Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

نظام دقيق لإيصال مسببات الأمراض واستعادتها لنماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي

doi: 10.3791/59566 Published: September 21, 2019

Summary

هنا، نقدم طرق لتحسين دراسات الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي من خلال توفير طريق غير الغازية للغرس في الجهاز التنفسي السفلي تليها استعادة مسببات الأمراض وتحليل النص. هذه الإجراءات قابلة للاستنساخ ويمكن تنفيذها دون معدات متخصصة مثل قنية، أسلاك دليل، أو كابلات الألياف البصرية.

Abstract

تحتل الالتهاب الرئويات البكتيرية الثانوية بعد عدوى الأنفلونزا مرتبة باستمرار ضمن الأسباب العشرة الرئيسية للوفاة في الولايات المتحدة. وحتى الآن، كانت نماذج العدوى المشتركة هي الأداة الرئيسية التي وضعت لاستكشاف أمراض كل من العدوى الأولية والثانوية. وعلى الرغم من انتشار هذا النموذج، فإن هناك اختلافات كبيرة فيما يتعلق بإجراءات الغرس، وأحجام الجرعات، وفعالية الانتشار بين الدراسات. وعلاوة على ذلك، لم تكن هذه الجهود كاملة إلى حد كبير في معالجة الكيفية التي يمكن أن يؤثر بها الممرض تأثيرا مباشرا على تطور المرض بعد الإصابة. هنا نقدم طريقة دقيقة لإيصال مسببات الأمراض، والانتعاش، والتحليل لاستخدامها في نماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي. نحن نثبت أن الغرس داخل الرغامى يتيح توصيل فعال ودقيق للكميات الخاضعة للرقابة مباشرة وبالتساوي في الجهاز التنفسي السفلي. يمكن استئصال الرئتين لاستعادة وتحديد كمية عبء الممرض. بعد استئصال الرئتين المصابة، ونحن نصف طريقة لاستخراج عالية الجودة المسببة للأمراض RNA لتحليل النسخ اللاحقة. ويستفيد هذا الإجراء من كونه طريقة غير جراحية للتسليم دون استخدام معدات مختبرية متخصصة ويوفر استراتيجية قابلة للاستنساخ للتحقيق في مساهمات مسببات الأمراض في الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي.

Introduction

الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي بعد عدوى الأنفلونزا هو السبب الرئيسي للوفاة في الولايات المتحدة ومنطقة نشطة من البحوث1،2. على الرغم من العديد من الدراسات التي تستخدم نماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي، لا تزال التناقضات فيما يتعلق بغرس مسببات الأمراض والاستجواب5. بالإضافة إلى ذلك، في حين ركزت العديد من الجهود السابقة على الآثار المناعية للأنفلونزا التي تؤدي إلى زيادة التعرض للعدوى البكتيرية الثانوية، تشير البيانات الحديثة إلى تنظيم الرأفة للممرض البكتيري هو على قدم المساواة المساهم نحو إنشاء المرض6و7و8و9. هذه البيانات الجديدة تتطلب طريقة أكثر دقة لاستكشاف الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي في نماذج المورين من العدوى المشتركة التي تسهل التحقيق في استجابة مسببات الأمراض.

فريدة من نوعها لنماذج العدوى المشتركة للأنفلونزا، والكائنات الحية المضيفة هي عن قصد مناعة من قبل عدوى الأنفلونزا الأولية قبل إعطاء العامل البكتيري الثانوي. من أجل تكرار مسببات الأمراض التي لوحظت على أفضل وجه في المضيفين الإنسان ، من الضروري السيطرة على الحمل المسبب للأمراض من كل من العوامل الأولية والثانوية من أجل مراقبة الآثار الفردية والمعدية لكل عامل معدي. الأكثر شيوعا، وقد تم تأسيس التهابات الجهاز التنفسي في الفئران من خلال إدارة داخل الأنف3،4،5،6،10. بقدر ما لوحظ هذا الطريق لكونها بسيطة من الناحية الفنية ويمكن أن تكون مناسبة في بعض تطبيقات العدوى ذات عامل واحد، فإنه غير مناسب لنماذج العدوى المشتركة، كما إجراءات الغرس، وأحجام الجرعة، وفعالية متغيرة للغاية داخل نشر الأدب3,4,5,6.

للحصول على فهم أكثر اكتمالا لمسببات الأمراض الالتهاب الرئوي البكتيرية الثانوية ، يجب النظر في مساهمات كل من المضيف والممرض. ولهذه الغاية، قمنا بتطوير نهج مباشر وقابل للاستنساخ لاستعادة البكتيريا القابلة للحياة والحمض النووي الريبي المسبب للأمراض من الرئتين المصابة. تستخدم هذه الطريقة إجراء ً مبسطًا غير غازي لغرس الرغامى الداخلي متبوعًا بعزل لاحق للRNA البكتيري. إجراء الغرس داخل الرغامى الموضح هنا يشبه الأساليب الموصوفة سابقا ولا يقتصر على تسليم مسببات الأمراض11،12،13. استخدام هذا الإجراء بالذات يستفيد من كونها منخفضة التكلفة ولا يتطلب استخدام معدات متخصصة مثل قنية، أسلاك دليل، أو كابل الألياف البصرية؛ وعلاوة على ذلك، لأن هذا الإجراء غير الغازية فإنه يؤمن الحد الأدنى من الضغط على المواضيع المورين، ويقلل من استجابة التهابية من ميكانيكا التلقيح، ويوفر طريق تسليم فعال للعدوى من مواضيع متعددة. وباختصار، يتم تعليق الفئران esesthetized isoflurane من القواطع. وتستخدم الملقط لفهم بلطف اللسان تليها إدخال عازمة مسبقة التحميل، حادة الرؤوس، إبرة قياس 21 في القصبة الهوائية وتسليم الحمل الممرض. ويتجلى التحقق من صحة هذا الإجراء من خلال التأكيد البصري للصبغة الموزعة بالتساوي في المقصورة الرئوية واستعادة الحمل البكتيري. ثم نبين كيفية استعادة المكورات العنقودية الأوريوس القابلة للحياة(S. aureus)من الرئتين المصابة ووصف طريقة استنساخ لعزل الحمض النووي الريبي الممرض عالية الجودة.

Protocol

وتتفق جميع الأساليب مع المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة، وقد وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ولاية مونتانا.

1. الغرس داخل الرغامى

  1. إعداد مساحة عمل تحتوي على الإمدادات التالية: منصة التنبيب، حقنة معقمة 1 مل، ملقط معقمة ذات رؤوس حادة، إبرة معقمة ذات 21 مقياس احادية الرؤوس، وأنبوبين مخروطيين لتخزين الحقنة والملقط.
    ملاحظة: يمكن شراء منصات التنبيب تجارياً أو بناؤها في المنزل. تم بناء منصة التنبيب المستخدمة هنا باستخدام زجاج شبكي 0.25 بوصة. وباختصار، تم تطبيق الحرارة على زجاج شبكي وعازمة على المجلس إلى زاوية داخلية 65 درجة تقريبا. على الجانب الخارجي من منصة التنبيب، وبذور اثنين من مسامير آلة 3 بوصات بعيدا وعلقت المطاط الفرقة بين اثنين من مسامير.
  2. إعداد التلقيح الممرض عن طريق تخفيف بشكل تسلسلي العينة بحيث يتم الحصول على التركيز النهائي المطلوب في حجم إجمالي قدره 50 درجة مئوية.
  3. ارتداء قفازات معقمة، وثني إبرة 21 G حادة الرؤوس إلى ما يقرب من 35 درجة.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى إبرة منفصلة لكل ماوس.
  4. إصلاح عازمة 21 G إبرة حادة ذات الرؤوس إلى حقنة 1 مل. رسم وسادة الهواء 100 درجة مئوية في حقنة تليها 50 درجة مئوية من العامل المعدي. وضع الإبرة والمحاقن المحملة في موقع يسهل الوصول إليه من قبل اليد المهيمنة.
  5. تخدير عميق للفأر باستخدام خليط إسيوفرلوران/أكسجين بنسبة 4% أو طريقة التخدير المماثلة المعتمدة من IACUC. عادة ما يتم الحصول على عمق التخدير السليم عندما تتباطأ معدلات التنفس إلى ما يقرب من 1 استنشاق لكل 5-8 ق ويمكن تأكيدها عن طريق قرصة الزائدة والملاحظة أي رد فعل من الماوس.
    ملاحظة: وفرت هذه الطريقة للتخدير مدة تخدير كافية تبلغ حوالي 1.5 دقيقة. وكان هذا كافيا للأعضاء في مختبرنا لتعلم وتنفيذ هذا الإجراء الغرس. ومع ذلك، يمكن استخدام طرق التخدير الأخرى المعتمدة مؤسسيا11،12،13.
  6. إزالة الماوس مخدر من غرفة التخدير وتعليق الماوس على منصة التنبيب من القواطع الفكية.
  7. لفتح ممر واضح في القصبة الهوائية، استخدم ملقط ذو رؤوس حادة لفهم بلطف وتوسيع اللسان خارج الفم. نقل اللسان من ملقط في الإبهام والسبابة من اليد غير المهيمنة.
  8. لا تزال تحمل اللسان في اليد غير المهيمنة والتقاط حقنة محملة مسبقا. قم بالإشارة إلى الطرف المنحني للإبرة بعيدًا عن الجسم وأدخل الإبرة في تجويف الفم إلى قاعدة اللسان.
  9. مع الإبرة في قاعدة اللسان، زاوية بلطف المعصم ليسبب دفعة طفيفة من الإبرة بعيدا عن الجسم. هذه الخطوة تضمن إدخال الإبرة في القصبة الهوائية وليس المريء.
  10. توجيه ببطء الإبرة إلى أسفل في القصبة الهوائية. في كثير من الأحيان يشعر القراد طفيف كما يمر إبرة من خلال أضعاف الصوتية. تمرير الإبرة من خلال القصبة الهوائية حتى يشعر مقاومة طفيفة كما تواجه الإبرة كارينا.
  11. رفع الإبرة قليلا في الاتجاه القريب لتعليق الإبرة فوق كارينا. وهذا يتيح التسليم في الشعبين الهوائيتين الأوليين. قم بالاكتئاب بالكامل لالغطاس المحاقن لتسليم الحمل المعدي. إزالة الإبرة من القصبة الهوائية عن طريق رفع صعودا وتجاهل.
  12. إزالة الماوس من منصة التنبيب عن طريق الاكتئاب الفرقة المطاطية ولكن الحفاظ على عقد الماوس في وضع مستقيم. إعاقة المسالك الهوائية الأنفية عن طريق وضع إصبع مباشرة على الناسير. عقد هذا الموقف لمدة دقيقة واحدة تقريبا أو حتى يتم ملاحظة العديد من التنفس العميق.
    ملاحظة: تضمن هذه الخطوة الأخيرة تسليم إجمالي حجم التلقيح إلى الجهاز التنفسي السفلي.
  13. إعادة الماوس إلى قفصه ومراقبة الشفاء الكامل من التخدير.

2. استئصال الرئتين المصابة

  1. العمل داخل غطاء محرك السيارة تدفق laminar للحفاظ على العقم، وإعداد مساحة عمل مع العناصر التالية: مقياس وقارب وزن معقمة، منصة تشريح، مجموعة تشريح تحتوي على مقص وملقط، معقمة RNAse خالية PBS، والشاش المعقمة.
  2. قتل فأر مصاب بثاني أكسيد الكربونأو طريقة مماثلة معتمدة من IACUC القتل الرحيم.
  3. وضع الماوس المصابة على منصة تشريح وتأمين الماوس باستخدام دبابيس في نهاية كل ملحق. رش الماوس مع الإيثانول للمساعدة في الحفاظ على العقم من أسطح العمل.
  4. بدءا من السرة، واستخدام زوج من الملقط لرفع الجلد وجعل شق يصل إلى قاعدة القصبة الهوائية. الإمساك بالجلد على جانبي الشق الأولي، وسحب الجلد بعيدا ً عن الجسم وقطع من خلال وصلات الأنسجة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون من المفيد إجراء العديد من التخفيضات الجانبية عبر الجلد للكشف عن المزيد من المنطقة الصدرية.
  5. بدءا من قاعدة عملية xiphoid، وجعل شق صغير مع نية ثقب الحجاب الحاجز. وهذا يؤدي إلى زيادة في الضغط في تجويف الصدر الذي يسبب تراجع الرئتين. مع تراجع الرئتين مواصلة الشق لتحرير الحجاب الحاجز.
  6. إزالة الأضلاع عن طريق إجراء شق على جانبي القفص الصدري. وهذا سوف يعرض تماما تجويف الصدر والرئتين.
  7. لاستئصال الرئتين، فهم قاعدة القلب مع ملقط ورفع إلى أعلى. وضع مقص وراء الرئتين والبدء في إجراء شقوق صغيرة من خلال وصلات الأنسجة مع الاستمرار في رفع القلب إلى أعلى.
  8. بمجرد استئصال الرئتين، ضعها على الشاش المعقم وإزالة القلب. يمكن إزالة القلب بسهولة عن طريق رفعه بعيدا عن الرئتين مع ملقط وقطع وصلات الأنسجة المتبقية.
  9. نقل الرئتين إلى قارب وزن قبل قطره وتسجيل الوزن.
  10. بعد وزن الرئتين، نقلها إلى محلول ملحي معقمة الفوسفات المخزنة (PBS) وتخزينها مؤقتا على الجليد حتى المضي قدما إلى الانتعاش الممرض وخطوات التحليل.

3. استعادة مسببات الأمراض وتحليلها

  1. الاستمرار في العمل داخل غطاء تدفق اللامينار، وإعداد مساحة عمل مع اللوازم التالية: طاحونة الأنسجة، معقمة RNAse خالية PBS، RLT العازلة تستكمل مع ß-mercaptoethanol (1:100)، و 1.5 مل RNAse خالية من أنابيب الطرد المركزي الصغير.
    تحذير: يمكن أن يكون ß-mercaptoethanol خطرًا في حالة ملامسة الجلد أو الابتلاع أو ملامسة العين أو الاستنشاق. وينبغي أن يتم تخفيف ß-mercaptoethanol في RLT العازلة في غطاء الدخان.
  2. تبدأ أولا بإضافة 1 مل من PBS RNAse معقمة خالية من إلى طاحونة الأنسجة. مرة واحدة شغلها، وتخزين طاحونة الأنسجة على الجليد.
  3. إعداد سلسلة من أنابيب التخفيف التسلسلي الخالية من RNAse المعقمة التي سيتم استخدامها لتحديد كمية الحمل البكتيري المسترد من الرئتين المصابة. ويتم تحقيق ذلك بسهولة أكبر عن طريق اقتباس 900 ميكرولتر من المياه المعقمة في كل أنبوب من أنابيب الطرد المركزي الدقيق متبوعاً بتخفيف متسلسل لتلقيح مسببات الأمراض.
    ملاحظة: عدد أنابيب التخفيف اللازمة للتعداد الممرض دقيقة سوف تختلف على المدخلات المسببة للأمراض الأولية ومدة العدوى. ويجب تحديد ذلك تجريبيا.
  4. باستخدام ملقط معقمة، نقل الرئتين إلى طاحونة الأنسجة المعدة وتجانس تماما الأنسجة عن طريق الضغط باستمرار على قاعدة التمثال أثناء الدوران.
  5. فتح طاحونة الأنسجة وaliquot 100 درجة مئوية من العينة المتجانسة في أول من أنابيب التخفيف التسلسلي المعدة. تمييع بشكل تسلسلي العينات وتعداد CFUs عن طريق الطلاء على أجار المغذيات. ويمكن تسجيل مركبات الكربون الكلورية فلورية على أنها مركبات الكربون الكلورية فلورية/المليون أو مركبات الكربون الكلورية فلورية/مل/مغ من أنسجة الرئة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة يمكن إزالة 200 ميكرولتر إضافية من العينة المتجانسة لتنقية الحمض النووي الريبي الفيروسي (انظر جدول المواد)أو تخزينها في -80 درجة مئوية للتحليل في المستقبل.
  6. بعد إزالة aliquots لتحديد CFU و / أو عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي، واستبدال قاعدة طحن وبيليه الأنسجة المتجانسة عن طريق الطرد المركزي في 4000 دورة في الدقيقة (3724 × ز)لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
  7. باستخدام ماصة، قم بإزالة supernatant من العينة الكرياتة ووضعها في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل.
    ملاحظة: supernatant خال من البكتيريا ويمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لتحليل المضيف القابل للذوبان وعوامل الممرض ة تفرز.
  8. إعادة تعليق بيليه الأنسجة المتجانسة عن طريق الأنابيب أو الدوامة في 700 درجة مئوية من المخزن المؤقت RLT-ß-mercaptoethanol ونقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير RNAse خالية من 1.5 مل معقمة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  9. تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام تعديلات طفيفة على بروتوكول الشركة المصنعة من مجموعة تنقية (انظر جدول المواد)؛ انظر Voyich et al. 200814.
    1. نقل الطين الرئة متجانسة في أنبوب الطرد المركزي الصغير 2 مل تحتوي على حبات السيليكا 0.1 مم ومعالجتها عن طريق الخافق حبة لمدة 20 s في 6 م / ث.
    2. الطرد المركزي العينة في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. بعد الطرد المركزي، ماصة supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة.
    3. إضافة 350 درجة مئوية من الإيثانول 96٪ -100٪ إلى العينة ومزيج تماما عن طريق الأنابيب أو انعكاس.
    4. نقل 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود تنقية وضعت في أنبوب جمع 2 مل. طرد مركزي العينة في ≥ 8000 × ز ل 15 ق وتجاهل التدفق من خلال. تشغيل أي عينة زائدة من خلال نفس العمود كما هو موضح أعلاه.
    5. اغسل العمود بـ 700 ميكرولتر من عينة RW1 العازلة وعينة الطرد المركزي عند ≥ 8000 × ز لمدة 15 ثانية.
    6. تطبيق 500 μL من RPE المخزن المؤقت إلى العمود. اغسل العمود حسب الطرد المركزي عند ≥ 8000 × ز لمدة 15 ق. تجاهل التدفق من خلال.
    7. تطبيق 500 ميكرولتر إضافية من RPE العازلة إلى العمود RNeasy والطرد المركزي في 8000 × ز لمدة 2 دقيقة.
    8. إلى الحمض النووي الريبي المنقى elute، تبدأ بنقل العمود إلى أنبوب جديد 1.5 مل RNAse خالية من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. ماصة 50 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase مباشرة على غشاء هلام السيليكا من العمود والطرد المركزي في ≥ 8000 × ز لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تشغيل RNA eluted عبر نفس العمود مرة أخرى لزيادة العائد RNA.
    9. إضافة 50 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase إلى الحمض النووي الريبي النقي ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر Aliquot 350 μL RLT-ß-mercaptoethanol متبوعاً بـ 250 ميكرولتر من 96% - 100% إيثانول للعينة ويخلط جيداً عن طريق الأنابيب أو الانعكاس.
    10. تطبيق العينة على عمود تنقية وضعت في أنبوب جمع والطرد المركزي في ≥ 8000 × ز لمدة 15 ق. تجاهل تدفق من خلال واستبدال أنبوب جمع.
    11. اغسل العمود بإضافة 350 درجة مئوية من المخزن المؤقت RW1 متبوعاً بالطرد المركزي عند ≥ 8000 × ز لمدة 15 ثانية.
    12. إعداد محلول DNase يحتوي على ما يقرب من 27 وحدة كونيتز عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من مخزون DNase (750 وحدة كونيتز / مل) إلى 70 درجة مئوية من RDD العازلة. إضافة 80 درجة مئوية من محلول DNase مباشرة على غشاء هلام السيليكا واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    13. اغسل العمود بـ 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW1 والطرد المركزي عند ≥ 8000 × ز لمدة 15 ثانية وتجاهل التدفق من خلال.
    14. كرر الخطوات 3.9.6-3.9.8 لتنقية الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: من المستحسن تكرار إجراء تنظيف الحمض النووي الريبي باتباع الخطوات 3.9.9-3.9.10 و 3.9.6-3.9.8 (تخطي الخطوات DNase 3.9.11-3.9.13). هذا تنظيف إضافية يؤدي إلى RNA عالية الجودة جداً.
  10. ويمكن تحديد عائد الحمض النووي الريبي كمياً باستخدام مقياس الطيف الضوئي مع قراءات عند 260 نم لتحديد التركيز و260:280 نم للنقاء. بعد الحصول على عائد الحمض النووي الريبي، وتوحيد تركيز كل عينة RNA إلى 50 نانوغرام / ميكرولتر.
    ملاحظة: من المستحسن أن تجعل aliquots متعددة بتركيز 50 نانوغرام /ميكرولتر لتجنب دورات التجميد / ذوبان التي يمكن أن تؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي.
  11. تخزين الحمض النووي الريبي النقي في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتحليل النص.
    ملاحظة: في المنشورات السابقة تم تجميع الحمض النووي الريبي من 3-5 فئران لتحليل النسخ. من خلال تحسين التقنية المذكورة أعلاه، تم تحديد الحمض النووي الريبي من 1 ماوس تجريبياً على أنه كاف ٍ لتحليل النصوص (80-120 نانوغرام/ميكرولتر).

Representative Results

الشكل 1 يستخدم 0.1٪ الوزن / حجم Coomassie حل أزرق رائع لإثبات أن غرس داخل الرغامى يسلم التلقيح مباشرة وبالتساوي داخل الجهاز التنفسي السفلي. ويبين الشكل 2 أن البكتيريا(S. aureus) CFUs تعافت مباشرة من أنسجة الرئة المتجانسة. ويبين الشكل 3 استخدام هذا النظام في التسليم الدقيق للتلقيح واستعادته في الجهاز التنفسي السفلي عن طريق رسم المدخلات والاسترداد من الفئران الفردية. ويبين الشكل 4 منحنى تضخيم الـ qRT-PCR لجين التدبير المنزلي البكتيري gyrB لإثبات أن الحمض النووي الريبي البكتيري يمكن استخراجه مباشرة من أنسجة الرئة المصابة بأقل قدر من التلوث بالحمض النووي. ويبين الشكل 5 بناء منحنى قياسي باستخدام تضخيم فيروس الأنفلونزا A M-segment لإثبات أن الحمض النووي الريبي الفيروسي يمكن استخراجه مباشرة من أنسجة الرئة المصابة.

Figure 1
الشكل 1: الغرس داخل الرغامى يتيح التوزيع حتى في الجهاز التنفسي السفلي. (ألف، باء) تم استئصال الرئتين غير المصابة من فأر صحي بعد غرس الرغامى داخل الرغامى من PBS المعقمة وتصويرها من (أ) الظهرية و (B) وجهات النظر البطنية. (C, D)50 € L من 0.1% تم إعطاء حل أزرق رائع Coomassie إلى الماوس التخدير عن طريق الإدارة داخل الرغامى. (ج)دورسال. (د)فينترال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التعافي التمثيلي لمركبات الكربون الكلورية فلورية البكتيرية من تجانس الرئة المصاب. تم استئصال الرئتين يوم واحد بعد التحدي مع S. aureus. بعد التجانس، تم تخفيف 100 درجة مئوية من الطين الرئة بشكل تسلسلي من خلال10-6. لتعداد CFUs تعافى، تم طلاء 10 قطرات ميكرولتر من10-5 و10-6 تمييع على أجار الصويا التربسي (TSA) واحتضنت في 37 درجة مئوية مع 5٪ C02 بين عشية وضحاها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التسليم الدقيق واستعادة التلقيح المسبب للأمراض بعد الإدارة داخل الرغامى. تم تقسيم الفئران إلى مجموعتين تحتوي انتموا على ثلاثة فئران لكل مجموعة. تعرضت الفئران لغرس S. aureus داخل الرغامى في 1 × 108 (منخفض) و 2 × 108 (عالية) CFU / مل. وبعد ساعة واحدة من العدوى، تم قتل الفئران وتم استئصال الرئتين لإثبات دقة الغرس والانتعاش. تم طلاء التلقيح البكتيري والبكتيريا التي تم استردادها من تجانس الرئة على TSA (أجار الصويا التربتي). ولم يبلغ عن وجود فروق كبيرة بين المدخلات البكتيرية والانتعاش. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: استعادة الحمض النووي الريبي البكتيري التمثيلي ونقاوتها. ست ساعات بعد الغرس داخل الرغامى مع 1 × 108 CFU / 50 درجة مئوية من S. aureus، تم قتل الفئران. تم استئصال الرئتين وتجانسها تليها إعادة تعليق الطين الرئة في المخزن المؤقت RLT-ß-mercaptoethanol. تم تنقية الحمض النووي الريبي كما هو موضح في الخطوة 3.914. تم استخدام qRT-PCR للكشف عن نسخ من الجين التدبير المنزلي البكتيري gyrB. تم تضمين عنصر تحكم لا يحتوي على نسخ عكسي (nRT) لإثبات نقاء الحمض النووي الريبي المسترد. وعند عتبة 0.1، تم الكشف عن نسخ gyrB في دورة متوسطها 21.1 و20.3 و20.5. لم يتم الكشف عن عناصر تحكم nRT حتى متوسطات الدورة 35.9 و 35.5 و 35.0. n = 3 عمليات تكرار بيولوجية، تحتوي على 3 نسخ تقني/تكرار بيولوجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: شفاء الحمض النووي الريبي الفيروسي التمثيلي. بعد ستة أيام من الغرس داخل الرغامى مع 100 PFU/50 ميكرولتر من الأنفلونزا A/PR/8/1934 (H1N1)، تم قتل الفئران. تم استئصال الرئتين وتجانسها، وتم جمع 200 ميكرولتر من الطين المتجانس وتمريرها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر قبل تنقية الحمض النووي الريبي الفيروسي. تم تخفيف الحمض النووي الريبي النقي بشكل تسلسلي (10-1-10-4) متبوعاً بتضخيم الأنفلونزا A-الجزء. (أ)مؤامرة تضخيم الأنفلونزا A RNA تعافى من الرئة المصابة والمخففة 10-1-10-4. (ب)منحنى قياسي من الأنفلونزا A-M-الجزء. العتبة = 0.2، R2 = 0.994، الميل = -3.46. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

استخدام هذا النموذج يوفر طريقة عالية الكفاءة واستنساخ لدراسة الالتهابات البكتيرية الثانوية. القدرة على السيطرة بإحكام على تسليم التلقيح المسبب للأمراض تمكن من رصد أكثر دقة من الآثار الفردية والقابلة للجمع من كل ممرض. ومن المرجح أن تكون أوجه عدم الكفاءة في مسار الغرس داخل الأنف الأكثر شيوعاً قد أسهمت في التفاوتات في أحجام الجرعات وتركيزاتها الموجودة في المؤلفات. فمن المعقول أن عدم وجود نظام المورين دقيقة لدراسة الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي قد تأخر النتائج التي تحدد الاستجابات البكتيرية المحددة التي تسهم في شدة العدوى المشتركة الرئوية. ويمكن أن يؤدي وضع نموذج قابل للاستنساخ لدراسة التعبير عن الضراوة أثناء العدوى البكتيرية الثانوية إلى تحديد أهداف اللقاح أو الأدوية لتحسين هذه العدوى.

خطوة الغرس داخل الرغامى أمر بالغ الأهمية لإنشاء عدوى الجهاز التنفسي السفلي بنجاح وأي تحليل أسفل تيار من مسببات الأمراض. عند تعلم هذه التقنية، قد يكون من المفيد ممارسة استخدام صبغة (كما هو موضح في الأساليب) قبل إدارة المواد المعدية. استخدام صبغة يسمح للتصور المباشر للتلقيح في الجهاز التنفسي. خطأ شائع يمكن أن يحدث هو إدخال الإبرة الحادة في المريء بدلا ً من القصبة الهوائية. وهذا سيؤدي إلى ولادة التلقيح في المعدة بدلا من الرئتين. لتصحيح هذا الخطأ، زاوية الإبرة بعيدا عن الجسم وتمريرها إلى أسفل في القصبة الهوائية. وبمجرد إتقانه، يكون هذا الإجراء فعالاً جداً ويمكن استخدامه لإجراء تجارب مع أعداد كبيرة من الفئران. العمل على دفعات لالتخدير الفئران، يمكن الانتهاء من غرس داخل الرغامى في حوالي 30 ثانية لكل ماوس. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إكمال استئصال الرئتين في 2-3 دقائق لكل فأرة.

استعادة الحمض النووي الريبي البكتيري ة القابلة للحياة والنقية من الأنسجة المصابة أمر بالغ الأهمية لتحليل النسخ. RNases هي في كل مكان ويمكن أن تدمر بسرعة تجربة15. وتشمل بعض الطرق استخدام مثبطات RNase; ومع ذلك، وجدنا أن تجميد العينة في -80 درجة مئوية في RLT-ß-mercaptoethanol أو معالجة على الفور عينة لعزل الحمض النووي الريبي باستخدام جميع الأنابيب الحرة RNase والكواشف فعالة في الحد من التلوث RNase. بالإضافة إلى ذلك، نوصي بتنقية ست عينات كحد أقصى في وقت واحد. بما في ذلك أكثر من ست عينات يمكن أن يؤدي إلى تأخر لفترات طويلة بين خطوات البروتوكول التي يمكن أن تتوج بتدهور الحمض النووي الريبي. وبمجرد تنقيتها، ينبغي أيضا توخي الحذر لتجنب أي دورات تجميد ذوبان لا لزوم لها. وهكذا، إذا تم إجراء تحليلات متعددة على عينة واحدة، ينصح بإزالة الرنا النقية للتخزين عند -80 درجة مئوية.

بالإضافة إلى التقنيات التي تم استعراضها هنا ، يمكن استكمال هذه الطريقة عن طريق إجراء غسل السنخي القصبي قبل استئصال وتتجانس الرئتين16. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق غسل كامل الجهاز التنفسي السفلي أو باستخدام خيط خياطة لتقييد ذراع تفريع واحد من شجرة الشعب الهوائية تليها غسل من خلال الفرع المتبقي. في كثير من الأحيان هذا يؤدي إلى انخفاض في استرداد الحمل الممرض ولكن يوفر عينة عندها معلومات مثل نشاط dehydrogenase اللاكتات، هوية السكان الخلوية، وملامح السيتوكين يمكن الحصول عليها16. معا هذه البيانات يمكن أن تشكل فهما أكثر اكتمالا للتفاعلات المضيفة والممرض التي تحدث خلال الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي.

وفي حين أن الأساليب التي نوقشت كانت في سياق الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي، فإنها مناسبة للتوسيع إلى أي نموذج من أنواع المورين من عدوى الجهاز التنفسي السفلي؛ على وجه التحديد، تلك التي من شأنها أن تستفيد من التسليم بإحكام تسيطر عليها واستعادة inoculum المثبتة. وعلاوة على ذلك، مثل العديد من طرق العدوى الأخرى، يمكن استخدام الغرس داخل الرغامى في التطبيقات غير المعدية، مثل إدارة العلاجات والمركبات البيئية12.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يشكرا نيكول ميسنر، دكتوراه في الدكتوراه/ دكتوراه، من جامعة ولاية مونتانا، على مساعدتها في إرساء طريقة الغرس داخل الرغامى. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (المنح NIH-1R56AI135039-01A1، GM110732، R21AI128295، U54GM15371)، فضلا عن الأموال من مبادرة بحوث نظام جامعة مونتانا (51040-MUSRI2015-03) وجامعة ولاية مونتانا محطة التجارب الزراعية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911100 Referred to in text as "0.1 mm silica beads"
21-gauge blunt needle SAI B21-150 1.5" is recommended.
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 DNase used in the accompanying text.
FastPrep-24 Classic Instrument MP Biomedicals 116004500 FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents Applied Biosystems 4405543 Influenza A M-segment qRT-PCR kit.
Intubation Stand Kent Scientific ETI-MES-01 Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house.
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904 Viral RNA purification kit.
Tissue Grinders Thermo Fisher Scientific 02-542-08
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) Calbiochem UN2966

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64, (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1 (2013).
  2. Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
  3. Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201, (4), 508-515 (2010).
  4. Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. (2016).
  5. Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7, (2), 31359 (2012).
  6. Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209, (6), 865-875 (2014).
  7. Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7, (4), (2016).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218, (5), 809-813 (2018).
  9. Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119, (7), 1910-1920 (2009).
  10. McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2, (4), 240-249 (2007).
  11. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, (2), 222-230 (2008).
  12. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  13. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  14. Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).
  15. Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10, (4), 585-597 (2006).
  16. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
نظام دقيق لإيصال مسببات الأمراض واستعادتها لنماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).More

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter