Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Точная система доставки патогенов и восстановления для мориновых моделей вторичной бактериальной пневмонии

doi: 10.3791/59566 Published: September 21, 2019

Summary

Здесь мы представляем методы для улучшения вторичных исследований бактериальной пневмонии путем предоставления неинвазивного маршрута зависания в нижних дыхательных путей с последующим восстановлением патогена и анализом стенограммы. Эти процедуры воспроизводимы и могут быть выполнены без специального оборудования, такого как канюли, провода направляющих или волоконно-оптических кабелей.

Abstract

Вторичные бактериальные пневмонии после инфекций гриппа последовательно ранга в десятку ведущих причин смерти в Соединенных Штатах. На сегодняшний день моринмодели коинфекции были основным инструментом, разработанным для изучения патологий как первичных, так и вторичных инфекций. Несмотря на распространенность этой модели, значительные расхождения в отношении процедур зависания, объемов доз и эффективности преобладают среди исследований. Кроме того, эти усилия были в значительной степени неполными в решении вопроса о том, каким образом возбудитель может непосредственно влиять на прогрессирование заболевания после инфицирования. В этом мы предоставляем точный метод доставки патогена, восстановления и анализа, который будет использоваться в моделях мурин вторичной бактериальной пневмонии. Мы демонстрируем, что внутрипеченевая загонация обеспечивает эффективную и точную доставку контролируемых объемов непосредственно и равномерно в нижние дыхательные пути. Легкие могут быть вырезаны для восстановления и количественной оценки бремени патогенов. После иссечения инфицированных легких, мы описываем метод извлечения высококачественной патогенной РНК для последующего транскрипционного анализа. Эта процедура выигрывает от того, чтобы быть нехирургическим методом доставки без использования специализированного лабораторного оборудования и обеспечивает воспроизводимую стратегию для исследования патогенных вкладов во вторичную бактериальную пневмонию.

Introduction

Вторичная бактериальная пневмония после инфекции гриппа является основной причиной смерти в Соединенных Штатах и активной областью исследований1,2. Несмотря на многочисленные исследования с использованием моринмоделе вторичных бактериальных пневмоний, несоответствия в отношении зависания патогенов и допроса остаются3,4,5. Кроме того, в то время как многие предыдущие усилия были сосредоточены на иммуномодуляторных эффектов гриппа, которые приводят к повышенной восприимчивой к вторичной бактериальной инфекции, более поздние данные показывают, что регулирование вирулентности бактериального патогена является равным вклад в установление заболевания6,7,8,9. Эти новые данные требуют более точного метода для изучения вторичной бактериальной пневмонии в моделях мочеиспускания, которые облегчают изучение реакции патогена.

Уникальные для моделей коинфекции гриппа, организмы-хозяина намеренно ослаблены иммунитетом в результате первичной инфекции гриппа до введения вторичного бактериального агента. Для того, чтобы наилучшим образом воспроизвести болезни патогенеза наблюдается в человеческих хозяев, крайне важно, чтобы патогенная нагрузка как первичных, так и вторичных агентов контролироваться, с тем чтобы наблюдать индивидуальные и комбинаторные эффекты каждого инфекционного агента. Чаще всего, респираторные инфекции у мышей были установлены через интраназальное введение3,4,5,6,10. Поскольку этот маршрут известен как технически простой и может быть уместным в некоторых однополых инфекций приложений, это не подходит для совместной инфекции моделей, как процедуры зависания, объемы дозы, и эффективность весьма изменчивы в пределах опубликованная литература3,4,5,6.

Чтобы получить более полное понимание вторичного бактериального патогенеза пневмонии, вклад как хозяина и патогена должны быть рассмотрены. С этой целью мы разработали простой и воспроизводимый подход к восстановлению жизнеспособных бактерий и патогенной РНК из инфицированных легких. Этот метод использует упрощенную, неинвазивную процедуру интрахиальной застойной инфекции с последующей изоляцией бактериальной РНК. Описанная в настоящем году процедура внутричехальной завистывания похожа на описанные ранее методы и не ограничивается патогенной доставкой11,12,13. Использование этой конкретной процедуры выгодно для того, чтобы быть недорогим и не требует использования специализированного оборудования, такого как канюли, провода направляющих или волоконно-оптических кабелей; кроме того, поскольку эта процедура является неинвазивной она обеспечивает минимальную нагрузку на мурин субъектов, сводит к минимуму воспалительные реакции от прививочной механики, и обеспечивает эффективный маршрут доставки для заражения нескольких субъектов. Вкратце, изофлюраны анестезируемые мыши подвешены к резям. Силы используются, чтобы мягко хватать язык, а затем вставки предварительно загружены согнуты, тупой наконечником, 21-калибровочных иглы в трахею и доставки патогенной нагрузки. Проверка этой процедуры подтверждается визуальным подтверждением равномерного распределения красителя в легочной отсеке и восстановления бактериальной нагрузки. Затем мы демонстрируем, как восстановить жизнеспособный золотистый стафилококк (S. aureus) из инфицированных легких и описать воспроизводимый метод изоляции высококачественной патогенной РНК.

Protocol

Все методы соответствуют руководящим принципам Национальных институтов здравоохранения и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) при Университете штата Монтана.

1. Внутрипеченевая закадивка

  1. Подготовьте рабочее пространство, содержащее следующие материалы: интубированную платформу, стерильный шприц 1 мл, стерильные тупые щипцы с тупыми наконечниками, стерильные 21-калиберные тупые наконечники иглы и две конические трубки для хранения шприца и щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интубные платформы можно приобрести на коммерческой основе или построить в доме. Используемая здесь интубная платформа была построена с использованием плексигласа 0,25 дюйма. Кратко, тепло было применено к плексигласу и доска согнута к приблизительному уголу интерьера 65 .. На внешней стороне интубации платформы, два винта машины были посеяны 3 дюйма друг от друга и резиновой полосой была приостановлена между двумя винтами.
  2. Подготовка патогена инокулума путем последовательного разбавления образца так, чтобы желаемая конечная концентрация получена в общем объеме 50 зл. Хранить инокулум на льду.
  3. Надев стерильные перчатки, согните 21 G тупой наконечником иглы примерно до 35 ".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши нужна отдельная игла.
  4. Исправьте согнутую 21 G тупой наконечником иглы на шприц 1 мл. Нарисуйте воздушную подушку в 100 л в шприц, за которым следует 50 л инфекционного агента. Поместите загруженную иглу и шприц в месте, легко доступном доминирующей рукой.
  5. Глубоко анестезирует мышь с помощью 4% изолюран/кислородной смеси или аналогичного метода анестезии IACUC. Правильная глубина анестезии, как правило, получают, когда скорость дыхания медленно примерно до 1 ингаляции на 5-8 с и может быть подтверждена, щипать придаток и не наблюдая никакой реакции от мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод анестезии обеспечил достаточную продолжительность анестезии приблизительно 1,5 мин. Этого было достаточно для того, чтобы члены нашей лаборатории учились и выполняли эту процедуру зависания; однако, другие институционально утвержденные методы анестезии могут быть использованы11,12,13.
  6. Удалите анестезирующую мышь из анестезии камеры и приостановите мышь на интубации платформы от верхнечелюстных резцов.
  7. Чтобы открыть четкий проход в трахею, используйте тупые наконечником щипцы, чтобы мягко схватить и расширить язык за пределами рта. Перенесите язык из щипц в большой и указательный палец недоминирующей руки.
  8. Оставайтесь, держа язык в недоминирующей стороны и забрать предварительно загруженный шприц. Направьте изогнутый конец иглы от тела и вставьте иглу в полость рта к основанию языка.
  9. С иглой у основания языка, осторожно угол запястья, чтобы вызвать небольшой толчок иглы от тела. Этот шаг гарантирует, что игла будет вставлена в трахею, а не в пищевод.
  10. Медленно направляйте иглу вниз в трахею; часто небольшой тик ощущается, как игла проходит через вокальные раза. Пройдите иглу через трахею, пока не ощущается небольшое сопротивление, когда игла сталкивается с кариной.
  11. Слегка поднимите иглу в проксимальном направлении, чтобы приостановить иглу над кариной. Это позволяет осуществлять доставку в два первичных бронха. Полностью угнетать поршень шприца, чтобы доставить инфекционную нагрузку. Снимите иглу с трахеи, подняв вверх и отбросьте.
  12. Удалите мышь с платформы интубации, угнетая резинку, но поддерживать проведение мыши в вертикальном положении. Препятствуйте носовым дыхательным путям, поместив палец прямо над носовыми. Держите это положение в течение примерно 1 мин или до тех пор, пока не сколько глубоких дышит наблюдается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот последний шаг гарантирует, что общий объем инокулума поставляется в нижние дыхательные пути.
  13. Верните мышь в клетку и наблюдайте за полным восстановлением после наркоза.

2. Иссечение инфицированных легких

  1. Работая в ламинарном капоте для поддержания стерильности, подготовьте рабочее пространство со следующими элементами: вес и стерильный вес лодки, вскрытие платформы, вскрытие комплект, содержащий ножницы и щипцы, стерильные РНК-бесплатно PBS, и стерильная марля.
  2. Эвтаназия инфицированной мыши с CO2 или аналогичный IACUC утвержденный метод эвтаназии.
  3. Поместите зараженную мышь на платформу вскрытия и закрепите мышь с помощью булавок в конце каждого придатка. Спрей мыши с этанолом, чтобы помочь сохранить стерильность рабочих поверхностей.
  4. Начиная с пуповины, используйте пару щипц для поднятия кожи и сделать разрез до основания трахеи. Схватив кожу по обе стороны от первоначального разреза, вытащить кожу от тела и прорезать ткани соединений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно, чтобы сделать несколько боковых разрезов по всей коже, чтобы выявить больше грудной области.
  5. Начиная с основания процесса сифоида, сделать небольшой разрез с намерением прокола диафрагмы. Это приводит к увеличению давления в грудной полости, что приводит к легкости втягиваться. С легкими убраны продолжать разрез, чтобы освободить диафрагму.
  6. Удалите ребра, сделав разрез по обе стороны грудной клетки. Это будет полностью разоблачить грудной полости и легких.
  7. Чтобы вырезать легкие, захватить основание сердца с щипками и поднять вверх. Поместите ножницы за легкие и начать делать небольшие разрезы через ткани соединений, продолжая поднимать сердце вверх.
  8. После того, как легкие были вырезаны, поместите их на стерильную марлю и удалить сердце. Сердце может быть легко удалены, подняв его от легких с щипками и резки оставшихся соединений ткани.
  9. Перенесите легкие к предварительно запятнанный шлюпке веса и записываю вес.
  10. После того, как легкие были взвешены, перенесите их в стерильный фосфат буферного соления (PBS) и временно хранить их на льду до тех пор, пока не перейдет к патогенным мерам восстановления и анализа.

3. Восстановление и анализ патогенов

  1. Продолжая работать в ламинарном капоте потока, подготовьте рабочее пространство со следующими припасами: тризмовая машина, стерильная РНК-бесплатно PBS, Buffer RLT, дополненный й-меркаптоэтанолом (1:100), и 1,5 мл РНК-бесплатных микроцентрифуговых труб.
    ВНИМАНИЕ: «Меркаптоэтанол» может быть опасным в случае контакта с кожей, приема, зрительного контакта или ингаляции. Разбавление й-меркаптоэтанола в буфер RLT должно быть сделано в дым овой капот.
  2. Начните с первого добавления 1 мл стерильных РНК-бесплатно PBS в ткани шлифовальной машины. После заполнения, хранить ткани шлифовальный на льду.
  3. Подготовьте серию стерильных РНК-бесплатных серийных пробаразных трубок, которые будут использоваться для количественной оценки бактериальной нагрузки, извлеченной из инфицированных легких. Это легче всего сделать путем приквокивания 900 л стерильной воды в каждую микроцентрифуговую трубку с последующим серийным разбавлением патогенного инокулума.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество пробарационных трубок, необходимых для точного перечисления патогена, будет варьироваться в зависимости от первоначального ввода патогена и продолжительности инфекции. Это должно быть эмпирически определено.
  4. Используя стерильные щипцы, перенесите легкие в подготовленную мясорубку ткани и тщательно гомогенизируя ткань, нажимая на пьедестал при повороте.
  5. Откройте тканяльную шлифовальную машину и аликут 100 л гомогенизированного образца в первую из подготовленных серийных пробазов. Серийно разбавлять образцы и перечислять CfUS, нанося на питательный агар. CFUs могут быть записаны как CFUs/mL или CFUs/mL/mg легочной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе дополнительные 200 qL гомогенизированного образца могут быть удалены для очистки вирусной РНК (см. Таблица материалов)или храниться при -80 градусов по Цельсию для будущего анализа.
  6. После aliquots были удалены для определения CFU и / или вирусной изоляции РНК, заменить шлифовальный пьедестал и гранулы гомогенизированной ткани центрифугации при 4000 об/мин (3724 х г) в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  7. С помощью пипетки, удалить супернатант из гранулированного образца и поместить в 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант не имеет бактерий и может храниться при -80 градусов по Цельсию для анализа растворимых факторов хозяина и секретированных патогенных микроорганизмов.
  8. Повторите гомогенизированные гранулы ткани путем pipetting или вихря в 700 л буфера RLT-й-меркаптоэтанол и передать образец в стерильной РНКЭ-бесплатно 1,5 мл микроцентрифуговой трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
  9. Очистка РНК с использованием небольших изменений в протоколе производителя комплекта очистки (см. Таблица материалов); см. Voyich и др. 200814.
    1. Перенесите гомогенизированную легочную суспензию в микроцентрифугную трубку 2 мл, содержащую 0,1 мм кремнезема, и обработанные с помощью бисера на 20 с при 6 м/с.
    2. Центрифуги образца при 1500 об/мин в течение 3 минут. После центрифугирования, пипетка супернатант в новый 1,5 мл микроцентрифугной трубки.
    3. Добавьте в образец 350 кл/ 96%-100% этанола и тщательно перемешайте путем пипетки или инверсии.
    4. Передача 700 л образца в столбец очистки, помещенный в трубку сбора 2 мл. Centrifuge образец на 8000 х г в течение 15 с и отбросить поток через. Запустите любой избыточный образец через ту же колонку, что описано выше.
    5. Вымойте колонку с 700 л буфера RW1 и центрифуги образца на 8000 х г на 15 с. Отбросьте поток через и передать кремнеземм мембраны колонки в новый 2 мл сбора трубки.
    6. Применить 500 зл буфера RPE к столбце. Вымойте столбец центрифугированием по цене 8000 х г на 15 с. Отбросьте поток через.
    7. Нанесите дополнительные 500 л буфера RPE на столбец RNeasy и центрифугу на 8000 х г в течение 2 мин. Отбросьте протекаемый столбец и центрифуги столбец на 10 000 х г в течение 1 мин.
    8. Чтобы удлинить очищенную РНК, начните с переноса столбца на новую микроцентрифугную трубку без 1,5 мл РНК. Пипетка 50 л воды без RNase непосредственно на кремнеземно-гельмбранной оболочки колонны и центрифуги на 8000 х г в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Eluted РНК может быть запущена по той же колонке снова увеличить выход РНК.
    9. Добавьте 50 qL воды без RNase в очищенную РНК, чтобы довести общий объем до 100 л. Аликвот 350 Л ЛЛ RLT-й-меркаптоэтанол следуют 250 л 96%-100% этанола в образец и тщательно перемешать путем пипеттинга или инверсии.
    10. Нанесите образец на столбец очистки, помещенный в трубку для сбора, и центрифугу на уровне 8000 х г на 15 с. Отбросьте протока и замените трубку для сбора.
    11. Вымойте столбец, добавив 350 л буфера RW1, а затем центроугирование на уровне 8000 х г на 15 с.
    12. Подготовьте раствор DNase, содержащий примерно 27 единиц Kunitz, добавив 10 кЛ запасов DNase (750 куниц единиц/мл) до 70 зл буферных RDD. Добавьте 80 зл раствора DNase непосредственно на кремнезем-гель мембрану и инкубировать образец в течение 15 минут при комнатной температуре.
    13. Вымойте столбец с 350 л буфера RW1 и центрифугой на уровне 8000 х г в течение 15 с и отбросьте поток через.
    14. Повторите шаги 3.9.6-3.9.8 для очищения РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется повторить процедуру очистки РНК, выполнив шаги 3.9.9-3.9.10 и 3.9.6-3.9.8 (пропустить шаги DNase 3.9.11-3.9.13). Эта дополнительная очистка приводит к очень высококачественной РНК.
  10. Урожайность РНК может быть количественно с помощью спектрофотометра с показаниями на уровне 260 нм для определения концентрации и 260:280 нм для чистоты. После получения выхода РНК стандартизируют концентрацию каждого образца РНК до 50 нг/Л.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать несколько аликотов в концентрации 50 нг / Л, чтобы избежать замораживания / оттепели циклов, которые могут привести к деградации РНК.
  11. Храните очищенную РНК при -80 градусах по Цельсию или немедленно используйте для анализа стенограммы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих публикациях РНК от 3-5 мышей была объединена для анализа стенограммы. С помощью оптимизации вышеуказанной методики, РНК из 1 мыши была эмпирически определена как достаточная для анализа стенограммы (80-120 нг/Зл).

Representative Results

Рисунок 1 использует 0,1% вес / объем Coomassie блестящий синий раствор, чтобы продемонстрировать, что внутрипеченевая загонание обеспечивает инокулум непосредственно и равномерно в нижней части дыхательных путей. На рисунке 2 показано, что бактерии(S. aureus) CFUs, извлеченные непосредственно из гомогенизированной легочной ткани. Рисунок 3 демонстрирует использование этой системы для точной доставки и восстановления инокулума в нижних дыхательных путях путем построения входных и восстановительных CFUs от отдельных мышей. На рисунке 4 показана кривая усиления qRT-PCR бактериального гена домашнего хозяйства gyrB, чтобы продемонстрировать, что бактериальная РНК может быть извлечена непосредственно из инфицированной ткани легких с минимальным загрязнением ДНК. На рисунке 5 показано построение стандартной кривой с использованием qRT-PCR усиления вируса Гриппа М-сегмента для демонстрации вирусной РНК может быть извлечена непосредственно из инфицированной ткани легких.

Figure 1
Рисунок 1: Интрахельное засываение позволяет равномерно распределить в нижних дыхательных путях. (A, B) Неинфицированные легкие были вырезаны из здоровой мыши после внутрипечевого зависания стерильных PBS и сфотографированы с (A) дорсальные и (B) вентральные перспективы. (C, D) 50 зЛ из 0,1% Coomassie блестящий синий раствор вводили под анестезирующую мышь через внутрипатчевую администрацию. (C) Дорсал. (D) Вентрал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель восстановления бактериальных CFUs от инфицированных гоменат легких. Легкие были вырезаны в один прекрасный день после вызова с S. aureus. После гомогенации, 100 л л. ллэйса был последовательно разбавлен через 10-6. Чтобы перечислить CFUs восстановлены, 10 капель Л были покрыты от 10-5 и 10-6 разбавления на триптическое соевый агар (TSA) и инкубировали при температуре 37 градусов с 5% C02 ночь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Точные поставки и восстановление патогена инокулум после внутришейного введения. Мыши были разделены на две группы, содержащие три мышей в группе. Мыши подвергались внутричечному заготворению S. aureus в 1 х 108 (низкий) и 2 х 108 (высокий) CFU/mL. Один час после инфекции, мышей усыпили и легкие были вырезаны, чтобы продемонстрировать точность зависания и восстановления. Бактериальный инокулум и бактерии, извлеченные из гомената легких, были покрыты TSA (триптическим соевым агаром). Не было зарегистрировано каких-либо существенных различий между бактериальным и восстановительным ввоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативное восстановление и чистота бактериальной РНК. Шесть часов после внутрихехиального зависания с 1 х 10 CFU/50 ЗЛ S. aureus, мышей были усыплены. Легкие были вырезаны и гомогенизированы с последующим повторной блокировкой легочной суспензии в буфере RLT-'mercaptoethanol. РНК была очищена, как описано в шаге 3.914. qRT-PCR был использован для обнаружения стенограмм бактериального гена домашнего хозяйства gyrB. Контроль, содержащий реверсную транскриптазу (nRT), был включен, чтобы продемонстрировать чистоту восстановленной РНК. При пороге 0,1 транскрипты gyrB были обнаружены при среднем цикле 21,1, 20,3 и 20,5. Элементы управления nRT не были обнаружены до тех пор, пока цикл не составил в среднем 35,9, 35,5 и 35,0. n 3 биологические репликации, содержащие 3 технических репликации/биологические реплицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Представитель вирусного восстановления РНК. Через шесть дней после внутрипечевого зависания с 100 PFU/50 ЗЛ гриппа A/PR/8/1934 (H1N1), мышей усыпили. Легкие были вырезаны и однородны, и 200 л гомогенизированной суспензии был собран и прошел через 70 мкм клеточной ситечко до вирусной очистки РНК. Очищенная РНК была последовательно разбавлена (10-1-10-4),затем усиление гриппа М-сегмента. (A) Усиление участка гриппа РНК оправился от инфицированного легких и разбавленной 10-1-10-4. (B) Стандартная кривая гриппа М-сегмента. Порог 0,2, R2 и 0,994, склон -3,46. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Использование этой модели обеспечивает высокоэффективный и воспроизводимый метод для изучения вторичных бактериальных инфекций. Способность жестко контролировать доставку патогена инокулум позволяет более точно наблюдать индивидуальные и комбинаторные эффекты каждого патогена. Неэффективность в более распространенном маршруте интраназального зависания, вероятно, способствовала расхождениям в объемах доз и концентрациях, присутствующих в литературе. Разумно, что отсутствие точной системы мурина для изучения вторичной бактериальной пневмонии задержало выводы выявления бактериальных специфических реакций, которые способствуют тяжести легочных коинфекций. Разработка воспроизводимой модели для изучения экспрессии вирулентности во время вторичных бактериальных инфекций может привести к выявлению вакцин или лекарств для улучшения этих инфекций.

Шаг внутрижелудочного зависания имеет решающее значение для успешного установления инфекции нижних дыхательных путей и любого анализа патогенных микроорганизмов. При изучении этого метода, это может быть полезно на практике с использованием красителя (как описано в методах) до введения инфекционного материала. Использование красителя позволяет напрямую визуализировать инокулум в дыхательные пути. Распространенной ошибкой, которая может произойти, является вставка тупой иглы в пищевод, а не трахеи. Это приведет к доставке инокулума в желудок, а не в легкие. Чтобы исправить эту ошибку, угол иглы дальше от тела и передать его вниз в трахею. После освоения эта процедура очень эффективна и может быть использована для проведения экспериментов с большим количеством мышей. Работая партиями для обезболивания мышей, внутрипеченевая закачка может быть завершена примерно за 30 секунд на мышь. Кроме того, иссечение легких может быть завершено в 2 до 3 минут на мышь.

Восстановление жизнеспособной и чистобактериальной РНК из инфицированных тканей имеет решающее значение для анализа стенограммы. RNases являются вездесущими и может быстро разрушить эксперимент15. Некоторые методы включают использование ингибиторов RNase; тем не менее, мы обнаружили, что замораживание образца при -80 градусов по Цельсию в RLT-й-меркаптоэтанол или немедленно обработка образца для изоляции РНК с использованием всех RNase свободных труб и реагентов являются эффективными в снижении загрязнения RNase. Кроме того, мы рекомендуем очистить не более шести образцов одновременно. Включение более шести образцов может привести к длительным просркантам между этапами протокола, которые могут привести к деградации РНК. После очищения следует также принимать меры по уходу, чтобы избежать ненужных циклов замораживания-оттепели. Таким образом, если на одном образце будет проведено несколько анализов, рекомендуется процитировать очищенную РНК для хранения при -80 градусов по Цельсию.

В дополнение к методам, рассмотренным в настоящем случае, этот метод может быть дополнен выполнением бронхиальной альвеолярной лавации до иссечения и гомогенации легких16. Это может быть достигнуто путем промывки всего нижних дыхательных путей или с помощью шовной нити, чтобы ограничить одну ветвяющуюся руку бронхиального дерева, за которой следует промывание через оставшуюся ветвь. Часто это приводит к снижению в восстановлении патогенной нагрузки, но предоставляет образец, после чего информация, такая как активность лактата дигидрогеназы, клеточная популяция, и цитокин профили могут быть получены16. Вместе эти данные могут сформировать более полное понимание взаимодействия хозяина-патогена, происходящих во время вторичной бактериальной пневмонии.

Хотя обсуждаемые методы были в контексте вторичной бактериальной пневмонии, они подходят для того, чтобы распространить их на любую модель мурин инфекции нижних дыхательных путей; в частности, те, которые выиграют от жестко госконтроля доставки и восстановления установленного инокулума. Кроме того, как и многие другие маршруты инфекции, внутрипеченевого зависания могут быть использованы в неинфекционных приложений, таких как введение терапевтических и экологических соединений12.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Николь Мейсснер, доктор медицинских наук / Ph.D., Университет штата Монтана, за ее помощь в создании метода внутрипеченого зависания. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (Гранты NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM1115371), а также средства от Монтана университетской системы исследовательской инициативы (51040-MUSRI2015-03 университета) Сельскохозяйственная экспериментальная станция.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911100 Referred to in text as "0.1 mm silica beads"
21-gauge blunt needle SAI B21-150 1.5" is recommended.
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 DNase used in the accompanying text.
FastPrep-24 Classic Instrument MP Biomedicals 116004500 FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents Applied Biosystems 4405543 Influenza A M-segment qRT-PCR kit.
Intubation Stand Kent Scientific ETI-MES-01 Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house.
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904 Viral RNA purification kit.
Tissue Grinders Thermo Fisher Scientific 02-542-08
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) Calbiochem UN2966

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64, (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1 (2013).
  2. Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
  3. Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201, (4), 508-515 (2010).
  4. Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. (2016).
  5. Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7, (2), 31359 (2012).
  6. Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209, (6), 865-875 (2014).
  7. Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7, (4), (2016).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218, (5), 809-813 (2018).
  9. Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119, (7), 1910-1920 (2009).
  10. McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2, (4), 240-249 (2007).
  11. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, (2), 222-230 (2008).
  12. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  13. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  14. Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).
  15. Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10, (4), 585-597 (2006).
  16. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
Точная система доставки патогенов и восстановления для мориновых моделей вторичной бактериальной пневмонии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).More

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter