Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een nauwkeurig pathogeen lever-en Terugwinningssysteem voor Muriene modellen van secundaire bacteriële pneumonie

doi: 10.3791/59566 Published: September 21, 2019

Summary

Hier presenteren we methoden om secundaire bacteriële pneumonie onderzoeken te verbeteren door een niet-invasieve route van instillatie in de onderste luchtwegen te bieden, gevolgd door pathogeen herstel en transcriptie analyse. Deze procedures zijn reproduceerbaar en kunnen worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur zoals canules, geleidings draden of glasvezelkabels.

Abstract

Secundaire bacteriële pneumonias na influenza infecties zijn consequent gerangschikt binnen de top tien van de belangrijkste doodsoorzaken in de Verenigde Staten. Tot nu toe, Murine modellen van co-infectie zijn de belangrijkste instrument ontwikkeld om de pathologieën van zowel de primaire en secundaire infecties te verkennen. Ondanks de prevalentie van dit model zijn er in de studies aanzienlijke verschillen met betrekking tot instillatie procedures, dosis volumes en efficiëntie. Bovendien zijn deze inspanningen grotendeels onvolledig geweest in het aanpakken van de manier waarop het pathogeen direct invloed kan hebben op de ziekteprogressie na infectie. Hierin bieden we een precieze methode van pathogeen Delivery, Recovery, en analyse te gebruiken in Murine modellen van secundaire bacteriële pneumonie. We tonen aan dat intratracheale instillatie een efficiënte en nauwkeurige levering van gecontroleerde volumes direct en gelijkmatig in de onderste luchtwegen mogelijk maakt. Longen kunnen worden weggesneden om de pathogeen-belasting te herstellen en te kwantificeren. Na excisie van de geïnfecteerde longen beschrijven we een methode om pathogeen RNA van hoge kwaliteit te extraheren voor daaropvolgende transcriptionele analyse. Deze procedure profiteert van een niet-chirurgische methode van levering zonder het gebruik van gespecialiseerde laboratoriumapparatuur en biedt een reproduceerbare strategie voor het onderzoeken van pathogeen bijdragen aan secundaire bacteriële pneumonie.

Introduction

Secundaire bacteriële pneumonie na influenza infectie is een belangrijke doodsoorzaak in de Verenigde Staten en een actief gebied van onderzoek1,2. Ondanks talrijke studies met behulp van Murine modellen van secundaire bacteriële pneumonie, inconsistenties met betrekking tot pathogeen instillatie en ondervraging blijven3,4,5. Bovendien, terwijl veel eerdere inspanningen hebben gericht op de immunomodulerende effecten van influenza die leiden tot een verhoogde susceptibly tot secundaire bacteriële infectie, meer recente gegevens suggereert virulentie regulering van de bacteriële pathogeen is een gelijke Inzender voor de oprichting van de ziekte6,7,8,9. Deze nieuwe gegevens vereisen een preciezere methode om secundaire bacteriële pneumonie te onderzoeken in muriene modellen van co-infectie die het onderzoek naar de pathogeen respons vergemakkelijken.

Uniek voor influenza co-infectie modellen, gastheerorganismen zijn opzettelijk immuungecompromitteerd door een primaire influenza infectie voorafgaand aan de toediening van de secundaire bacteriële agent. Om het beste te repliceren de ziekte pathogenese waargenomen in menselijke hosts, is het noodzakelijk dat de pathogeen belasting van zowel primaire als secundaire agenten worden gecontroleerd om te observeren de individuele en combinatorische effecten van elke infectieuze agent. Meestal zijn luchtweginfecties bij muizen vastgesteld door middel van een intranasale toediening3,4,5,6,10. Voor zover deze route wordt opgemerkt omdat deze technisch eenvoudig is en geschikt kan zijn in sommige toepassingen van één-agent infectie, is deze niet geschikt voor co-infectie modellen, aangezien instillatie procedures, dosis volumes en werkzaamheid zeer variabel zijn binnen gepubliceerde literatuur3,4,5,6.

Om een vollediger begrip te krijgen van secundaire bacteriële pneumonie pathogenese, moeten bijdragen van zowel de gastheer als de pathogeen worden overwogen. Daartoe hebben we een ongecompliceerde en reproduceerbare aanpak ontwikkeld voor het herstel van leefbaar bacteriën en pathogenen RNA uit geïnfecteerde longen. Deze methode maakt gebruik van een vereenvoudigde, niet-invasieve intratracheale instillatie procedure gevolgd door een daaropvolgende isolatie van bacteriële RNA. De in dit document beschreven intratracheale instillatie procedure is vergelijkbaar met de eerder beschreven methoden en is niet beperkt tot de levering van pathogenen11,12,13. Gebruik van deze specifieke procedure profiteert van lage kosten en vereist geen gebruik van gespecialiseerde apparatuur zoals canules, geleidings draden of glasvezelkabel; Bovendien, omdat deze procedure is niet-invasieve het verzekert minimale stress op muriene onderwerpen, minimaliseert een ontstekingsreactie van de inoculatie mechanica, en biedt een efficiënte toedieningsroute voor de infectie van meerdere onderwerpen. Kort, Isofluraan verdoofd muizen zijn geschorst van de snijtanden. De Tang wordt gebruikt om de tong voorzichtig te vatten, gevolgd door het inbrengen van een voorgeladen gebogen, stompe-getipt, 21-gauge naald in de luchtpijp en de afgifte van pathogeen belasting. Validatie van deze procedure wordt aangetoond door visuele bevestiging van de kleurstof gelijkmatig verdeeld in het pulmonaalvak en terugwinning van bacteriële belasting. Vervolgens laten we zien hoe levensvatbare Staphylococcus aureus (S. aureus) uit geïnfecteerde longen kunnen worden hersteld en beschrijven we een reproduceerbaar methode om pathogeen RNA van hoge kwaliteit te isoleren.

Protocol

Alle methodes voldoen aan de richtlijnen van de National Institutes of Health en werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Montana State University.

1. intratracheale Instillatie

  1. Maak een werkruimte met de volgende benodigdheden: een intubatie-platform, een steriele 1 mL spuit, een steriele met stompe punt getipt Tang, een steriele 21-gauge naald met stompe tipped en twee conische buizen om de spuit en de Tang op te slaan.
    Opmerking: intubatie platformen kunnen in eigen huis worden gekocht of commercieel worden geconstrueerd. Het intubatie platform dat hier wordt gebruikt, werd gebouwd met behulp van 0,25 inch plexiglas. Kort, warmte werd aangebracht op de plexiglas en het bord is gebogen tot een geschatte 65 ° inwendige hoek. Aan de buitenzijde van het intubatie platform werden twee machine schroeven op 3 centimeter van elkaar gescheiden en werd een rubberen band tussen de twee schroeven opgehangen.
  2. Bereid het pathogeen-entmateriaal voor door het monster op een seriële wijze te verdunnen, zodat de gewenste eindconcentratie wordt verkregen in een totaal volume van 50 μL. Bewaar het entmateriaal op ijs.
  3. Het dragen van steriele handschoenen, buigen een 21 G botte-getipt naald tot ongeveer 35 °.
    Opmerking: voor elke muis is een aparte naald nodig.
  4. Bevestig de gebogen 21 G botte-getipt naald aan een 1 mL spuit. Trek een luchtkussen van 100 μL in de spuit, gevolgd door 50 μL van het infectieuze agens. Plaats de geladen naald en spuit op een locatie die gemakkelijk toegankelijk is voor de dominante hand.
  5. Diep anesthetiseren een muis met behulp van een 4% isoflurane/zuurstof mengsel of vergelijkbare IACUC goedgekeurd methode van anesthesie. De juiste anesthesie diepte wordt meestal verkregen wanneer de Ademhalings snelheden langzaam tot ongeveer 1 inademing per 5 – 8 s en kan worden bevestigd door het knijpen van een aanhangsel en het observeren van geen reactie van de muis.
    Opmerking: deze methode van anesthesie voorzag in een voldoende verdoving duur van ongeveer 1,5 min. Dit was voldoende voor leden in ons laboratorium om deze instillatie procedure te leren en uit te voeren; echter, andere institutioneel goedgekeurde anesthesie methoden kunnen worden gebruikt11,12,13.
  6. Verwijder de verdoving muis uit de anesthesie kamer en onderbreek de muis op het intubatie platform van de maxillaire snijtanden.
  7. Om een duidelijke passage in de luchtpijp te openen, gebruikt u de met stompe getipte tang om de tong buiten de mond voorzichtig te begrijpen en uit te breiden. Breng de tong van de Tang in de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand.
  8. Blijf de tong in de niet-dominante hand houden en pak de voorgevulde spuit. Wijs het gebogen uiteinde van de naald weg van het lichaam en steek de naald in de mondholte op de basis van de tong.
  9. Met de naald aan de basis van de tong, licht de pols om een lichte duw van de naald weg van het lichaam te veroorzaken. Deze stap verzekert de naald zal worden ingebracht in de luchtpijp en niet de slokdarm.
  10. Langzaam begeleiden de naald naar beneden in de luchtpijp; vaak wordt een lichte teek gevoeld als de naald door de vocale vouw gaat. Passeer de naald door de luchtpijp totdat er een lichte weerstand wordt gevoeld terwijl de naald de Carina ontmoet.
  11. Til de naald iets in de proximale richting om de naald boven de Carina te onderbreken. Dit maakt levering in de twee primaire bronchiën mogelijk. Druk de zuiger van de spuit volledig in om de infectieuze belasting te leveren. Verwijder de naald van de luchtpijp door omhoog te tillen en weg te gooien.
  12. Verwijder de muis van het intubatie platform door de rubberen band te indrukken, maar houd de muis rechtop. De nasale luchtwegen belemmeren door een vinger direct over de Nares te plaatsen. Houd deze positie gedurende ongeveer 1 min of totdat er meerdere diepe ademvallen worden waargenomen.
    Opmerking: deze laatste stap zorgt ervoor dat het totale entmateriaal volume in de onderste luchtwegen wordt afgeleverd.
  13. Keer de muis terug naar de kooi en observeer een volledig herstel van de anesthesie.

2. excisie van geïnfecteerde longen

  1. Werken binnen een laminaire stroom afzuigkap om steriliteit te behouden, een werkruimte voorbereiden met de volgende items: een schaal en steriele weeg boot, een dissectie platform, een dissectie Kit met schaar en Tang, steriele RNAse-vrije PBS en steriel gaas.
  2. Euthanasie van een geïnfecteerde muis met CO2 of vergelijkbare IACUC goedgekeurde methode van euthanasius.
  3. Plaats een geïnfecteerde muis op een dissectie platform en beveilig de muis met behulp van pinnen aan het einde van elk aanhangsel. Spuit de muis met ethanol om de steriliteit van de werkoppervlakken te behouden.
  4. Begin bij de umbilicus en gebruik een paar tang om de huid op te tillen en een incisie tot aan de basis van de luchtpijp te maken. Het grijpen van de huid aan weerszijden van de initiële incisie, trek de huid weg van het lichaam en snijd door de weefsel verbindingen.
    Opmerking: het kan handig zijn om verschillende laterale sneden over de huid te maken om meer van de thoracische regio te onthullen.
  5. Beginnend aan de basis van de xifoïde proces, maak een kleine incisie met de bedoeling van het prikken van het diafragma. Dit resulteert in een toename van de druk in de thoracische holte die ervoor zorgt dat de longen intrekken. Met de longen teruggetrokken blijven de incisie om het diafragma vrij te maken.
  6. Verwijder de ribben door een incisie langs beide zijden van de ribbenkast te maken. Dit zal de thoracische Holte en longen volledig blootstellen.
  7. Om de longen te accijnzen, pak de basis van het hart met de Tang en til omhoog. Plaats de schaar achter de longen en begin met het maken van kleine incisies door de weefsel verbindingen terwijl u doorgaat naar de lift het hart omhoog.
  8. Zodra de longen zijn uitgesmokte, plaats ze op het steriele gaas en verwijder het hart. Het hart kan gemakkelijk worden verwijderd door het uit de longen te tillen met de Tang en de resterende weefsel verbindingen te snijden.
  9. Breng de longen over naar een vooraf tared weeg boot en noteer het gewicht.
  10. Nadat de longen zijn gewogen, breng ze over in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar ze tijdelijk op ijs totdat ze naar de pathogeen Recovery-en analysestappen gaan.

3. pathogeen terugwinning en analyse

  1. Door verder te werken binnen een laminaire stroom afzuigkap, bereidt u een werkruimte voor met de volgende benodigdheden: een weefsel slijper, steriele RNAse-vrije PBS, buffer-RLT aangevuld met ß-mercaptoethanol (1:100) en 1,5 mL RNAse-vrije micro centrifugebuizen.
    Let op: ß-mercaptoethanol kan gevaarlijk zijn in het geval van huidcontact, inname, oogcontact of inademing. Verdunning van ß-mercaptoethanol in buffer RLT moet worden gedaan in een rook afzuigkap.
  2. Begin eerst met het toevoegen van 1 mL steriele RNAse-vrije PBS aan de weefsel slijper. Eenmaal gevuld, bewaar de weefsel slijper op ijs.
  3. Maak een reeks steriele RNAse-vrije seriële verdunnings buizen die zullen worden gebruikt voor het kwantificeren van de bacteriële belasting die is teruggewonnen uit de geïnfecteerde longen. Dit wordt gemakkelijk bereikt door 900 μL steriel water in elke micro centrifugebuis te aliquoteren, gevolgd door seriële verdunning van het pathogeen-entmateriaal.
    Opmerking: het aantal verdunnings buizen dat nodig is voor een nauwkeurige inventarisatie van de pathogenen zal variëren naargelang de initiële pathogeen invoer en de duur van de infectie. Dit moet empirisch worden bepaald.
  4. Gebruik steriele Tang, breng de longen over in de bereide weefsel slijper en homogeniseer het weefsel grondig door op het voetstuk te drukken tijdens het roteren.
  5. Open de weefsel slijper en aliquot 100 μL van het gehomogeniseerde monster in de eerste van de voorbereide seriële verdunnings buizen. Verdun de monsters op een seriële wijze en Inventariseer CFUs door te beplating op nutriënt agar. CFUs kan worden opgenomen als CFUs/mL of CFUs/mL/mg longweefsel.
    Opmerking: bij deze stap kan een extra 200 μL van het gehomogeniseerde monster worden verwijderd voor de zuivering van virale RNA (Zie tabel met materialen) of opgeslagen bij-80 °c voor toekomstige analyse.
  6. Nadat de aliquots zijn verwijderd voor CFU-bepaling en/of virale RNA-isolatie, vervangt u het slijp voetstuk en de pellet het gehomogeniseerde weefsel door centrifugeren bij 4.000 rpm (3724 x g) gedurende 10 minuten bij 4 °c.
  7. Verwijder met behulp van een pipet het supernatant uit het monster van de gepileerde en plaats in een micro centrifugebuis van 1,5 ml.
    Opmerking: de supernatant is vrij van bacteriën en kan worden opgeslagen bij-80 °C voor analyse van oplosbare gastheer en uitgescheiden pathogenen factoren.
  8. Regeer de gehomogeniseerde weefsel pellet door Pipetteer of grondig in 700 μL buffer RLT-ß-mercaptoethanol en breng het monster over in een steriele RNase-vrije 1,5 ml micro centrifugebuis.
    Opmerking: op dit punt kunnen de monsters gedurende enkele maanden bij-80 °C worden bewaard.
  9. Zuiver RNA met kleine wijzigingen in het Protocol van de fabrikant van een zuiverings pakket (Zie tabel met materialen); Zie Voyich et al. 200814.
    1. Breng de gehomogeniseerde Long slurry over in een micro centrifugebuis van 2 mL met 0,1 mm silica kralen en verwerkt via een kraal klopper gedurende 20 sec. bij 6 m/s.
    2. Centrifugeer het monster gedurende 3 minuten bij 1.500 rpm. Pipetteer na het centrifugeren het supernatant in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL.
    3. Voeg 350 μL 96% – 100% ethanol toe aan het monster en meng door pipetteren of inversie.
    4. Breng 700 μL van het monster over in een zuiverings kolom die in een opvang buisje van 2 mL is geplaatst. Centrifugeer het monster bij ≥ 8.000 x g gedurende 15 sec. en gooi de doorstroming weg. Voer een extra monster uit via dezelfde kolom als hierboven beschreven.
    5. Was de kolom met 700 μL buffer RW1 en centrifugeer monster bij ≥ 8.000 x g gedurende 15 sec. Gooi de doorstroom weg en breng de silica membraan kolom over in een nieuwe 2 ml opvang buis.
    6. Breng 500 μL buffer RPE aan op de kolom. Was de kolom door centrifugeren bij ≥ 8.000 x g gedurende 15 s. Gooi de doorstroom weg.
    7. Breng een extra 500 μL buffer RPE aan op de RNeasy-kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg en centrifugeer de kolom bij ≥ 10.000 x g gedurende 1 minuut.
    8. Om gezuiverd RNA te elzen, begin met het overbrengen van de kolom naar een nieuwe 1,5 mL RNAse-vrije microcentrifuge buis. Pipetteer 50 μL RNase-vrij water rechtstreeks op het silicagel membraan van de kolom en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij ≥ 8000 x g .
      Opmerking: het eluteerde RNA kan opnieuw over dezelfde kolom worden uitgevoerd om het RNA-rendement te verhogen.
    9. Voeg 50 μL RNase-vrij water toe aan het gezuiverde RNA om het totale volume te brengen tot 100 μL. aliquot 350 μL RLT-ß-mercaptoethanol gevolgd door 250 μL 96% – 100% ethanol naar het monster en meng grondig door pipetteren of inversie.
    10. Breng het monster aan op een zuiverings kolom die in een opvang buisje is geplaatst en centrifugeer bij ≥ 8000 x g gedurende 15 sec. Gooi de doorstroom weg en vervang de opvang buis.
    11. Was de kolom door toevoeging van 350 μL buffer RW1 gevolgd door centrifugeren bij ≥ 8000 x g gedurende 15 sec.
    12. Bereid een DNase-oplossing met ongeveer 27 Kunitz-eenheden voor door toevoeging van 10 μL DNase kolf (750 Kunitz units/mL) tot 70 μL buffer RDD. Voeg 80 μL DNase-oplossing direct op het silicagel membraan toe en inbroed het monster gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    13. Was de kolom met 350 μL buffer RW1 en centrifugeer bij ≥ 8000 x g gedurende 15 sec. en gooi de doorstroming weg.
    14. Herhaal stappen 3.9.6 – 3.9.8 om RNA te zuiveren.
      Opmerking: het wordt aanbevolen om de procedure voor het opschonen van RNA te herhalen door stappen 3.9.9 – 3.9.10 en 3.9.6 – 3.9.8 te volgen (DNase Steps overslaan 3.9.11 – 3.9.13). Deze extra clean-up resulteert in zeer hoge kwaliteit RNA.
  10. RNA-opbrengst kan worden gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer met lezingen bij 260 nM voor het bepalen van de concentratie en 260:280 nM voor zuiverheid. Nadat RNA-opbrengst is verkregen, Standaardiseer de concentratie van elk RNA-monster tot 50 ng/μL.
    Opmerking: het wordt aanbevolen om meerdere aliquots te maken met een concentratie van 50 ng/μL om vries/dooi-cycli te voorkomen die tot RNA-degradatie kunnen leiden.
  11. Bewaar het gezuiverde RNA bij-80 °C of gebruik het onmiddellijk voor transcriptie analyse.
    Opmerking: in eerdere publicaties werd RNA van 3 – 5 muizen samengevoegd voor transcriptie analyse. Door optimalisatie van de bovenstaande techniek is RNA van 1 muis empirisch bepaald als voldoende voor transcriptie analyse (80 – 120 ng/μL).

Representative Results

Figuur 1 maakt gebruik van een 0,1% gewicht/volume Coomassie briljante blauwe oplossing om aan te tonen dat een intratracheale instillatie het entmateriaal direct en gelijkmatig binnen de onderste luchtwegen levert. Figuur 2 toont aan dat de bacteriën (S. aureus) cfus hersteld rechtstreeks uit gehomogeniseerd longweefsel. Figuur 3 demonstreert het gebruik van dit systeem voor een precieze levering en terugwinning van entmateriaal in de onderste luchtwegen door de input en Recovery cfus van individuele muizen te plotten. Figuur 4 toont de QRT-PCR-versterkings curve van het bacteriële huishoud-gen gyrb om aan te tonen dat bacteriële RNA rechtstreeks uit geïnfecteerd longweefsel kan worden geëxtraheerd met minimale DNA-besmetting. Figuur 5 toont de constructie van een standaard curve met QRT-PCR-versterking van het influenza a-virus M-segment om aan te tonen dat virale RNA rechtstreeks uit geïnfecteerd longweefsel kan worden geëxtraheerd.

Figure 1
Figuur 1: intratracheale instillatie maakt gelijkmatige verdeling in de onderste luchtwegen mogelijk. (a, B) Ongeinfecteerd longen werden uit een gezonde muis verwijderd na intratracheale instillatie van steriele PBS en gefotografeerd vanuit (a) rugvin en (B) ventrale perspectieven. (C, D) 50 μL van een 0,1% Coomassie briljante blauwe oplossing werd toegediend aan een verdoofd Mouse via intratracheale toediening. C) dorsale. D) ventrale. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: representatief herstel van bacteriële CFUs van geïnfecteerde Long homogenaat. De longen werden op een dag na de Challenge met S. aureus uitgesneden. Na homogenisering werd 100 μL van de Long slurry sereen verdund tot 10-6. Om te inventariseren CFUs teruggewonnen, 10 μL druppels werden verguld van de 10-5 en 10-6 verdunningen op tryptische soja agar (TSA) en geïnnobeerd bij 37 ° c met 5% C02 's nachts. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: nauwkeurige afgifte en terugwinning van het pathogeen-entmateriaal na toediening van intratracheaal. Muizen werden onderverdeeld in twee groepen met drie muizen per groep. Muizen werden onderworpen aan intratracheale instillatie van S. aureus bij 1 x 108 (laag) en 2 x 108 (hoog) CFU/ml. Een uur na de infectie, muizen werden geëuseerd en de longen werden uitblinkte om de precisie van de instillatie en herstel te demonstreren. Bacteriële entmateriaal en bacteriën teruggewonnen uit de Long homogenaat werden verguld op TSA (tryptische soja agar). Er werden geen significante verschillen gerapporteerd tussen bacteriële invoer en herstel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: representatief bacteriële RNA-herstel en zuiverheid. Zes uur na intratracheale instillatie met 1 x 108 kve/50 ΜL van S. aureuswerden muizen geëgaliseerd. Longen werden uitgesneden en gehomogeniseerd gevolgd door resuspensie van de Long slurry in buffer RLT-ß-mercaptoethanol. RNA werd gezuiverd zoals beschreven in stap 3,914. qRT-PCR werd gebruikt voor het opsporen van transcripten van het bacteriële huishoudelijk gen Gyrb. Een besturingselement met geen reverse transcriptase (nRT) werd opgenomen om de zuiverheid van het herstelde RNA aan te tonen. Bij een drempel van 0,1 werden Gyrb transcripten gedetecteerd in een gemiddelde cyclus van 21,1, 20,3 en 20,5. nRT-besturingselementen werden niet gedetecteerd tot cyclus gemiddelden 35,9, 35,5 en 35,0. n = 3 biologische replicaten, met 3 technische replicaten/biologisch repliceren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: representatief virale RNA-herstel. Zes dagen na intratracheale instillatie met 100 PFU/50 μL influenza A/PR/8/1934 (H1N1) werden muizen geëuseerd. De longen werden uitsneden en gehomogeniseerd, en 200 μL van de gehomogeniseerde slurry werd verzameld en doorgegeven via een celzeef van 70 μm voorafgaand aan virale RNA-zuivering. Gezuiverd RNA werd sereen verdund (10-1-10-4) gevolgd door versterking van influenza A M-segment. A) versterkings plot van influenza-A-RNA dat is teruggewonnen uit een geïnfecteerde Long en verdund 10-1– 10-4. B) standaard curve van influenza A M-segment. Threshold = 0,2, R2 = 0,994, helling =-3,46. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Het gebruik van dit model biedt een zeer efficiënte en reproduceerbare methode om secundaire bacteriële infecties te bestuderen. De mogelijkheid om de afgifte van het pathogeen entmateriaal nauwkeurig te regelen, maakt nauwkeuriger waarnemingen van de individuele en combinatorische effecten van elk pathogeen mogelijk. Inefficiënties in de meer gebruikelijke intranasale instillatie route hebben waarschijnlijk bijgedragen aan de verschillen in dosis volumes en concentraties die in de literatuur aanwezig zijn. Het is redelijk dat het ontbreken van een nauwkeurig lymfeklier systeem om secundaire bacteriële pneumonie te bestuderen vertraagde bevindingen heeft die bacteriële specifieke reacties identificeren die bijdragen aan de ernst van pulmonale co-infecties. Het ontwikkelen van een reproduceerbare model om virulentie expressie te bestuderen tijdens secundaire bacteriële infecties kan leiden tot de identificatie van vaccin-of drugs doelen om deze infecties te verzachten.

De intratracheale instillatie stap is van cruciaal belang om met succes een lagere luchtweginfectie en een down-stream analyse van de pathogenen tot stand te brengen. Wanneer u deze techniek leert, kan het nuttig zijn om te oefenen met behulp van een kleurstof (zoals beschreven in de methoden) voordat u besmettelijk materiaal beheert. Met behulp van een kleurstof zorgt voor de directe visualisatie van het entmateriaal in de luchtwegen. Een veelvoorkomende fout die kan optreden is het inbrengen van de bot-naald in de slokdarm in plaats van de luchtpijp. Dit zal resulteren in de levering van het entmateriaal in de maag in plaats van de longen. Om deze fout te corrigeren, hoek de naald verder weg van het lichaam en geef het naar beneden in de luchtpijp. Eenmaal onder de knie, deze procedure is zeer efficiënt en kan worden gebruikt om experimenten met grote aantallen muizen uit te voeren. Door in batches te werken om muizen te verdoving, kan de intratracheale instillatie in ongeveer 30 seconden per muis worden voltooid. Bovendien kan de excisie van de longen in 2 tot 3 minuten per muis worden voltooid.

Herstel van levensvatbare en zuivere bacteriële RNA van geïnfecteerde weefsels is van cruciaal belang voor transcript analyse. RNases zijn alomtegenwoordig en kunnen een experiment snel verpesten15. Sommige methoden omvatten het gebruik van RNase-remmers; We hebben echter geconstateerd dat het bevriezen van het monster bij-80 °C in RLT-ß-mercaptoethanol of het onmiddellijk verwerken van het monster voor RNA-isolatie met behulp van alle RNase vrije buizen en reagentia effectief zijn in het verminderen van RNase verontreiniging. Daarnaast raden we aan dat maximaal zes monsters tegelijk worden gezuiverd. Met inbegrip van meer dan zes monsters kan resulteren in langdurige latentie tussen de stappen van het protocol die tot de degradatie van RNA leiden kunnen. Eenmaal gezuiverd moet ook worden gezorgd om onnodige vries dooi cycli te voorkomen. Als er dus meerdere analyses op één monster worden uitgevoerd, wordt het aanbevolen om gezuiverd RNA voor opslag bij-80 °C te gebruiken.

Naast de in dit document beschreven technieken kan deze methode worden aangevuld door het uitvoeren van bronchiale alveolaire spoeling voorafgaand aan de excisie en homogenisering van de longen16. Dit kan worden bewerkstelligd door spoeling van de gehele onderste luchtwegen of door het gebruik van hechtdraad om één vertakkings arm van de bronchiale boom te beperken, gevolgd door spoeling door de overblijvende tak. Vaak leidt dit tot een vermindering van het herstel van de pathogeen belasting, maar biedt het een monster, waarna informatie zoals lactaat dehydrogenase-activiteit, identiteit van de cellulaire populatie en cytokine-profielen kunnen worden verkregen16. Samen kunnen deze gegevens een vollediger begrip van de gastheer-pathogen interacties die optreden tijdens secundaire bacteriële pneumonie vormen.

Hoewel de besproken methoden binnen de context van secundaire bacteriële pneumonie zijn geweest, zijn ze geschikt om te worden uitgebreid tot elk muriene model van een lagere luchtweginfectie; met name degenen die baat zouden hebben bij een strak gecontroleerde levering en terugwinning van het geïnstalleerde entmateriaal. Bovendien, net als vele andere infectie routes, de intratracheale instillatie kan worden gebruikt in niet-infectieuze toepassingen, zoals de toediening van therapieën en milieu verbindingen12.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs zouden Nicole Meissner, M.D./Ph.D., Montana State University, willen bedanken voor haar hulp bij het vaststellen van de intratracheale instillatie methode. Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (subsidies NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), evenals fondsen van het Montana University System Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) en de Montana State University Landbouw experiment station.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911100 Referred to in text as "0.1 mm silica beads"
21-gauge blunt needle SAI B21-150 1.5" is recommended.
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 DNase used in the accompanying text.
FastPrep-24 Classic Instrument MP Biomedicals 116004500 FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents Applied Biosystems 4405543 Influenza A M-segment qRT-PCR kit.
Intubation Stand Kent Scientific ETI-MES-01 Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house.
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904 Viral RNA purification kit.
Tissue Grinders Thermo Fisher Scientific 02-542-08
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) Calbiochem UN2966

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64, (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1 (2013).
  2. Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
  3. Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201, (4), 508-515 (2010).
  4. Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. (2016).
  5. Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7, (2), 31359 (2012).
  6. Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209, (6), 865-875 (2014).
  7. Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7, (4), (2016).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218, (5), 809-813 (2018).
  9. Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119, (7), 1910-1920 (2009).
  10. McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2, (4), 240-249 (2007).
  11. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, (2), 222-230 (2008).
  12. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  13. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  14. Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).
  15. Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10, (4), 585-597 (2006).
  16. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
Een nauwkeurig pathogeen lever-en Terugwinningssysteem voor Muriene modellen van secundaire bacteriële pneumonie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).More

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter