Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En presis patogen levering og gjenoppretting system for murine modeller av sekundær bakteriell lungebetennelse

doi: 10.3791/59566 Published: September 21, 2019

Summary

Her presenterer vi metoder for å forbedre sekundær bakteriell lungebetennelse studier ved å gi en ikke-invasiv rute drypping inn i den nedre luftveiene etterfulgt av patogen utvinning og transkripsjon analyse. Disse prosedyrene er reproduserbar og kan utføres uten spesialisert utstyr som kanyler, lede ledninger eller fiberoptiske kabler.

Abstract

Sekundær bakteriell pneumonias følgende influensa infeksjoner konsekvent rang innenfor de ti viktigste årsakene til dødsfall i USA. Hittil har murine modeller av co-smitte vært det viktigste verktøyet utviklet for å utforske patologi både primære og sekundære infeksjoner. Til tross for utbredelsen av denne modellen, er betydelige uoverensstemmelser med hensyn til drypping prosedyrer, dose volumer og efficacies utbredt blant studiene. Videre har dette arbeidet i stor grad vært ufullstendig i adressering hvordan patogen kan være direkte påvirke sykdomsprogresjon post-smitte. Heri gir vi en presis metode for patogen levering, utvinning og analyse som skal brukes i murine modeller av sekundær bakteriell lungebetennelse. Vi viser at intratrakeal drypping muliggjør en effektiv og nøyaktig levering av kontrollerte volumer direkte og jevnt inn i de nedre luftveiene. Lungene kan være excised å utvinne og kvantifisere patogen byrde. Etter fjerning av de infiserte lungene, beskriver vi en metode for å trekke ut høy kvalitet patogen RNA for påfølgende transcriptional analyse. Denne prosedyren drar nytte av å være en ikke-kirurgisk metode for levering uten bruk av spesialisert laboratorieutstyr og gir en reproduserbar strategi for å undersøke patogen bidrag til sekundær bakteriell lungebetennelse.

Introduction

Sekundær bakteriell lungebetennelse etter influensa infeksjon er en ledende dødsårsaken i USA og et aktivt område av forskning1,2. Til tross for Tallrike studier med murine modeller av sekundær bakteriell lungebetennelse, inkonsekvenser om patogen drypping og avhør forbli3,4,5. I tillegg, mens mange tidligere tiltak har fokusert på immunmodulerende effekter av influensa som fører til en økt susceptibly til sekundær bakteriell infeksjon, nyere data antyder virulens regulering av bakteriell patogen er en likeverdig bidragsyter mot etablering av sykdom6,7,8,9. Disse nye data nødvendig en mer presis metode for å utforske sekundære bakteriell lungebetennelse i murine modeller av co-infeksjon som letter etterforskning av patogen respons.

Unik for influensa co-infeksjon modeller, vert organismer er forsettlig immunsupprimerte av en primær influensa infeksjon før administrasjon av sekundær bakteriell agent. For å best gjenskape sykdommen patogenesen observert i menneskelige verter, er det viktig at patogen belastningen av både primære og sekundære agenter styres for å observere den enkelte og Kombinatorisk effekter av hver smittsomme agent. Vanligvis har luftveisinfeksjoner i mus blitt etablert gjennom en intranasal administrasjon3,4,5,6,10. Ettersom denne ruten er kjent for å være teknisk enkel og kan være hensiktsmessig i noen enkelt agent infeksjon programmer, er det uegnet for co-smitte modeller, som drypping prosedyrer, dose volumer, og effekten er svært variabel i Publisert litteratur3,4,5,6.

For å få en mer fullstendig forståelse av sekundær bakteriell lungebetennelse patogenesen, bidrag av både verten og patogen må vurderes. For dette formål har vi utviklet en grei og reproduserbar tilnærming for gjenvinning av levedyktige bakterier og patogen RNA fra infiserte lunger. Denne metoden bruker en forenklet, ikke-invasiv intratrakeal drypping prosedyre etterfulgt av påfølgende isolering av bakteriell RNA. Intratrakeal drypping prosedyren beskrevet heri ligner på tidligere beskrevne metoder og er ikke begrenset til patogen levering11,12,13. Bruk av denne spesielle prosedyren fordeler av å være lave kostnader og krever ikke bruk av spesialisert utstyr som kanyler, lede ledninger, eller fiberoptisk kabel; Videre, fordi denne prosedyren er ikke-invasiv det sikrer minimal belastning på murine, minimerer en inflammatorisk respons fra inoculation mekanikere, og gir en effektiv levering rute for smitte av flere. Kort sagt, isoflurane anesthetized mus er suspendert fra fortenner. Tang brukes til å forsiktig gripe tungen etterfulgt av innsetting av en forhåndslastet bøyd, Butt-tippet, 21-gauge nål inn i luftrøret og levering av patogen belastning. Validering av denne prosedyren er demonstrert av visuell bekreftelse av fargestoff jevnt fordelt i lunge-rommet og gjenvinning av bakteriell belastning. Vi viser hvordan du kan gjenopprette levedyktig Staphylococcus aureus (S. aureus) fra infiserte lungene og beskrive en reproduserbar metode for å ISOLERE høy kvalitet patogen RNA.

Protocol

Alle metoder er i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved Montana State University.

1. intratrakeal drypping

  1. Forbered et arbeidsområde som inneholder følgende rekvisita: en intubering plattform, en steril 1 mL sprøyte, steril stump-tippet tang, steril 21-gauge Butt-tippet nål, og to koniske rør for å lagre sprøyten og tang.
    Merk: Intubering plattformer kan kjøpes kommersielt eller bygges internt. Den intubering plattformen som brukes her ble konstruert ved hjelp 0,25 tommers plexiglass. Kort, varme ble påført plexiglass og styret er bøyd til en omtrentlig 65 ° innvendig vinkel. På utsiden av intubering plattformen, to maskinskruer ble sådd 3 inches hverandre og en gummi-band ble suspendert mellom de to skruene.
  2. Forbered patogen inokulum ved å serielt fortynning av prøven slik at den ønskede endelige konsentrasjonen oppnås i et samlet volum på 50 μL. Oppbevar inokulum på is.
  3. Bruk sterile hansker, bøy en 21 G stump nål til ca. 35 °.
    Merk: en separat nål er nødvendig for hver mus.
  4. Fest den bøyde 21 G stump nålen til en 1 mL sprøyte. Trekk en 100 μL luft pute inn i sprøyten etterfulgt av 50 μL av smitte middelet. Plasser den lastede nålen og sprøyten på et sted som er lett tilgjengelig for den dominerende hånden.
  5. Dypt bedøve en mus ved hjelp av en 4% isoflurane/oksygen blanding eller lignende IACUC godkjent metode for anestesi. Riktig anestesi dybde er vanligvis oppnås når åndedrett priser sakte til ca 1 inhalasjon per 5-8 s og kan bekreftes ved å knipe en vedheng og observere ingen reaksjon fra musen.
    Merk: denne metoden for anestesi gitt en tilstrekkelig bedøvelsen varighet på ca 1,5 min. Dette var tilstrekkelig for medlemmer i laboratoriet vårt til å lære og utføre denne drypping prosedyren; men andre institusjonelt godkjent anestesi metoder kan være ansatt11,12,13.
  6. Fjern anesthetized musen fra anestesi kammeret og suspendere musen på intubering plattformen fra maksillære fortenner.
  7. For å åpne en klar passasje inn i luftrøret, bruk Butt-tippet tang for å forsiktig gripe og forlenge tungen utenfor munnen. Overfør tungen fra tang inn i tommelen og pekefingeren på den ikke-dominerende hånd.
  8. Forbli holde tungen i den ikke-dominerende hånd og plukke opp pre-Loaded sprøyten. Pek den bøyde enden av nålen bort fra kroppen og sett nålen inn i munnhulen til undersiden av tungen.
  9. Med nålen på undersiden av tungen, forsiktig vinkel håndleddet for å forårsake et svakt trykk på nålen vekk fra kroppen. Dette trinnet sikrer nålen vil bli satt inn i luftrøret og ikke spiserøret.
  10. Langsomt guide nålen ned i luftrøret; ofte en liten hake er følte som nålen passerer gjennom vokal fold. Pass nålen gjennom luftrøret til svak motstand er følte som nålen møter Carina.
  11. Litt løft nålen i proksimale retning for å suspendere nålen over Carina. Dette gjør at levering i de to primære bronkiene. Trykk helt ned sprøytes stempelet for å levere den smittsomme belastningen. Fjern nålen fra luftrøret ved å løfte oppover og kast.
  12. Fjern musen fra intubering plattformen ved deprimerende gummistrikk, men opprettholde holde musen i oppreist stilling. Hindre nese luftveiene ved å plassere en finger rett over nares. Hold denne posisjonen i ca 1 min eller til flere dype puster er observert.
    Merk: Dette siste trinnet sikrer at det totale inokulum volumet leveres i den nedre luftveiene.
  13. Returner musen til buret sitt og observere en fullstendig gjenoppretting fra anestesi.

2. fjerning av infiserte lunger

  1. Arbeide innenfor en laminær Flow hette for å opprettholde sterilitet, utarbeide et arbeidsområde med følgende elementer: en skala og steril veie båt, en disseksjon plattform, en disseksjon kit som inneholder saks og tang, sterile RNAse-Free PBS, og steril gasbind.
  2. Euthanize en infisert mus med CO2 eller lignende IACUC godkjent metode for dødshjelp.
  3. Plasser en infisert mus på en disseksjon plattform og fest musen ved hjelp av pinner på slutten av hver vedheng. Spray musen med etanol for å opprettholde sterilitet av arbeidsflater.
  4. Begynnelsen på navlen, bruk et par tang for å løfte huden og gjøre et snitt opp til bunnen av luftrøret. Fatte huden på hver side av den første snitt, trekke huden bort fra kroppen og skjære gjennom vevet tilkoblinger.
    Merk: det kan være nyttig å gjøre flere laterale kutt over huden for å avdekke mer av bryst regionen.
  5. Starter ved foten av xiphoid prosessen, lage et lite snitt med intensjon om å punktering membranen. Dette resulterer i en økning i trykket i bryst hulen som får lungene til å trekke tilbake. Med lungene trukket tilbake fortsette snittet for å frigjøre membranen.
  6. Fjern ribbeina ved å lage et snitt langs begge sider av ribbeinet buret. Dette vil fullt utsette bryst hulrommet og lungene.
  7. Til avgiftsdirektoratet lungene, ta tak i bunnen av hjertet med tang og løft oppover. Plasser saksen bak lungene og begynne å gjøre små snitt gjennom vevet forbindelser mens du fortsetter å løfte hjertet oppover.
  8. Når lungene er excised, legg dem på sterilt gasbind og fjerne hjertet. Hjertet kan lett fjernes ved å løfte den bort fra lungene med tang og kutte de resterende vev tilkoblinger.
  9. Overfør lungene til en pre-taraveies veie båt og ta opp vekten.
  10. Etter at lungene er veid, overføre dem til sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) og midlertidig lagre dem på isen til fremover til patogen utvinning og analyse trinn.

3. patogen Recovery og analyse

  1. Fortsetter å arbeide innenfor en laminær Flow hette, forberede et arbeidsområde med følgende forsyninger: en vev jeksel, steril RNAse-Free PBS, buffer RLT supplert med ß-mercaptoethanol (1:100), og 1,5 mL RNAse-Free mikrosentrifugen rør.
    FORSIKTIG: ß-mercaptoethanol kan være farlig når det gjelder hudkontakt, svelging, øyekontakt eller innånding. Fortynning av ß-mercaptoethanol i buffer RLT bør gjøres i en avtrekks hette.
  2. Begynn med først å legge 1 mL sterilt RNAse-Free PBS til vev jeksel. Når fylt, lagre vev jeksel på isen.
  3. Forbered en rekke sterile RNAse-Free seriell fortynning rør som vil bli brukt til å kvantifisere bakteriell lasten utvinnes fra den infiserte lungene. Dette er lettest oppnås ved aliquoting 900 μL av sterilt vann i hver mikrosentrifugen tube etterfulgt av seriell fortynning av patogen inokulum.
    Merk: antall fortynning rør nødvendig for nøyaktig patogen opplisting vil variere på første patogen input og varighet av infeksjonen. Dette må være empirisk bestemmes.
  4. Ved hjelp av steril tang, overføre lungene inn i forberedt vev jeksel og grundig homogenisere vevet ved å trykke ned på sokkelen mens du roterer.
  5. Åpne vev kvern og alikvot 100 μL av homogenisert prøven inn i den første av de klargjorte serielle fortynning rør. Serielt fortynne prøvene og nummerere CFUs ved plating til næringsstoffer agar. CFUs kan registreres som CFUs/mL eller CFUs/mL/mg av lungevevet.
    Merk: på dette trinnet kan ytterligere 200 μL av den homogenisert prøven fjernes for rensing av viral RNA (se tabell over materialer) eller oppbevares ved-80 ° c for fremtidig analyse.
  6. Etter at alikvoter har blitt fjernet for CFU bestemmelse og/eller viral RNA isolasjon, erstatte sliping pidestall og pellet den homogenisert vev ved sentrifugering ved 4 000 RPM (3724 x g) i 10 min ved 4 ° c.
  7. Bruk en pipette og fjern supernatanten fra pelleted prøven og plasser den i en 1,5 mL mikrosentrifugen slange.
    Merk: supernatanten er fri for bakterier og kan oppbevares ved-80 ° c for analyse av oppløselig vert og utskilles patogen faktorer.
  8. Resuspend homogenisert vev pellet ved pipettering eller virvlingen i 700 μL av buffer RLT-ß-mercaptoethanol og Overfør prøven til en steril RNAse-Free 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
    Merk: på dette punktet kan prøvene lagres ved-80 ° c i flere måneder.
  9. Rens RNA ved hjelp av små endringer i produsentens protokoll i et rensesett (se tabell over materialer); se Voyich et al. 200814.
    1. Overfør den homogenisert lunge slurry til et 2 mL mikrosentrifugen rør som inneholder 0,1 mm silika perler og behandlet via en perle visp for 20 s ved 6 m/s.
    2. Sentrifuger prøven ved 1 500 RPM i 3 minutter. Etter sentrifugering, Pipetter supernatanten inn i nye 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
    3. Tilsett 350 μL av 96% – 100% etanol i prøven og bland godt med pipettering eller inversjon.
    4. Overfør 700 μL av prøven til en rense søyle plassert i et 2 mL oppsamlings rør. Sentrifuger prøven ved ≥ 8 000 x g for 15 s og kast flyten gjennom. Kjør overflødig prøve gjennom den samme kolonnen som beskrevet ovenfor.
    5. Vask kolonnen med 700 μL av buffer RW1 og sentrifuge prøven ved ≥ 8 000 x g i 15 s. kast den gjennomstrømning og overføre silika membran søylen inn i en ny 2 ml samling tube.
    6. Påfør 500 μL av buffer RPE til kolonnen. Vask søylen med sentrifugering ved ≥ 8 000 x g i 15 s. kast flyten gjennom.
    7. Påfør ytterligere 500 μL av buffer RPE til RNeasy-kolonnen og sentrifuger ved 8 000 x g i 2 min. kast gjennomstrømning og sentrifuger kolonnen på ≥ 10 000 x g i 1 min.
    8. For å eluere renset RNA, begynn med å overføre kolonnen til en ny 1,5 mL RNAse-Free mikrosentrifugen tube. Pipetter 50 μL av RNase-fritt vann direkte på silika-gel-membranen i spalten og sentrifuge ved ≥ 8000 x g i 1 min.
      Merk: eluert RNA kan kjøres over samme kolonne igjen for å øke RNA-avkastningen.
    9. Tilsett 50 μL av RNase vann til renset RNA for å bringe det totale volumet til 100 μL. Alikvot 350 μL RLT-ß-mercaptoethanol etterfulgt av 250 μL av 96% – 100% etanol til prøven og bland godt med pipettering eller inversjon.
    10. Påfør prøven til en rensing kolonne plassert i en samling rør og sentrifuger på ≥ 8000 x g for 15 s. kast flyten gjennom og Bytt ut oppsamlings slangen.
    11. Vask kolonnen ved å tilsette 350 μL av buffer RW1 etterfulgt av sentrifugering ved ≥ 8000 x g for 15 s.
    12. Klargjør en DNase-løsning som inneholder ca. 27 Kunitz enheter ved å tilsette 10 μL av DNase-lager (750 Kunitz enheter/mL) til 70 μL av buffer RDD. Tilsett 80 μL av DNase-oppløsning direkte på silika-gel-membranen og ruge prøven i 15 minutter ved romtemperatur.
    13. Vask kolonnen med 350 μL av buffer RW1 og sentrifuge ved ≥ 8000 x g for 15 s og kast gjennomstrømnings flyten.
    14. Gjenta trinn 3.9.6 – 3.9.8 for å rense RNA.
      Merk: det anbefales å gjenta RNA oppryddingsprosessen ved å følge trinn 3.9.9 – 3.9.10 og 3.9.6 – 3.9.8 (hopp over DNase trinn 3.9.11 – 3.9.13). Denne ekstra oppryddingen det resulterer i svært høy kvalitet RNA.
  10. RNA yield kan kvantifisert ved hjelp av en spektrofotometer med målinger ved 260 nM for fastsettelse av konsentrasjon og 260:280 nM for renhet. Etter at RNA-avkastningen er oppnådd, kan du standardisere konsentrasjonen av hver RNA-prøve til 50 ng/μL.
    Merk: det anbefales å lage flere alikvoter ved en konsentrasjon på 50 ng/μL for å unngå å fryse/tine sykluser som kan føre til RNA-forringelse.
  11. Oppbevar renset RNA ved-80 ° c eller bruk umiddelbart til transkripsjon analyse.
    Merk: i tidligere publikasjoner ble RNA fra 3 – 5-mus gruppert for transkripsjon analyse. Gjennom optimalisering av ovennevnte teknikk har RNA fra 1 mus blitt empirisk bestemt som tilstrekkelig for transkripsjon analyse (80 – 120 ng/μL).

Representative Results

Figur 1 utnytter en 0,1% vekt/volum Coomassie strålende blå løsning for å demonstrere at en intratrakeal drypping leverer inokulum direkte og jevnt innenfor de nedre luftveiene. Figur 2 viser at bakteriene (S. aureus) CFUs utvinnes direkte fra homogenisert lunge vev. Figur 3 demonstrerer bruken av dette systemet for presis levering og gjenvinning av inokulum i nedre luftveier ved å plotte input og Recovery CFUs fra individuelle mus. Figur 4 viser QRT-PCR forsterkning kurve for bakteriell housekeeping Gene gyrB for å demonstrere at bakteriell RNA kan trekkes ut direkte fra infisert LUNGE vev med minimal DNA-forurensning. Figur 5 viser byggingen av en standard kurve ved hjelp av QRT-PCR forsterkning av influensa et virus M-segment for å DEMONSTRERE viral RNA kan trekkes ut direkte fra infisert lunge vev.

Figure 1
Figur 1: intratrakeal drypping muliggjør jevn fordeling av den nedre luftveiene. (A, B) Lungene ble excised fra en sunn mus etter intratrakeal drypping av steril PBS og fotografert fra (a) rygg og (B) ventrale perspektiver. (C, D) 50 μL av a 0,1% Coomassie brilliant Blue Solution ble administrert til en anesthetized mus via intratrakeal administrasjon. (C) rygg. (D) ventrale. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant utvinning av bakteriell CFUs fra infiserte lunge homogenate. Lungene ble excised en dag etter utfordringen med S. aureus. Etter homogenation, 100 μL av lunge slurry ble serielt fortynnet gjennom 10-6. Å nummerere CFUs utvinnes, 10 μL dråper ble belagt fra 10-5 og 10-6 fortynninger på TRYPTIC soya agar (TSA) og inkubert ved 37 ° c med 5% C02 over natten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: presis levering og gjenvinning av patogen inokulum etter intratrakeal administrasjon. Mus ble delt inn i to grupper som inneholdt tre mus per gruppe. Mus ble utsatt for intratrakeal drypping av S. aureus ved 1 x 108 (lav) og 2 x 108 (høy) CFU/ml. En Times post-infeksjon, mus ble euthanized og lungene var excised å demonstrere presisjonen av drypping og utvinning. Bakteriell inokulum og bakterier utvinnes fra lunge homogenate ble belagt på TSA (tryptic soya agar). Ingen signifikante forskjeller ble rapportert mellom bakteriell input og utvinning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representativ bakteriell RNA-gjenoppretting og renhet. Seks timer etter intratrakeal drypping med 1 x 108 CFU/50 ΜL av S. aureus, mus ble euthanized. Lungene var excised og homogenisert etterfulgt av blanding av lunge slurry i buffer RLT-ß-mercaptoethanol. RNA ble renset som beskrevet i trinn 3,914. qRT-PCR ble brukt til å oppdage transkripsjoner av bakteriell housekeeping genet gyrB. En kontroll som ikke inneholder omvendt transkriptase (nRT), ble inkludert for å demonstrere renheten til RNA-en som ble gjenopprettet. Ved en terskel på 0,1, gyrB transkripsjoner ble oppdaget på en gjennomsnittlig syklus av 21,1, 20,3, og 20,5. nRT-kontroller ble ikke funnet før syklus gjennomsnitt 35,9, 35,5 og 35,0. n = 3 biologiske replikerer, inneholder 3 tekniske replikerer/biologisk gjenskape. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representative viral RNA-gjenoppretting. Seks dager etter intratrakeal drypping med 100 PFU/50 μL av influensa A/PR/8/1934 (H1N1), ble mus euthanized. Lungene var excised og homogenisert, og 200 μL av homogenisert slurry ble samlet inn og passert gjennom en 70 μm celle sil før viral RNA rensing. Renset RNA ble serielt fortynnet (10-1-10-4) etterfulgt av forsterkning av influensa A M-segmentet. (A) forsterkning plott av INFLUENSA en RNA utvinnes fra en infisert lunge og fortynnet 10-1– 10-4. (B) standard kurve av influensa A M-segment. Terskel = 0,2, R2 = 0,994, STIGNINGSTALL =-3,46. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Bruk av denne modellen gir en svært effektiv og reproduserbar metode for å studere sekundære bakterielle infeksjoner. Evnen til å tett kontrollere levering av patogen inokulum muliggjør mer presise observasjoner av den enkelte og Kombinatorisk effekter av hver patogen. Ineffektivitet i den mer vanlige intranasal drypping ruten har trolig bidratt til avvik i dose volumer og konsentrasjoner som finnes i litteraturen. Det er rimelig at mangelen på en presis murine system for å studere sekundær bakteriell lungebetennelse har forsinket funn identifisere bakterielle spesifikke tiltak som bidrar til alvorlighetsgraden av lunge infeksjoner. Utvikle en reproduserbar modell for å studere virulens uttrykk under sekundære bakterielle infeksjoner kan føre til identifisering av vaksine eller narkotika mål å bøte disse infeksjonene.

Den intratrakeal drypping trinnet er avgjørende for å kunne etablere en nedre luftveisinfeksjon og noen Down-stream analyse av patogener. Når du lærer denne teknikken, kan det være nyttig å øve ved hjelp av et fargestoff (som beskrevet i metodene) før administrering av smittsomme materialer. Ved hjelp av et fargestoff gir mulighet for direkte visualisering av inokulum inn i luftveiene. En vanlig feil som kan oppstå er innsetting av stump-nålen i spiserøret i stedet for luftrøret. Dette vil resultere i levering av inokulum i magen i stedet for lungene. For å rette opp denne feilen, vinkel nålen lenger vekk fra kroppen og passerer den ned i luftrøret. Når den er mastret, er denne fremgangsmåten svært effektiv og kan brukes til å utføre eksperimenter med et stort antall mus. Ved å arbeide i grupper for å bedøve mus, kan intratrakeal drypping fullføres på cirka 30 sekunder per mus. I tillegg kan fjerning av lungene være ferdig i 2 til 3 minutter per mus.

Gjenvinning av levedyktig og ren bakteriell RNA fra infisert vev er avgjørende for transkripsjon analyse. RNases er allestedsnærværende og kan raskt ødelegge et eksperiment15. Noen metoder inkluderer bruk av RNase-hemmere; Vi har imidlertid funnet at frysing prøven ved-80 ° c i RLT-ß-mercaptoethanol eller umiddelbart behandle prøven for RNA-isolasjon ved hjelp av alle RNase frie rør og reagenser er effektive for å redusere RNase forurensning. I tillegg anbefaler vi at maksimalt seks prøver renses på en gang. Inkludert mer enn seks prøver kan føre til langvarig latencies mellom protokoll trinn som kan kulminere i RNA-degradering. Når renset, bør forsiktighet også tas for å unngå unødvendige fryse-tine sykluser. Hvis flere analyser blir utført på en prøve, anbefales det derfor at aliquoting renset RNA for lagring ved-80 ° c.

I tillegg til teknikkene gjennomgått her, kan denne metoden suppleres ved å utføre bronkial alveolære tømming før fjerning og homogenation av lungene16. Dette kan oppnås ved tømming av hele nedre luftveier eller ved å bruke Sutur tråden til å begrense en forgrening arm av bronkial treet etterfulgt av tømming gjennom de resterende gren. Ofte fører dette til en reduksjon i utvinningen av patogen lasten, men gir en prøve hvorpå informasjon som melkesyre dehydrogenase aktivitet, cellulær befolkning identitet, og cytokin profiler kan fås16. Sammen disse dataene kan danne en mer fullstendig forståelse av verten-patogen interaksjoner oppstår under videregående bakteriell lungebetennelse.

Mens metodene diskutert har vært innenfor rammen av sekundær bakteriell lungebetennelse, de er egnet til å utvides til enhver murine modell av lavere luftveisinfeksjon; spesielt, de som ville ha nytte av strengt kontrollert levering og gjenoppretting av den installerte inokulum. Videre, som mange andre infeksjons ruter, kan intratrakeal drypping benyttes i ikke-smittsomme anvendelser, slik som administrering av legemiddel-og miljø forbindelser12.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Nicole Meissner, MD/Ph.D., Montana State University, for hennes hjelp til å etablere den intratrakeal drypping metoden. Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health (Grants NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), samt midler fra Montana University system Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) og Montana State University Landbruk Experiment Station.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911100 Referred to in text as "0.1 mm silica beads"
21-gauge blunt needle SAI B21-150 1.5" is recommended.
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 DNase used in the accompanying text.
FastPrep-24 Classic Instrument MP Biomedicals 116004500 FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents Applied Biosystems 4405543 Influenza A M-segment qRT-PCR kit.
Intubation Stand Kent Scientific ETI-MES-01 Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house.
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904 Viral RNA purification kit.
Tissue Grinders Thermo Fisher Scientific 02-542-08
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) Calbiochem UN2966

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64, (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1 (2013).
  2. Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
  3. Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201, (4), 508-515 (2010).
  4. Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. (2016).
  5. Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7, (2), 31359 (2012).
  6. Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209, (6), 865-875 (2014).
  7. Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7, (4), (2016).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218, (5), 809-813 (2018).
  9. Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119, (7), 1910-1920 (2009).
  10. McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2, (4), 240-249 (2007).
  11. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, (2), 222-230 (2008).
  12. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  13. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  14. Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).
  15. Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10, (4), 585-597 (2006).
  16. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
En presis patogen levering og gjenoppretting system for murine modeller av sekundær bakteriell lungebetennelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).More

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter