürleyin (Şekil 1c). Çok fazla bastırmayın ve PTFE bandını çizmayın.
  6. Cımbızla açık ucu katlayın ve sonra cımbızla kenarına basın (Şekil 1d).
  7. Cımbızla kenarı sıkıca bastırarak açık ucu kapatın (Şekil 1e). Bu işlem sırasında GF/D filtresine basılmamalıdır.

2. Bir azot oksit redüktaz eksik denitrifier biyokütle hazırlanması, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, denitrifier yöntemi için

  1. Streak Pseudomonas klororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 bir% 20 gliserol stok 1/ 4 mukavemettry tryptone soya suyu (TSB) agar plakaları. Plakaları 25 °C'de 2-3 gün kuluçkaya yatırın.
  2. P. chlororaphis kolonisini, maksimum büyüme elde edene kadar 25 °C'de karanlıkta bir gün boyunca aerobik olarak (titremeden) 5 mL otoklavlı TSB ortamı ve kültürü içeren küçük bir test tüpüne aktarın; bu önkültür olarak kullanılacaktır.
  3. 10 mmol/L KNO323ile desteklenen taze hazırlanmış otoklavlı modifiye TSB 1 L içeren silikon kauçuk stoper ile 1-L şişe prekültür 3 mL aktarın. 25 °C'de karanlık koşullarda bir karıştırıcı kullanarak çalkalarken şişeyi kuluçkaya yatırın. 8 saat boyunca yetiştirdikten sonra, silikon kauçuk durdurucuyu bir vida kapağı ile değiştirin ve sıkıca kapatın. Bir gecede anokside ekime devam edin.
  4. Biyokütle peletleri elde etmek için kültürü 18.800 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin.
  5. Paketlenmiş biyokütleyi 30 mL'lik Dulbecco fosfat tamponlu salin (D-PBS(-), pH 7.5 ile üç kez yıkayın ve NO3− . Santrifüj koşulları Adım 2.3'teki yle aynıdır.
  6. Yıkandıktan sonra, 30 mL D-PBS(-) ile paketlenmiş biyokütleyi yeniden askıya alın. OD600ölçerek hücre yoğunluğunu belirlemek için süspansiyonun 1 mL'sini kullanın. Pipet 1 mL kalan süspansiyon% 45 gliserol 0.8 mL içeren steril cryovials içine aliquots. Hazırlanan gliserol stoklarını kullanıma kadar −80 °C'de saklayınız (bkz. bölüm 6).

3. Numune tortularından oksijen, nitrit ve nitratın ortadan kaldırılması

  1. 20 mL cam şişeiçine 3,0 g (ıslak ağırlık) tortu tartın ve askıya almak için 9,0 mL yüzey suyu ekleyin (%25 w/w bulamaç).
  2. Şişeyi siyah bütil kauçuk durdurucu (iyon değişimi suyuyla yıkanmış ve otoklavlama yoluyla sterilize edilmiş) ve alüminyum bir kapakla kapatın.
  3. Süspansiyonu temizle ve kafa boşluğu havasını Ar ile değiştirin (>99.99%) manifold kullanılarak 20 dk için 0,6 L/dk.
  4. Ar headspace gazını ultra saf (>99.99995%) ile değiştirin O 90s için vakumlama ve 30s için O şarj ederek. Bu yordamı dört kez tekrarlayın. Kafa boşluğu gaz basıncını 1,5 atm'ye ayarlayın.
  5. Tortu süspansiyonu ve kafa boşluğu gazındaki oksijen, nitrat ve nitriti ortadan kaldırmak için sabit bir sıcaklık çalkalayıcı kullanarak karanlık koşullarda 150 rpm'de sallayarak şişeleri bir gecede 20 °C'de inkübe edin.

4. DNRA oranını belirlemek için zaman kursu deneyi

  1. Headspace gaz taze ultra saf He adım 3.5 aynı prosedürü kullanarak ama dört tekrarları olmadan değiştirin.
  2. Gaz geçirmez bir şırınga kullanarak butil kauçuk durdurucu aracılığıyla Tablo 1'e göre her şişeye etiketli ve etiketsiz yüzeyler ekleyin. Hava kontaminasyonunu önlemek için kafa boşluğunun basıncı 1,5 atm'ye ayarlanmış ultra saf He kullanarak yeterli büyüklükteki cam şişelerde önceden hazırlanmış substrat solüsyonlarını temizleyin. Enjeksiyon işlemleri sırasında herhangi bir miktarda havanın kasıtsız enjeksiyonundan kaçının.
  3. 20 °C'de 150 rpm'de sallayarak tüplerini kuluçkaya yatırın. Tablo 1'e göre her şişeye yüzeyleri ekleyin ve 1 saat, 3 saat ve 5 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka durdurulduktan sonra, şişelerde tortu süspansiyonu aşağıdaki prosedürlere tabi tutulur: adım 4.4-4.9.
  4. Her şişeden alüminyum kapak ve bütil kauçuk stoper çıkarın. Daha sonra, NH4+ tortudan geri kazanımı sağlamak için yaklaşık 2 mol/L'lik son konsantrasyona kadar tortu süspansiyonuna KCl (450 °C'de 4 saat için ashed) ekleyin. Şişeleri butil kauçuk durdurucu ve alüminyum kapakla kapatın.
  5. NH4+çıkarmak için karanlık koşullarda 4 °C'de 1 saat boyunca 150 rpm'de tortuyu çalkalayın.
  6. Şişedeki tüm tortu süspansiyonuna 50 mL plastik santrifüj tüpüne ve 10.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüj e aktarın.
  7. Yeni açılmış 10 mL tek kullanımlık şırınganın iç duvarını durula ve yeni açılmış tek kullanımlık selüloz asetat membran filtresine (gözenek boyutu 0,22 μm, 25 mm çapında) takın. Daha sonra membran filtresini 1 mL supernatant ile durulayın. Durulanmış şırınga filtre ünitesini 20 mL geniş ağızlı polipropilen (PP) şişeye yerleştirin.
  8. Kalan süpernatantı asetat membran filtresinden 20 mL PP şişeye süzün. Ekstreleri ileri analize kadar −20 °C'de saklayın.

5. Ptfe zarfında GF/D filtresine emilen 2M H2SO4'te dağınık NH4+ yakalama ve NH4+ NO3' e persülfat oksidasyonu−

  1. 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L ve 500 mol/L konsantrasyon degradeleri ile 14NH4Cl standart çözümler hazırlayın. 15N oranı analizi için, NH4+ ila 200 μmol/L toplam konsantrasyonunu düzeltin ve 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 ve 10:90 izotop oranlarını saf 14NH4Cl ve 15NH4Cl standart çözümlerle hazırlayın.
  2. 30 mg MgO'yu (450 °C'de 4 saat) 20 mL'lik bir cam şişeye aktarın ve PTFE zarfını şişeye yerleştirin.
  3. MgO ve PTFE zarfını içeren şişeye numune veya standart 5 mL aktarın ve gri butil kauçuk durdurucu ile hemen kapatın. Alüminyum kapaklı mühür. NH4+ konsantrasyonunun 500 μmol/L'yi aşması bekleniyorsa, numuneyi 500 μmol/L'nin altına seyreltin.
  4. Şişeleri 150 rpm'de 3 saat 4 °C'de karanlık koşullarda sallayın.
  5. Alüminyum kapağı ve butil kauçuk durdurucuçıkarın. Ptfe zarfını uçlu cımbızları kullanarak şişeden alın, zarfı ve cımbızları iyon lakaplı suyla iyice durulayın, silme kağıdıyla silin ve zarfı taze bir silme kağıdına yerleştirin.
  6. 1.4-1.7 adımlarında yapılan katlamanın tam ters sırasına göre PTFE zarfını birkaç cımbızla açın (hem düz uçlu hem de nokta uçlu cımbız kullanılması önerilir).
  7. H2SO4'ün emilmemiş olması gereken GF/D filtrenin periferik alanını düz uçlu cımbızlarla tutun ve PTFE kaplı kapaklı 11 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın. Cımbızı iyon bozan suyla durulayın ve silerek kağıtla silin.
  8. Kalan zarflar için 5.5-5.7 adımlarını yineleyin.
  9. Test tüplerinin her birine 1 mL iyon değişimi suyu ekleyin, vida kapağını kapatın ve GF/D filtresinden NH4+ tamamen çıkarmak için oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca sallamadan saklayın. Bu adımda, aşağıdaki adımı (adım 5.10) paralel olarak gerçekleştirin.
  10. Persülfat oksitleyici çözelti (POR) reaktifini hazırlayın25,26.
    1. Depolanamadığından, bir günlük numunenin tedavisi için gereken por miktarını tam olarak hazırlayın.
    2. 50 numuneyi tedavi etmek için POR hazırlamak için, 200 mL'lik bir vidalı şişeye 100 mL iyon değişimi suyu dökün ve bu sırada 1,52 g NaOH (azot bileşik analiz sınıfı), 3 g borik asit ve 5 g K2S2O8 (azot ve fosfor analiz sınıfı) ekleyin. Her reaktifi ekledikten hemen sonra, çözeltiyi tamamen eriyene kadar sallayın.
    3. Gerekirse, kimyasalların çözünme yardımcı olmak için ılık suda şişe ıslatın; ancak, no3kontaminasyonu ile ilgili olarak dikkat edilmelidir− musluk suyu normalde NO3−içerdiğinden .
  11. Adım 5.8'den sonra vida kapağını açın, test tüpüne 2 mL POR reaktifi ekleyin ve aşağıdaki adımlar da herhangi bir kayıp veya kirlenmeyi önlemek için tüpü bir vida kapağıyla sıkıca kapatın.
  12. Test tüplerini bir rafta bekletin, çift katmanlı alüminyum folyoya sarın ve 121 °C'de 1 saat otoklavlayın. Bu adımda tüpleri dik konumda tutun ve otoklavlamayı bitirdikten sonra sıcaklıkta hızlı değişimlerden kaçının.

6. Quadrupole GC/MS kullanılarak denitrifer yöntemi ile NH4+'dan dönüştürülmüş NO3−

  1. 100 mL steril 40-mmol/L fosfat tamponu (pH 7.2) ve 100 mL steril 30-mmol/L glukoz aseptik (20-mmol/L fosfat ve 15-mmol/L glukoz; son) karıştırın.
  2. 300 mL Erlenmeyer şişesinde fosfat tamponlu glikoz çözeltisinin 200 mL'sine 1/7.2 hacimli P. klororaphis ekleyin ve ultra saf He (>99.995%) ile tasfiye 1 saat için akış.
  3. Denitrifier süspansiyonunun 2,0 mL'sini her 5 mL'lik şişeye dağıtın. Bir gri bütil kauçuk durdurucu ve alüminyum kapak ile şişeleri Kap.
  4. 3 dakika vakumlama ve 1 dakika için He şarj ederek ultra saf He ile headspace hava değiştirin. İstenmeyen hava kontaminasyonunu önlemek için kafa boşluğu gaz pozitif basıncını 1,3 atm'ye ayarlayın.
  5. 1 mL tek kullanımlık şırınga kullanarak butil kauçuk durdurucudan 1 mL numune veya standart enjekte edin. Enjekte edilen numunenin tam miktarına dikkat edin.
  6. Şişeleri karanlık koşullarda 25 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  7. Denitrifikasyonu durdurmak ve headspace CO2'yiabsorbe etmek için 0,3 mL 6-mol/LL NaOH enjekte edin, aksi takdirde Co2 ve N2O aynı molekül ağırlığına sahip olduğu için GC/MS tarafından N2O analizini ciddi şekilde bozacaktır.
  8. Modifiye enjeksiyon portu25ile quadrupole GC/MS kullanarak kafa boşluğundaki 44N2O, 45N2O ve 46N2O miktarlarını belirleyin. GC/MS analizi için kullanılan çalışma koşulları Tablo 2'degösterilmiştir.

7. Veri analizi

  1. NH4+ konsantrasyonu için kalibrasyon eğrisini bilinen 14NH4+ konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişkiden ve üretilen toplam 44N2O + 45N2O + 46N2O'nun ölçülen sinyal yoğunluklarından türetin. Bilinen atom%(yani,15 N/14N+ 15N) ve hesaplanan atom% arasında doğrusal ilişki den 15N içerik için kalibrasyon eğrisi türetin daha önce sağlanan bir denklem27kullanarak .15 Toplam NH4+ NH4+ 15N oranı ile çarparak 15NH4+ +konsantrasyonu hesaplayın.
  2. Başka bir yerde sağlanan denklemleri kullanarak potansiyel DNRA oranını hesaplamak28,29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu makalede sunulan temsili sonuçlar, tuz bataklığı çökeltilerinin 15N-izleme deneyinden elde edilmiştir. Örneklenmiş tuz bataklık yeni miyagi Prefecture Kesen-numa şehrin Moune alanında 2011 Büyük Doğu Japonya Depremi sonrasında oluşturuldu, Japonya. Eylül 2017'de yüzey tortuları (0-3 cm) subtidal ve intertidal bölgelerinde iki noktada toplanmıştır. İlk olarak, toplama hemen sonra, tortu bitki kökleri, kabukları enkaz ve moloz kaldırmak için 4-mm örgü ile elek ve daha sonra homojenize edildi. Numuneler DNRA analizi yapılana kadar 4 °C'de saklandı.

Protokol bölümünde açıklandığı gibi 15NO3− ve 14NH4+ ve 15NH4+ konsantrasyonlarının eşzamanlı olarak belirlenmesi için kuluçka işlemleri gerçekleştirildi. Tüm tortular için kuluçka dönemi boyunca 15NH4+ konsantrasyonda artış gözlenmiştir(Şekil 2). 15NH4+ birikim oranını NO3− havuz29'unizotop oranına bölerek DNRA oranlarını hesapladık. Hesaplanan oranlar 24.8-177 nmol-N g−1 kuru toprak h−1 ( Tablo3) aralığında ydı ve önceki çalışmalarda bulunan değerlerle karşılaştırılabilirdi. Elde edilen oranlarıbu aralığı intertidal sedimentler17,tuz bataklıkları5,,16, ve diğer haliç ortamları18,33,,34, yanı sıra Kuzey Carolina31 sığ bir nehir haliç gibi ötrofik ortamlardan da dahil olmak üzere benzer ortamlardan elde edilen rapor değerleri daha yüksektir32. Tersine, Fernandes veark. 13 Hindistan'da organik olarak zengin mangrov topraklarda daha yüksek potansiyel DNRA oranları bildirdi. Genel olarak, DNRA elektron kabul örlere mevcut C yüksek bir oranı tarafından tercih olduğu düşünülmektedir35,36,37. Temsili sonuçları gösteren örnekler, başlangıçta bir yetiştirme alanı olarak kullanılan bir deprem tarafından yeni oluşturulan bir tuz bataklığından alınmıştır. Örneklerin bu özel özelliği gözlenen yüksek DNRA oranına katkıda bulunabilir. Bu spekülasyonla tutarlı olarak, alt gelgit bölgesine göre organik bileşikler (veri gösterilmez) açısından zengin olan intertidal bölgesindeki DNRA oranı, subtidal bölgesinde kinden daha yüksekti(Şekil 2, Tablo 3).

Figure 1
Şekil 1: Gazlı NH3'üyakalamak için ptfe zarfının hazırlanması. Difüzyon işleminde kullanılan PTFE zarfı, panellerde (A)–(E)şeklinde gösterilen talimatlara uygun olarak PTFE bandı katlanarak hazırlanır. Zarfın içindeki asitli filtre gaza duyarlı NH3'üyakalar. Bu adımlar hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Ayrıntılı bilgi protokol bölümünde 1.2-1.7 adımlarında verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 15NH4+ konsantrasyonunda sedimanların anaerobik kuluçka yoluyla değişimi. Tortu örneklerinin 15N izleyici kuluçkaları çoğaltıldı. 15N-NH4+ konsantrasyonu tortu kuru ağırlığı başına nmol gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Düşük konsantrasyonndaki Kalibrasyon eğrisine bir örnek N2O. N2O'nun tepe alanı m/z 44, m/z 45 ve m/z 46'nın tepe alanı toplamı ile elde edilerek elde edilebildi. GC/MS analizi yapılandırmaları Tablo 2'de gösterilmiştir. Please click here to view a larger version of this figure.

15.000 Her şişeye n etiketli ve etiketsiz yüzeyler eklendi
100mM 100mM
NH4Cl K15NO3
Her şişeye eklenen 100 mM stok çözeltisinin hacmi (3L) 24 60
Son konsantrasyon (μmol/L)* >230§ 570
*gösterilen değerler, tortusu içeriğinin %50 olduğu varsayarak hesaplanır
§arka plan amonyum konsantrasyonuna bağlı olarak

Tablo 1: Tortu süspansiyonunun yaklaşık 11 mL'sini koruyan şişelere değiştirilen substrat kombinasyonları. Numuneler çoğaltılmış olarak hazırlandı ve 1 saat, 3 saat ve 5 saat kuluçkadan sonra daha fazla analize tabi tutuldu.

Ekipman
dört kutupLu GCMS Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra
Sütun CP-PoraBONDQ 25m; φ 0.32mm; film kalınlığı, 5μm
Analitik koşullar
sütun sıcaklığı 40 °C
enjeksiyon portu sıcaklığı 100 °C
taşıyıcı gaz akışı Toplam akış hızı, 47,1 mL•dk-1
kolondaki akış hızı, 2,10 mL•dk-1
sprit oranı 20
algılama gerilimi 1,5 kv
N2O hassasiyeti
alt algılama sınırı (LOD)* 1.42 pmol
alt ölçüleme sınırı (LOQ)* 4.58 pmol
*LOD ve LOQ, He'de N2O (0.97, 1.94, 2.91, 4.75, 9.50, 14.3 ppm) seri seyreltme arasında doğrusal bir ilişki, pik alandaki yanıtlarla ve S/N oranı ile doğrusal bir ilişki ile belirlendi. LOD ve LOQ sırasıyla S/N=3 ve S/N=10'a eşdeğer konsantrasyonlar olarak hesaplandı.

Tablo 2: GC/MS analizi için koşullar.

Tortu DNRA oranı NO3zenginleştirme- *
nmol-N g-1 saat-1 atom%
İntertidal 1 177 99.9
İntertidal 2 129 99.0
Subtidal 1 39.3 99.9
Subtidal 2 24.8 99.0
*eklenen KNO3'ünatom% ile aynıdır; kullanılan kuluçka koşullarında tam eliminasyon ve nitrifikasyon daha önce test edilmemiştir.

Tablo 3: Test edilen intertidal ve subtidal sedimentlerin potansiyel DNRA oranları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNRA analizi için NH4+ konsantrasyon ve izotop oranı çeşitli yöntemler kullanılarak ölçüldü. NH4+ konsantrasyonları ve izotop oranları genellikle ayrı ayrı ölçülür. NH4+ konsantrasyonu genellikle bir autoanalyzer4,10,,15,,16,17dahil olmak üzere kolorimetrik yöntemler kullanılarak ölçülür. İzotop oranı ölçümü, NH4+ dönüştürme, bindirme ve analiz için enstrümantasyon yöntemine bağlı olarak geniş farklılıklara sahiptir. Tipik yöntemler şunlardır:

(1) Numunedeki NH4+ MgO veya NaOH ilavesi ile NH3'e dönüştürülür. Sıvı fazdan gaz fazına geçtikten sonra, NH3 asitli cam filtresinde veya asit çözeltisinde sıkışıp kalır. Kurutuldıktan sonra, filtre yanmış ve N2 olarak analiz bir element analizörü / izotop oranı kütle spektrometresi (EA-IRMS)11,18,22,38. Alternatif olarak, yakalanan NH4+ bir asit çözeltisi bir adsorbent (örneğin, zeolit) toplanır ve yanmış ve EA-IRMS10,,12ile analiz edilir.

(2) NH4+ hipobromit oksidasyonu ile N2'ye oksitlenir. Evrimleşmiş N2 izotopik bileşimi IRMS4,14,39 veya membran giriş kütle spektrometresi (MIMS)16,17ile ölçülür.

(3) NH4+ konsantrasyonu herhangi bir dönüşüm olmaksızın yüksek performanslı sıvı kromatografi kullanılarak belirlenir. NH4+ ve NH3 dengesi 15NH 44+ ve 14NH4+ pKapH yakın için biraz farklı olduğundan, 14NH4+ ve 15NH4+ konsantrasyonları tutma süresi6küçük bir kayma dayalı olarak belirlenebilir 6,19,40.

Bu yazıda açıklanan yöntem temelde yukarıda listelenen yaklaşım (1) ile aynıdır, yani, alkali koşullar altında bir cam filtre üzerinde NH4+ NH3 olarak geri kazanım adım; ancak, aşağıdaki sıralı NH 44+ dönüşüm adımları ile ilgili olarak farklıdır. Bu dönüştürme adımları, bir dizi deneme için gereken süreyi kısaltmak için ek değişikliklerle yapılan önceki çalışmalara dayanmaktadır. İlk olarak, orijinal denitrifier yönteminde birkaç değişiklik yaptık. P. chlororaphis biyokütle daha önce açıklandığı gibi hazırlanansonra 23,24, biz bakteri büyümek ve bir gliserol stok olarak konsantre hücre süspansiyon korumak. Bu yoğun hücre süspansiyonu, denitrifying aktivitesi zaten yeterince indüklenen çünkü bir tampon çözeltisi ile karıştırarak izotop analizi için doğrudan kullanılabilir. Daha fazla araştırma gerekmesine rağmen, sunulan yöntem doğrudan analizler için kullanılabilir denitrifier hücrelerinin toplu ekimini sağladığından, bu değişiklik analizin tekrarlanabilirliğini artırabilir. Ayrıca bakteri hücrelerinin askıya alınması için çözeltinin bileşimini, TSB'ye dayalı bir ortamdan fosfat tamponlu glikoz çözeltisine, orijinal ortamda pepton gibi gereksiz bileşenleri dışlamak için değiştirdik. Fosfat tamponlu glikoz çözeltisi N içermediğinden, önceki çalışmalarda kullanılan orijinal ortamın aksine, bu modifikasyon boş N ile kontaminasyonu azaltabilir; bu daha fazla analiz yoluyla test edilmelidir. Difüzyon yöntemi ile NH4+ toplama adım, biz kuluçka süresini kısaltılmış ve organik N ve herhangi bir olumsuz dönüşüm veya NH kaybı 44+kaybı en aza indirmek için sıcaklık düşürdü . Bu değişikliğin geçerliliği kalibrasyon eğrisinin doğrusallığı kullanılarak kontrol edildi. Ayrıca, değiştirilen sıcaklık ve kuluçka süresinin NH4+ (veriler gösterilmedi) iyileşmesini etkilemediğini de kontrol ettik.

Bu yöntemin bir diğer avantajı da NH4+ sonuçta düşük atmosferik arka plan ve daha az pahalı ve IRMS daha yönetmek için daha kolay quadrupole GC / MS kullanılarak ölçülebilir N2O dönüştürülür olmasıdır. Tablo 2'de gösterilen koşullar altında CO2 (m/z 44) ve N2O (m/z 44) Tamamen GC ile ayrılır; bu gazların tutma süresi sırasıyla 1,15 ve 1,07 dk'dır. N2O'nun atmosferik konsantrasyonu ppb sırasına göre olduğundan, N2O düşük konsantrasyonlarda bile ihmal edilebilir hava paraziti ile ölçülebilir. N2O'nun kalibrasyon eğrisi neredeyse orijinden geçerek atmosferik kontaminasyon nedeniyle N2O konsantrasyonu üzerindeki etkisini gösteren çok sınırlıdır(Şekil 3). Bu yöntem aynı zamanda 14NH4+ ve 15NH4+ + konsantrasyonları birlikte ölçebilen bir avantaja sahiptir; yukarıda listelenen yaklaşım (3) dışında kanonik yöntemler, konsantrasyon ve izotop oranı için bireysel analizler gerektirir.

Genel olarak, bu yöntem kullanılarak NH4+ için algılama ve niceleme sınırları sırasıyla 0,03 μmol ve 0,09 μmol idi ve bu değerler, numune çözeltisinin 5 mL'si (yani bu durumda sediment ekstresi) bu yazıda açıklandığı gibi difüzyon işlemi için kullanılıyorsa, bu değerler 6 μmol/L ve 18 μmol/L'ye eşdeğerdir. Kolorimetrik yöntemin kullanılması, nh4+ düşük olan numunelerin4konsantrasyonunun belirlenmesi için önerilmiş olsada,önerilen yöntem nh4+ izotop oranını ve amonyum konsantrasyonu nispeten yüksek olan numunelerde konsantrasyonu etkin bir şekilde belirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Naoto Tanaka'ya veri toplama ve protokolü geliştirmede yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Örneklerin toplanması JSPS KAKENHI Hibe Numarası 17K15286 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Tags

Çevre Bilimleri Sayı 164 azot döngüsü amonyuma distilasyon nitrat azaltma (DNRA) 15N tracer difüzyon yöntemi persülfat oksidasyonu quadrupole GC/MS tuz bataklığı
<sup>14</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup>/<sup>15</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup> Sıralı Dönüşüm Yoluyla N<sub>2</sub>O'ya Göre Amonyuma Nitrat Azaltma Nın Potansiyel Oranlarının Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuroiwa, M., Fukushima, K.,… More

Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter