Tumor mikromiljøet er en viktig del av kreft vekst og invasjon. Å etterligne kreft progresjon, en biologisk relevant menneskelig matrise er nødvendig. Denne protokollen introduserer en forbedring for in vitro tre-dimensjonal spheroid invasjon analysen ved å bruke en menneskelig leiomyoma matrise. Protokollen introduserer også en datamaskin-basert celle invasjon analyse.
To-dimensjonal cellekultur-baserte analyser er ofte brukt i in vitro kreftforskning. Men de mangler flere grunnleggende elementer som danner tumor mikromiljøet. For å oppnå mer pålitelige resultater i vitro, har det blitt innført flere tredimensjonale (3D) cellekultur analyser. Disse analysene tillate kreftceller til å samhandle med ekstracellulære matrise. Denne samhandlingen påvirker celle virkemåten, for eksempel spredning og invasjon, i tillegg til celle morfologi. I tillegg kan denne samhandlingen indusere eller undertrykke uttrykk for flere Pro-og anti-tumorigene molekyler. Spheroid invasjon analysen ble utviklet for å gi en egnet 3D in vitro metode for å studere kreftcelle invasjon. Foreløpig dyr avledet matriser, for eksempel mus sarkom-avledet matrise (MSDM) og rotte hale type I kollagen, er i hovedsak brukt i spheroid invasjon analysene. Tatt i betraktning forskjellene mellom den menneskelige tumor mikromiljøet og dyr avledet matriser, en menneskelig myoma-avledet matrise (HMDM) ble utviklet fra godartet livmor leiomyoma vev. Det har vist seg at HMDM induserer migrasjon og invasjon av kreftceller bedre enn MSDM. Denne protokollen ga en enkel, reproduserbar og pålitelig 3D menneskelig tumor-baserte spheroid invasjon analysen ved hjelp av HMDM/fibrin matrise. Den inneholder også detaljerte instruksjoner om bildebehandling og analyse. Spheroids vokser i en U-formet ultra-lav festeplate i HMDM/fibrin matrise og invadere gjennom det. Invasjonen er daglig avbildet, målt, og analysert ved hjelp av ilastik og Fiji ImageJ programvare. Analysen plattformen ble demonstrert ved hjelp av humant laryngeal primære og metastatisk plateepitel celle kreftcelle linjer. Imidlertid er protokollen egnet også for andre solid kreftcelle linjer.
Konvensjonelle to-dimensjonale (2D) cellekultur studier har betydelig bidratt til kreftforskning. Foreløpig er forskere skiftende mer mot tredimensjonale (3D) cellekultur analyser for å bedre etterligne in vivo forhold1. Den 3D kreftcelle kulturen mer nøyaktig reflekterer komplekse tumor mikromiljøet i form av celle-celle og celle-matrise interaksjoner, Gene Expression profiler, narkotika følsomhet, og signalering Pathway aktivitet2,3.
Flere 3D cellekultur modeller brukes i kreftforskning som tumor vev explant, tumor på en chip, og flercellede tumor spheroids3,4. Flercellede tumor spheroids er nå mye brukt, som de etterligner flere funksjoner i in vivo forhold i Human svulster1,5. Når spheroid diameter er større enn 500 μm, har det til og med hypoxic regioner og et nekrotisk senter, som representerer således in vivo tumor situasjon2.
Mange syntetiske (f. eks, Polydimethylsiloxan) og animalske avledet (f. eks, Rat tail type I kollagen og mus sarkom-avledet matrise, Matrigel, referert til som MSDM) matriser er utviklet for 3D cellekultur analyser3,6, 7,8. Hittil har ingen av de kommersielt tilgjengelige matriser stammer fra menneskelig tumor vev. Derfor mangler de funksjonene til den menneskelige tumor mikromiljøet, som har betydelige virkninger på kreftcelle invasjon prosesser8.
Myogel (humant myoma-avledet matrise, referert til som HMDM) er Hentet fra menneskelig livmor leiomyoma tumor vev9. Det har vist seg at proteininnholdet i HMDM avviker vesentlig fra MSDM. 66% av HMDM proteiner er faktisk forskjellig fra MSDM proteiner. På den annen side, noen proteiner, som laminin, type IV kollagen, heparan sulfat proteoglycans, nidogen, og epidermal vekstfaktor, er til stede i begge matriser10. I tillegg musen skiller seg fra det menneskelige i enzymet innholdet, med mennesker som har 78 færre proteaser enn mus11.
Fibrin har blitt mye brukt alene eller i kombinasjon med andre materialer som et stillas materiale12. I 3D cellekultur analyser, kommersielt tilgjengelig menneskelig fibrinogen og trombin kombineres for å danne en fibrin hydrogel12.
Denne protokollen beskriver en forbedring av tidligere innført 3D svulst spheroid invasjon analysen7. Denne nye protokollen gjelder menneskelige tumor-avledet matrise i stedet for mus-avledet tumor matrise. Det innebærer også Imaging og analyse teknikker ved hjelp ilastik og Fiji ImageJ programvare. Denne protokollen kan brukes til spheroid analysen av flere forskjellige solide kreftcelle linjer. Det tilbyr et biologisk relevant verktøy for å utvikle romanen anti-kreft terapier og å studere effekten av spesifikke molekyler på kreftcelle invasjon.
Den presenterte metoden gir en 3D menneskelig tumor-basert analyse for å evaluere invasiveness av kreftceller i menneskets svulst mikromiljøet etterligne matrise. Kreftcelle invasjon kan lett måles ved daglig bildebehandling med en standard mikroskop og ved hjelp av bildeanalyse programvare. Metoden demonstrerer celle invasjon i stedet for bare spredning.
I motsetning MSDM, det HMDM/fibrin matrise er ikke forlange alle temperatur administrere. Denne metoden er enkel å utføre, spesielt uten behov for å overføre spheroids fra en plate til en annen. Den har bare en teknisk følsom skritt, tillegg av fibrinogen til matrisen. Siden fibrinogen begynner å gel etter noen minutter, legger fibrinogen krever robust pipettering og behandling av bare noen få brønner om gangen. Det er også en risiko for å forstyrre spheroid og flytte den fra sin sentrale posisjon i U-formet brønn hvis pipettering er gjort i et høyt trykk måte. Forvridning av spheroid kan komplisere bildebehandling og til slutt analysen.
Analysen kan endres ved å endre konsentrasjonen av HMDM eller fibrinogen. Cellene kan også være fast og beiset for påfølgende molekylær studier. Selv om denne metoden kan endres til en helautomatisk form, kan den også utføres med et vanlig mikroskop og to åpen kildekode-programvare, uten behov for kostbart utstyr.
Sammenlignet med den tradisjonelle MSDM-baserte 3D-Analyser, denne analysen kan vise bedre celle invasjonen egenskaper. Spheroids vokst i en kjeller membran-inneholdende laminin-rik matrise, som MSDM, kan ha mer spredning av kreftceller enn selve invasjonen, rendering det uegnet for invasjon analyser i flere kreftcelle linjer på grunn av deres lave invaderende kapasitet. En annen hyppig brukt matrise, type I kollagen, har en tendens til å krympe fra kantene under 3D dyrking, noe som påvirker spheroid lokalisering og bildebehandling av brønnene. I tillegg er forskjellene mellom den iboende invasive egenskaper av de mer (HSC-3) og mindre (SCC-25) aggressive tungen kreftcelle linjer har blitt demonstrert ved hjelp av menneskelig svulst mikromiljøet etterligne modeller (myoma plater og løselig form Matrix)10,13.
Analysen er også mer etisk enn å bruke MSDM siden HMDM er Hentet fra leftover materiale av menneskelig leiomyoma svulst. Foreløpig er HMDM den eneste tilgjengelige menneskelige tumor-avledet ECM produkt som synes å være egnet for mange kreft-relaterte in vitro analyser8,10. I fremtiden, animalsk vev-avledet matriser kunne erstattes av menneskelig tumor-baserte matriser for å redusere behovet for å ofre dyr for matrise produksjon.
Skifte 2D cellekultur analyser med 3D-metoder gir mer nøyaktig informasjon om kreftcelle atferd. Foreløpig er det flere 3D-modeller og kommersielle matriser, men dessverre ingen er egnet for alle kreftcelle linjer. Forskere bør velge den mest egnede matrise for deres spesielle analysen. Optimal Matching av analysen og matrise kan være utfordrende, men det kan betydelig øke påliteligheten av resultatene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Oppdragsgivers av denne studien: Sigrid Jusélius Foundation, Cancer Society of Finland, og Helsinki University Central Hospital forskningsmidler. Forfatterne anerkjenner Biomedicum Imaging Unit ved Universitetet i Helsingfors for teknisk hjelp.
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |