Summary
ここでは、病原体の回復と転写解析に続いて下気道への浸入経路を非侵襲的に提供することにより、二次細菌性肺炎研究を改善する方法を提示する。これらの手順は再現可能で、カニューレ、ガイドワイヤー、光ファイバケーブルなどの特殊な機器なしで実行できます。
Abstract
インフルエンザ感染後の二次細菌性肺炎は、米国の主要な死因トップ10に常にランク付けされています。今日まで、共感染のマウスモデルは、一次感染と二次感染の両方の病理を探索するために開発された主要なツールであった。このモデルの普及にもかかわらず、点点手順、用量量、および有効性に関するかなりの不一致は、研究の間で一般的です。さらに、これらの取り組みは、病原体が感染後の疾患進行に直接影響を及ぼす可能性のある方法に対処する上で、ほとんど不完全であった。本明細書では、二次細菌性肺炎のマウスモデルに使用される病原体送達、回収、および分析の正確な方法を提供する。我々は、気管内注入により、制御された体積を下気道に直接均等に効率的かつ正確に送達することを実証する。肺は、病原体の負担を回復し、定量するために駆除することができる。感染した肺の切除後、その後の転写分析のために高品質の病原体RNAを抽出する方法について述べた。この手順は、専門の実験装置を使用せずに非外科的な送達方法であることから利益を得て、二次細菌性肺炎への病原体の寄与を調査するための再現可能な戦略を提供する。
Introduction
インフルエンザ感染後の二次細菌性肺炎は、米国における主要な死因であり、研究1,2の活発な領域である。二次細菌性肺炎のマウスモデルを用いた数多くの研究にもかかわらず、病原体の注入および尋問に関する矛盾は3、4、5のままである。さらに、これまでの多くの取り組みは、二次細菌感染の影響を受けやすいインフルエンザの免疫調節効果に焦点を当ててきたが、より最近のデータは、細菌病原体のウイルス調節が等しいことを示唆している。病気の確立に向けた貢献者 6,7,8,9.これらの新しいデータは、病原体応答の調査を容易にする共感染のマウスモデルにおける二次細菌性肺炎を探索するより正確な方法を必要とする。
インフルエンザ共感染モデルに特有の宿主生物は、二次細菌剤の投与前に一次インフルエンザ感染によって意図的に免疫不全化される。ヒト宿主で観察される疾患病因を最もよく複製するためには、各感染剤の個体および組み合わせ効果を観察するように、一次剤と二次剤の両方の病原体負荷を制御することが不可欠である。最も一般的には、マウスの呼吸器感染症は、鼻腔内投与3、4、5、6、10を介して確立されている。このルートは技術的に単純であり、一部の単剤感染アプリケーションに適している点と同様に、点眼手順、用量量、および有効性は内で非常に可変であるため、共感染モデルには不向きです。出版文献3,4,5,6.
二次細菌性肺炎の病因をより完全に理解するためには、宿主と病原体の両方の寄与を考慮する必要があります。そのために、感染した肺から生存可能な細菌や病原体RNAを回収するための簡単で再現性の高いアプローチを開発しました。この方法は、簡略化された非侵襲的な気管内注入手順を使用し、その後細菌RNAを単離する。ここに記載される気管内点水手順は、前述の方法と同様であり、病原体送達11、12、13に限定されない。この特定の手順の使用は、低コストであることから利益を得て、カニューレ、ガイドワイヤー、光ファイバケーブルなどの特殊な機器を使用する必要はありません。さらに、この手順は非侵襲的であるため、マウスの被験者に対するストレスを最小限に抑え、接種力学からの炎症反応を最小限に抑え、複数の被験者の感染に対する効率的な送達経路を提供する。簡単に言えば、イソファラン麻酔マウスは切開部から懸濁される。鉗子は舌を穏やかに握るために使用され、その後、あらかじめ荷を積まれた曲がり、鈍い先端、21ゲージの針を気管に挿入し、病原体負荷を送達する。この手順の検証は、肺コンパートメントに均等に分布する色素の視覚的確認および細菌負荷の回収によって実証される。次に、感染した肺から生存可能な黄色ブドウ球菌(S.aureus)を回復する方法を示し、高品質の病原体RNAを分離する再現可能な方法を説明する。
Protocol
すべての方法は、国立衛生研究所のガイドラインに準拠し、モンタナ州立大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 気管内刺激
- 次の消耗品を含むワークスペースを準備する:挿管プラットホーム、無菌1 mLシリンジ、無菌の鈍い先端の鉗子、無菌の21ゲージの鈍い先端の針および注射器および鉗子を貯えるために2つの円錐形の管。
注:挿管プラットフォームは、商業的に購入することも、社内で構築することもできます。ここで使用される挿管プラットホームは0.25インチプレキシガラスを使用して組み立てられた。簡単に言えば、プレキシガラスに熱を加え、ボードは約65°の内部角度に曲がっています。挿管プラットフォームの外側には、2本の機械ネジが3インチ離れて播種され、2本のネジの間にゴムバンドが吊り下げられました。 - 目的の最終濃度が50μLの総体積で得られるようにサンプルを連続的に希釈して病原体接種を準備する。
- 滅菌手袋を着用し、21Gの鈍い先端の針を約35°に曲げます。
注:マウスごとに別々の針が必要です。 - 曲がった21Gの鈍い先端の針を1 mLの注射器に固定します。100 μL のエアクッションを注射器に引き込み、続いて感染剤の 50 μL を引き出します。荷を積んだ針と注射器を、支配的な手で簡単にアクセスできる場所に置きます。
- 4%イソフルラン/酸素混合物または同様のIACUC承認された麻酔法を用いてマウスを深く麻酔する。適切な麻酔深さは、呼吸速度が5〜8sあたり約1吸入に遅い場合に通常得られ、付属品をつまみ、マウスからの反応を観察することによって確認することができる。
注:麻酔のこの方法は、約1.5分の十分な麻酔期間を提供しました。これは、私たちの研究室のメンバーがこのインスティレーション手順を学び、実行するのに十分でした。しかしながら、他の制度的に承認された麻酔法は、11、12、13を採用してもよい。 - 麻酔室から麻酔マウスを取り出し、上顎切開から挿管プラットフォーム上のマウスを中断します。
- 気管に明確な通路を開くために、鈍い先端の鉗子を使用して、口の外側の舌を穏やかにつかみ、伸ばします。鉗子から非支配的な手の親指と人差し指に舌を移します。
- 非支配的な手で舌を保持し、プリロードされた注射器を拾います。針の曲がった端を体から離し、口腔に針を舌の基部に挿入します。
- 舌の付け根に針を付けて、手首をそっと角度を付けて、針を体から少し押し出します。このステップは針が食道ではなく気管に挿入されることを保証する。
- ゆっくりと気管に針を導きます。多くの場合、針が声の折り目を通過するようにわずかなダニが感じられます。針がカリーナに遭遇するにつれてわずかな抵抗が感じられるまで、気管を通して針を渡します。
- わずかに近位方向に針を持ち上げて、カリーナの上に針を吊り下げます。これは2つの主要な気管支への配達を可能にする。注射器のプランジャーを完全に押し下して、感染負荷を引き出します。気管から針を上に持ち上げて取り出し、捨てます。
- ゴムバンドを押し下げて挿管プラットフォームからマウスを取り外しますが、マウスを直立した位置に保持したままにします。鼻の上に直接指を置くことによって鼻気道を妨害する。約1分間、またはいくつかの深い呼吸が観察されるまで、この位置を保持します。
注:この最後のステップは、合計接種体積が下気道に送達されることを保証する。 - マウスをケージに戻し、麻酔からの完全な回復を観察します。
2. 感染した肺の切除
- 無菌性を維持するために層流フード内で働き、スケールおよび無菌の重量を量るボート、解剖プラットホーム、はさみおよび鉗子を含む解剖キット、無菌のRNAE自由なPBSおよび無菌ガーゼとのワークスペースを準備する。
- 感染したマウスをCO2または類似のIACUC承認済み安楽死法で安楽死させる。
- 感染したマウスを解剖プラットフォームに置き、各付属品の最後にピンを使用してマウスを固定します。作業面の無菌性を維持するためにエタノールでマウスをスプレーします。
- 臍から始まり、一対の鉗子を使用して皮膚を持ち上げ、気管の基部まで切開する。最初の切開の両側の皮膚をつかみ、皮膚を体から引き離し、組織の接続を切断する。
注:胸部領域の多くを明らかにするために、皮膚全体にいくつかの横切りを行うことができると便利です。 - xiphoid プロセスの基部から始まり、横隔膜を穿刺する意図で小さな切開を行います。これは、肺を後退させる胸腔内の圧力の増加をもたらす。肺を引き込んで、横隔膜を解放するために切開を続ける。
- 肋骨ケージの両側に沿って切開を行い、肋骨を取り除きます。これは完全に胸腔および肺を露出させる。
- 肺を取り除くために、鉗子で心臓の基部をつかみ、上に持ち上げます。肺の後ろにはさみを置き、心臓を上に持ち上げ続けながら、組織の接続を介して小さな切開を開始します。
- 肺を摘出したら、無菌ガーゼの上に置き、心臓を取り除きます。心臓は鉗子で肺から離れて持ち上げ、残りの組織の接続を切断することによって容易に取除くことができる。
- 肺をタール前の計量ボートに移し、重量を記録する。
- 肺の計量後、無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)に移し、病原体の回収と分析のステップに進むまで一時的に氷の上に保存します。
3. 病原体の回収と分析
- 層流フード内で作業を続け、次の消耗品でワークスペースを準備します:組織粉砕機、無菌RNAseフリーPBS、β-メルカプトエタノール(1:100)を補充したバッファRLT、および1.5 mL RNAEフリーマイクロセントリファージチューブ。
注意:β-メルカプトエタノールは、皮膚接触、摂取、眼接触、または吸入の場合に危険な場合があります。緩衝RLTへのβ-メルカプトエタノールの希釈は、ヒュームフードで行われるべきである。 - まず、無菌RNAseフリーPBSを1mLの菌組織粉砕機に添加します。充填したら、ティッシュグラインダーを氷の上に保管します。
- 感染した肺から回収された細菌負荷を定量化するために使用される一連の無菌RNAEフリーシリアル希釈管を準備します。これは、各マイクロ遠心管に900μLの滅菌水をアリコートし、続いて病原体の接種をシリアル希釈することによって最も容易に達成される。
注:正確な病原体の列挙に必要な希釈管の数は、初期病原体の入力と感染期間によって異なります。これは経験的に決定されなければなりません。 - 滅菌鉗子を使用して、準備されたティッシュ粉砕機に肺を移し、回転しながら台座を押すことによって組織を完全に均質化する。
- 均質化されたサンプルの組織粉砕機とアリコート100 μLを、調製されたシリアル希釈チューブの最初に開きます。サンプルを連続的に希釈し、栄養寒天にメッキを施すことでCUを列挙します。CFOは、肺組織のCFO/mLまたはCFC/mL/mgとして記録することができる。
注:このステップでは、ウイルスRNAの精製のために均質化されたサンプルの追加の200 μLを除去するか(材料の表を参照)、または将来の分析のために-80°Cで保存することができます。 - CFU判定および/またはウイルスRNA単離のためにアリコートを除去した後、4,000 rpm(3724 x g)で遠心分離により粉砕台座とペレットを4°Cで10分間遠心分離して置き換えます。
- ピペットを使用して、ペレットサンプルから上清を取り出し、1.5mLのマイクロ遠心管に入れます。
注:上清は細菌を含んでおらず、可溶性宿主および分泌された病原体因子の分析のために-80 °Cで貯えることができる。 - 700 μLの緩衝液RLT-mercaptoethanolでピペッティングまたはボルテックスにより均質化された組織ペレットを再懸濁し、無菌のRNAseフリー1.5mLマイクロ遠心分離管にサンプルを移します。
注:この時点でサンプルは数ヶ月間-80 °Cで貯えることができる。 - 精製キットのメーカーのプロトコルにわずかな変更を使用してRNAを精製する(材料の表を参照)。Voyich et al. 200814を参照してください。
- 均質化された肺スラリーを0.1mmのシリカビーズを含む2mLマイクロ遠心管に移し、6m/sで20秒のビーズビーターで処理します。
- サンプルを1,500 rpmで3分間遠心分離します。遠心分離後、上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心管にピペットします。
- サンプルに96%~100%エタノールの350μLを加え、ピペッティングまたは反転によって完全に混合します。
- 試料の700μLを2mL回収管に入れた精製カラムに移します。15 s の場合は ≥8,000 x gでサンプルを遠心分離し、フロースルーを破棄します。上記と同じ列を使用して、余分なサンプルを実行します。
- 700 μL のバッファー RW1 と遠心分離機サンプルを 15 s の ≥ 8,000 x gでカラムを洗浄し、シリカ膜カラムを新しい 2 mL 回収チューブに移します。
- 500 μL のバッファ RPE をカラムに適用します。15 s. フロースルーを破棄する ≥ 8,000 x gで遠心分離でカラムを洗います。
- RNeasy カラムにさらに 500 μL のバッファ RPE を適用し、8,000 x gで 2 分間フロースルーを破棄し、1 分間 ≥10,000 x gでカラムを遠心分離します。
- 精製RNAを溶出させるには、まずカラムを新しい1.5mL RNAEフリーマイクロ遠心分離管に移します。カラムのシリカゲル膜に直接トルナスフリー水のピペット50 μLを、1分間≥8000 x gで遠心分離機に直接入れます。
注: ELuted RNA を同じカラム上で再度実行して、RNA 歩留まりを高めることができます。 - 精製されたRNAに50 μLのRNaseフリー水を加え、総体積を100 μLにするアリコット350 μL RLT-θ-メルカプトエタノールに続いて、96%~100%エタノールの250 μLをサンプルに加え、ピペッティングまたは反転によって完全に混合します。
- サンプルをコレクションチューブに置き、遠心分離機を ≥8000 x gで 15 s. フロースルーを破棄し、コレクションチューブを交換します。
- 350 μL のバッファー RW1 を追加し、その後 15 s の ≥8000 x gで遠心分離を加えてカラムを洗浄します。
- 10 μL の DNase ストック (750 クニッツ単位/mL) をバッファー RDD の 70 μL に加えることで、約 27 クニッツ単位を含む DNase ソリューションを調べります。80 μLのDNase溶液をシリカゲル膜に直接加え、室温で15分間インキュベートします。
- 350 μL のバッファー RW1 と遠心分離機でカラムを 15 s の ≥8000 x gで洗浄し、フロースルーを破棄します。
- RNA を精製するには、手順 3.9.6 ~ 3.9.8 を繰り返します。
注: 3.9.9~ 3.9.10 および 3.9.6 ~ 3.9.8 (DNase ステップ 3.9.11~ 3.9.13 をスキップ) に従って、RNA クリーンアップ手順を繰り返すことをお勧めします。この追加のクリーンアップは、非常に高品質のRNAをもたらします。
- RNA歩留まりは、濃度を決定するための260 nMの測定値と純度のための260:280 nMの分光光度計を使用して定量することができます。RNA収率を得た後、各RNAサンプルの濃度を50ng/μLに標準化します。
注:RNAの劣化につながる凍結/解凍サイクルを避けるために、50 ng/μLの濃度で複数のアリコートを作ることをお勧めします。 - 精製したRNAを-80°Cに保存するか、直ちに転写分析に使用してください。
注:以前の出版物では、3~5匹のマウスからのRNAを転写物分析のためにプールした。上記の技術の最適化を通じて、1匹のマウスからのRNAは、転写分析(80-120 ng/μL)に十分であると経験的に決定された。
Representative Results
図1は、0.1%の重量/体積のクーマッシー・ブリリアントブルーの溶液を使用して、気管内インスティレーションが下気道内で直接均等に接種を行うことを実証しています。図2は、バクテリア(S.aureus)CFCが均質化された肺組織から直接回復したことを示す。図3は、個々のマウスからの入力および回復CFOをプロットすることにより、下気道における接種の正確な送達および回復のためにこのシステムを使用することを示す。図4は、細菌ハウスキーピング遺伝子gyrBのqRT-PCR増幅曲線を示し、細菌RNAが最小限のDNA汚染で感染した肺組織から直接抽出できることを実証する。図5は、感染した肺組織から直接抽出できるウイルスRNAを実証するインフルエンザAウイルスMセグメントのqRT-PCR増幅を用いた標準曲線の構築を示す。
図1:気管内注入により、下気道への分布も可能にする。(A, B)未感染の肺は、無菌PBSの気管内刺激に続いて健康なマウスから切除し、(A)背部および(B)腹部の視点から撮影した。(C,D)0.1%のクマシーブリリアントブルー溶液の50μLを、気管内投与を介して麻酔マウスに投与した。 (C)ドーサル。(D)腹部。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:感染した肺同質からの細菌CFEの代表的な回収肺はS.アウレウスとの1日後の挑戦後に切除された。均質化に続いて、肺スラリーの100μLを連続的に10-6で希釈した。回収したCFOを列挙するために、10μL滴を10-5及び10-6希釈から二等大豆寒天(TSA)にメッキし、一晩5%C02で37°Cでインキュベートした。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:気管内投与後の病原体接種の正確な送達および回収マウスをグループあたり3匹のマウスを含む2つの群に分け、その群を分け取った。マウスは、1 x 108(低)および2 x 108(高)CFU/mLでS.アウレウスの気管内インシュレウスを行った。感染後1時間、マウスを安楽死させ、肺を切除し、刺激と回復の精度を実証した。肺同質から回収された細菌の接種および細菌をTSA(トリプティック大豆寒天)にめっきした。細菌の入力と回収の間に有意な差は報告されなかった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:代表的な細菌RNA回収および純度。S.aureusの1 x 10 8 CFU/50 μLを用いた気管内刺激の6時間後に、マウスを安楽死させた。肺を取り除き均質化し、続いて緩衝液RLT-メルカプトエタノール中の肺スラリーの再懸濁を行った。RNAは、ステップ3.914に記載されているように精製した。qRT-PCRは、細菌ハウスキーピング遺伝子gyrBの転写物を検出するために使用された。回収されたRNAの純度を実証するために、逆転写酵素(nRT)を含まない対照が含まれていた。0.1の閾値では、gyrB転写物は21.1、20.3、および20.5の平均サイクルで検出された。nRT コントロールは、サイクル平均が 35.9、35.5、および 35.0 になるまで検出されませんでした。n = 3生物学的反復、3つの技術的反復/生物学的反復を含む。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:代表的なウイルスRNA回収。インフルエンザA/PR/8/1934(H1N1)の100 PFU/50 μLを用いた気管内浸留の6日後、マウスを安楽死させた。肺を切除して均質化し、200μLの均質化スラリーを採取し、ウイルスRNA精製前に70μm細胞ストレーナーを通過させた。精製したRNAを連続的に希釈し(10-1-10-4)、続いてインフルエンザAMセグメントの増幅を行った。(A)感染した肺から回収したインフルエンザA RNAの増幅プロットを10-1 -10-4に希釈した。(B)インフルエンザAMセグメントの標準曲線。しきい値 = 0.2、 R2 = 0.994、勾配 = -3.46。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このモデルの使用は二次細菌の伝染を研究するために非常に有効で、再生可能な方法を提供する。病原体接種の送達を厳密に制御する能力は、各病原体の個々および組み合わせ効果のより正確な観察を可能にする。より一般的な鼻腔内点水経路の非効率性は、文献に存在する用量量と濃度の不一致に寄与している可能性が高い。二次細菌性肺炎を研究するための正確なマウスシステムの欠如は、肺共感染症の重症度に寄与する細菌特異的な応答を同定する所見を遅らせたのは妥当である。二次細菌感染時のウイルス発現を研究する再現可能なモデルを開発することは、これらの感染症を改善するためのワクチンまたは薬物標的の同定につながる可能性がある。
気管内刺激ステップは、下気道感染および病原体の下流分析を正常に確立するために重要である。この技術を学ぶとき、感染性物質を投与する前に(方法で説明されているように)色素を使用して練習することが役立つかもしれません。色素を使用すると、気道への接種の直接可視化を可能にする。発生する可能性のある一般的な間違いは、気管ではなく食道に鈍い針を挿入することです。これは、肺ではなく胃に接種の配信になります。この間違いを修正するには、針を体から遠ざけて気管に渡します。一度習得すると、この手順は非常に効率的であり、多数のマウスで実験を行うために使用することができます。マウスを麻酔するバッチで作業し、気管内刺激はマウスあたり約30秒で完了することができる。さらに、肺の切除はマウス1匹につき2~3分で完了することができる。
感染した組織からの生存可能で純粋な細菌RNAの回収は、転写物分析に不可欠です。RNasesはユビキタスであり、すぐに実験15を台無しにすることができます.いくつかの方法は、RNase阻害剤を使用して含まれます;しかし、RLT-mercaptoethanolで-80°Cでサンプルを凍結するか、すべてのRNaseフリーチューブおよび試薬を用いてRNA単離のサンプルを直ちに処理することが、RNase汚染の低減に有効であることがわかった。さらに、一度に最大 6 つのサンプルを精製することをお勧めします。6つ以上のサンプルを含めると、RNAの劣化に終わる可能性のあるプロトコルステップ間の遅延が長くなる可能性があります。精製したら、不必要な凍結解凍サイクルを避けるためにも注意が必要です。したがって、1つのサンプルに対して複数の分析を行う場合は、-80°Cで保存するための精製RNAをアリコートすることをお勧めします。
本明細本で検討される技術に加えて、この方法は、肺16の切除および均質化の前に気管支肺胞洗浄を行うことによって補うことができる。これは、下気道全体の洗浄または縫合糸を使用して気管支の木の1つの分岐アームを制限し、残りの枝を通して洗浄することによって達成することができる。多くの場合、これは病原体負荷の回復の減少につながるが、乳酸脱水素酵素活性、細胞集団同一性、およびサイトカインプロファイルなどの情報が得られるサンプルを提供する16。これらのデータを組み合わせることで、二次細菌性肺炎の間に起こる宿主病原体相互作用をより完全に理解することができます。
議論された方法は二次細菌性肺炎の文脈の中にあったが、それらは下気道感染症の任意のマウスモデルに拡張するのに適している;具体的には、厳密に制御された配信とインストールされた接種の回復から利益を得るもの。さらに、他の多くの感染経路と同様に、気管内刺激は、治療および環境化合物12の投与などの非感染性用途で利用することができる。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、モンタナ州立大学のニコール・マイスナー博士に対し、気管内インスティレーション法の確立に協力してくれたことに感謝する。この研究は、米国国立衛生研究所(助成金NIH-1R56AI135039-01A1、GM110732、R21AI128295、U54GM115371)、ならびにモンタナ大学システム研究イニシアティブ(51040-MUSRI205-03)の資金によって支援されました。農業実験ステーション。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
| 21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
| FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
| TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
| Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
| Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |
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