O microambiente tumoral é uma parte essencial do crescimento e invasão do câncer. Para imitar a progressão da carcinoma, uma matriz humana biologicamente relevante é necessária. Este protocolo introduz uma melhoria para in vitro o ensaio tridimensional da invasão do esferóide aplicando uma matriz leiomyoma-baseada humana. O protocolo também introduz uma análise de invasão de células baseada em computador.
Ensaios baseados na cultura de células bidimensionais são comumente usados na pesquisa de câncer in vitro. No entanto, eles não têm vários elementos básicos que formam o microambiente tumoral. Para obter resultados in vitro mais fiáveis, foram introduzidos vários ensaios de cultura de células tridimensionais (3D). Esses ensaios permitem que as células cancerosas interajam com a matriz extracelular. Essa interação afeta o comportamento celular, como proliferação e invasão, bem como a morfologia celular. Adicionalmente, esta interação poderia induzir ou suprimir a expressão de diversas moléculas pró-e anti-tumorigenic. O ensaio da invasão de spheroid foi desenvolvido para fornecer um método 3D in vitro apropriado para estudar a invasão da pilha de cancro. Atualmente, matrizes derivadas de animais, como a matriz derivada do sarcoma do camundongo (MSDM) e o colágeno tipo I da cauda de rato, são usadas principalmente nos ensaios de invasão de esferóide. Tendo em consideração as diferenças entre o microambiente do tumor humano e as matrizes animal-derivadas, uma matriz Myoma-derivada humana (HMDM) foi desenvolvida do tecido benigno do leiomyoma do útero. Demonstrou-se que a HMDM induz a migração e invasão de células de carcinoma melhor do que a MSDM. Este protocolo forneceu um ensaio humano simples, reprodutível, e de confiança da invasão do esferóide do tumor-baseado 3D usando a matriz de hmdm/fibrin. Igualmente inclui instruções detalhadas na imagem latente e na análise. Os esferoides crescem em uma placa de fixação Ultrabaixa em forma de U dentro da matriz HMDM/fibrina e invadem-na. A invasão é imaged diariamente, medido, e analisado usando o software de ilastik e de Fiji ImageJ. A plataforma do ensaio foi demonstrada usando linhas de pilha da carcinoma de pilha Squamous preliminar e metastática humanas da laringe. No entanto, o protocolo é adequado também para outras linhas de células cancerosas sólidas.
Estudos de cultura de células bidimensionais convencionais (2D) contribuíram consideravelmente para a pesquisa do câncer. Atualmente, os pesquisadores estão mudando mais para os ensaios de cultura celular tridimensional (3D) para imitar melhor as condições in vivo1. A cultura de células cancerosas 3D reflete com mais precisão o complexo microambiente tumoral em termos de interações célula-célula e célula-matriz, perfis de expressão gênica, sensibilidade a fármacos e atividade de sinalização de vias2,3.
Vários modelos de cultura de células 3D são usados na pesquisa de câncer, como explante de tecido tumoral, tumor em um chip e spheroídeos de tumor multicelular3,4. Os esferóides tumorais multicelulares são agora amplamente utilizados, uma vez que imitam diversas características das condições in vivo em tumores humanos1,5. Quando o diâmetro do esferóide é maior que 500 μm, tem até regiões hipóxicas e um centro necrótico, representando assim a situação tumoral in vivo2.
Muitos sintéticos (por exemplo, polydimethylsiloxane) e animal-derivado (por exemplo, tipo da cauda do rato mim colagénio e matriz sarcoma-derivada do rato, matrigel, referido como msdm) as matrizes foram desenvolvidas para ensaios dacultura de pilha 3D,6, 7,8. Até agora, nenhuma das matrizes comercialmente disponíveis originou do tecido humano do tumor. Portanto, faltam as características do microambiente tumoral humano, que tem efeitos significativos sobre os processos de invasão de células cancerosas8.
Myogel (matriz Myoma-derivada humana, referido como HMDM) é extraído do tecido humano do tumor do leiomyoma do útero9. Demonstrou-se que o teor de proteína do HMDM difere significativamente do MSDM. Na verdade, 66% das proteínas HMDM são diferentes das proteínas MSDM. Por outro lado, algumas proteínas, como laminina, colágeno tipo IV, proteoglicanos de sulfato heparano, nidogênio e fator de crescimento epidérmico, estão presentes em ambas as matrizes10. Adicionalmente, o rato difere do ser humano no índice da enzima, com os seres humanos que têm 78 menos proteases do que ratos11.
A fibrina tem sido amplamente utilizada isoladamente ou em combinação com outros materiais como material de andaime12. Em ensaios de cultura de células 3D, o fibrinogênio humano disponível comercialmente e a trombina são combinados para formar um hidrogel de fibrina12.
Este protocolo descreve uma melhoria do ensaio previamente introduzido da invasão do esferóide do tumor 3D7. Este protocolo novo aplica a matriz tumor-derivada humana em vez da matriz rato-derivada do tumor. Ele também envolve técnicas de imagem e análise usando ilastik e software Fiji ImageJ. Este protocolo poderia ser usado para o ensaio do esferóide de diversas linhas de pilha contínuas diferentes do cancro. Ele oferece uma ferramenta biologicamente relevante para desenvolver novas terapias anticancerígenas e estudar os efeitos de moléculas específicas na invasão de células cancerosas.
O método apresentado fornece um ensaio 3D baseado em tumor humano para avaliar a invasividade de células cancerosas dentro do microambiente humano do tumor que imita a matriz. A invasão de células cancerosas pode ser facilmente medida pela imagem diária com um microscópio padrão e usando o software de análise de imagem. O método demonstra a invasão da pilha um pouco do que meramente a proliferação.
Diferentemente do MSDM, a matriz HMDM/fibrina não requer nenhum controle de temperatura. Este método é fácil de executar, em particular, sem a necessidade de transferir os esferoides de uma placa para outra. Tem apenas um passo tecnicamente sensível, a adição de fibrinogênio à matriz. Uma vez que o fibrinogênio começa a gel após alguns minutos, a adição de fibrinogênio requer uma pipetagem robusta e tratamento de apenas alguns poços de cada vez. Há igualmente um risco de perturbar o esferóide e de movê-lo de sua posição central no poço em forma de U se a pipetagem é feita em uma maneira de alta pressão. A luxação do esferóide pode complicar a imagem e, eventualmente, a análise.
O ensaio pode ser modificado alterando a concentração de HMDM ou fibrinogênio. As células também podem ser fixas e manchadas para estudos moleculares subsequentes. Mesmo que este método possa ser modificado para uma forma totalmente automatizada, ele também pode ser realizado com um microscópio normal e dois softwares de código aberto, sem necessidade de equipamentos dispendiosos.
Em comparação com os tradicionais ensaios 3D baseados em MSDM, este ensaio poderia mostrar melhor as propriedades de invasão de células. Os esferoides cultivados em uma matriz rica em laminina contendo membrana basal, como a MSDM, podem ter mais proliferação de células cancerosas do que a invasão real, tornando-a inadequada para ensaios de invasão em várias linhagens de células cancerosas devido à sua baixa capacidade invasora. Uma outra matriz freqüentemente usada, tipo mim colagénio, tende a encolhimento das bordas durante o cultivo 3D, que afeta a localização do esferóide e a imagem latente dos poços. Adicionalmente, as diferenças entre as propriedades invasivas intrínsecas das linhagens celulares de carcinoma de língua mais (HSC-3) e menos (SCC-25) agressivas têm sido demonstradas por meio do microambiente de tumores humanos imitando modelos (discos de mioma e sua forma solúvel Matrix)10,13.
O ensaio é igualmente mais ético do que usando MSDM desde que HMDM é extraído do material restante do tumor humano do leiomyoma. Atualmente, o hmdm é o único produto de ECM derivado do tumor humano disponível que parece ser adequado para muitos ensaios in vitro relacionados ao câncer8,10. No futuro, matrizes derivadas de tecido animal poderiam ser substituídas por matrizes de tumores humanos para reduzir a necessidade de sacrificar os animais para a produção matricial.
Substituindo ensaios de cultura de células 2D com métodos 3D fornece informações mais precisas sobre o comportamento das células cancerosas. Atualmente, existem vários modelos 3D e matrizes comerciais, mas, infelizmente, nenhum é adequado para todas as linhagens de células cancerosas. Os pesquisadores devem selecionar a matriz mais adequada para o seu ensaio particular. A harmonização óptima do ensaio e da matriz pode ser desafiante, mas poderia significativamente aumentar a confiabilidade dos resultados.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem aos financiadores deste estudo: a Fundação Sigrid Jusélius, a sociedade do câncer da Finlândia e os fundos de pesquisa do hospital central da Universidade de Helsínquia. Os autores reconhecem a unidade de Biomedicum Imaging na Universidade de Helsínquia para a ajuda técnica.
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |