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Neuroscience

प्रारंभिक प्रसवोत्तर माउस दिमाग में रसायनजन्य रूप से इंजीनियर कॉर्टिकल इंटरन्यूरॉन संततिकाका का प्रत्यारोपण

doi: 10.3791/59568 Published: August 26, 2019

Summary

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, cortical interneuron संतति की गतिविधि में हेरफेर करने के लिए chemogenetic उपकरण का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया जल्दी प्रसव के बाद चूहों के प्रांतस्था में प्रत्यारोपित.

Abstract

तंत्रिका विकास पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों का एक जटिल संयोजन द्वारा विनियमित है. प्रत्येक घटक के सापेक्ष योगदान का आकलन एक जटिल कार्य है, जो विशेष रूप से मुश्किल है के विकास के संबंध में है $-aminobutyric एसिड (GABA) ergic cortical interneurons (CIs). CIs सेरेब्रल प्रांतस्था में मुख्य निरोधात्मक न्यूरॉन्स हैं, और वे न्यूरॉन नेटवर्क में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, व्यक्तिगत पिरामिड न्यूरॉन्स की दोनों गतिविधि को विनियमित करके, साथ ही न्यूरॉन पहनावा के दोलनात्मक व्यवहार. वे क्षणिक भ्रूण संरचनाओं में उत्पन्न कर रहे हैं (मध्य और पुच्छ गुच्छिक eminences - MGE और CGE) कि बहुत मुश्किल कुशलता से utero electroporation दृष्टिकोण में उपयोग कर लक्ष्य कर रहे हैं. Interneuron संतति सामान्य भ्रूण विकास के दौरान लंबी दूरी की दूरी विस्थापित, इससे पहले कि वे cortical सर्किट में एकीकृत. यह उल्लेखनीय करने के लिए फैलाने और एक विकासशील नेटवर्क में एकीकृत करने की क्षमता भ्रूण interneuron अग्रदूतों जल्दी प्रसव के बाद मेजबान cortices में प्रत्यारोपण द्वारा अपहरण कर लिया जा सकता है. यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि भ्रूण interneuron संतति के आनुवंशिक संशोधन फोकल पूर्व vivo electroporation का उपयोग कर की अनुमति देता है प्रस्तुत करते हैं. ये इंजीनियर interneuron अग्रदूतों तो जल्दी प्रसव के बाद मेजबान cortices में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, जहां वे आसानी से पहचाने जाने योग्य CIs में परिपक्व हो जाएगा. इस प्रोटोकॉल कई आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरण के उपयोग की अनुमति देता है, या interneuron संतति में विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता, क्रम में परिपक्वता पर या तो आनुवंशिक या पर्यावरणचर के प्रभाव की जांच करने के लिए और CIs का एकीकरण.

Introduction

न्यूरॉन नेटवर्क के समारोह उत्तेजक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स और निरोधात्मक interneurons के एक संतुलित पूरक के अस्तित्व में निर्भर करता है. हालांकि cortical interneurons (सीसी) केवल स्तनधारी cortices में सभी न्यूरॉन्स के 20% का प्रतिनिधित्व करते हैं, उनकी संख्या या समारोह में घाटे neurodevelopmental विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सोचा जाता है1,2. सीआई विकास का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि सीआई क्षणिक भ्रूण संरचनाओं कि उपयोग करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं में उत्पन्न कर रहे हैं, और वे एक लंबे स्पर्शरेखीय प्रवास का पालन करने से पहले वे pallium तक पहुँचने और उनके परिपक्व शारीरिक और शारीरिक विकास गुण3| दोनों आनुवंशिक और पर्यावरण तंत्र ज्ञात हैं कि सीआई विकास4को विनियमित, लेकिन यह कई कारकों के रिश्तेदार योगदान का अध्ययन करने के लिए मुश्किल साबित हो गया है.

सीआई विकास में कई अंतर्दृष्टि प्राप्त की गई थी , जो गंडकीय एमिनेंस5,6से संतानों के अलगाव के बाद इन विट्रो कल्चर सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त की गई थीं . इन तरीकों के महान लाभ में से एक लेबल और आनुवंशिक रूप से अलग संतानों को संशोधित करने और विस्तार से उनके भेदभाव का पालन करने की क्षमता है, सेल-स्वायत्त परिवर्तन का पता लगाने के लिए. हालांकि, इन तरीकों interneurons और एक सक्रिय नेटवर्क के विकास के बीच बातचीत के बारे में जानकारी की पेशकश करने में असमर्थ हैं. हम इन प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है, जल्दी प्रसव के बाद प्रांतस्था में संशोधित अग्रदूतों के प्रत्यारोपण द्वारा. भ्रूणीय गुच्छिका eminences से अलग Interneuron संतति जीवित रहने के लिए, फैलाने और प्रांतस्था7में प्रत्यारोपण पर मेजबान नेटवर्क में एकीकृत करने में सक्षम हैं,8. इस विधि का उपयोग आनुवंशिक माउस मॉडलों में मिरगी के दौरे की गंभीरता को कम करने के लिए किया गया है और विभिन्न न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों9,10के लिए एक संभावित नई चिकित्सा के रूप में प्रस्तावित किया गया है . पिछले प्रोटोकॉल में प्रत्यारोपण11से पहले वायरल सदिशों के साथ इन अग्रदूतों को ट्रांसड्यूस करने की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है. प्रोटोकॉल हम यहाँ का वर्णन भी interneurons के आनुवंशिक संशोधन की अनुमति देता है, लेकिन एक वायरल वेक्टर के निर्माण की आवश्यकता नहीं है, केवल प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यकता होती है, जो बहुत इसके लचीलेपन बढ़ जाती है. कुछ अध्ययनों से आनुवंशिक रूप से काडडल गुच्छिका eminences में interneuron संतति को संशोधित करने के लिए utero electroporation में उपयोग करने में सफलता की सूचना दी (CGE)12, लेकिन इस विधि को पुन: पेश करने के लिए बहुत मुश्किल साबित हो गया है.

प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय व्यक्त करने के लिए इस विधि के उपयोग को वर्णन (DREADDs13) प्रतिरोपित CIs में, एक विधि हम हाल ही में एक प्रकाशन14में इस्तेमाल किया. हम HM3D (जीक्यू), मानव कोलीनर्जिक रिसेप्टर CHRM3 पर आधारित एक इंजीनियर रिसेप्टर व्यक्त किया, जो न्यूरॉन समारोह को प्रभावित नहीं करता है जब तक कि यह अपने विशिष्ट लिगन्ड clozapine-एन-ऑक्साइड (CNO) बांधता है. CNO प्रशासन चुनिंदा hM3D (GQ) कोशिकाओं को व्यक्त करने के सक्रियण से चलाता है. हमने इस विधि का उपयोग यह दिखाने के लिए किया कि सेल स्वायत्त और क्षणिक विध्रुवण विकास14के दौरान CIs के apoptosis को रोकने के लिए पर्याप्त है . विभिन्न आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों के साथ संयुक्त, इस प्रोटोकॉल अप करने की क्षमता है या नीचे जीन अभिव्यक्ति को विनियमित, और कल्पना या interneuron भेदभाव के विभिन्न चरणों के दौरान सेल गतिविधि में हेरफेर.

Protocol

यूनाइटेड किंगडम पशु (वैज्ञानिक प्रक्रियाएं) अधिनियम (1986) के अनुसार पशुओं को पाला और रखा गया था।

नोट: pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP निर्माण के उत्पादन के लिए, एक SalI-StuI टुकड़ा, hM3D (जीक्यू) अनुक्रम युक्त, प्लाज्मिड 50463 (Addgene) से अलग किया गया है, और अभिव्यक्ति वेक्टर pCAGGs-RFP में डाला (एफ गिलोय से) पचा XhoI-EcoRV.

1. माउस भ्रूण Cortical स्लाइस की तैयारी

  1. एक उपयुक्त डिटर्जेंट विलायक और 70% इथेनॉल (EtOH) पानी में समाधान (एच2हे) के साथ प्रयोगशाला उपकरण (उदा., स्टीरियो माइक्रोस्कोप) और सतहों (उदा., बेंच) का बंधना।
  2. विच्छेदन उपकरण है कि autoclaved किया गया है का उपयोग करें और उन्हें 100% EtOH में हर समय रहते हैं.
  3. 50 एमएल ट्यूबों में 4% कम-गिलिंग तापमान के तीन 20 एमएल एलिकोट्स तैयार कीजिए, जो 50 एमएल ट्यूबों में 1x फॉस्फेट बफर विलयन (पीबीएस) में है।
  4. गर्भ के 13.5 या 14.5 दिनों में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा गर्भवती चूहों बलिदान (भ्रूण दिन E13.5-E14.5).
  5. विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी के साथ, गर्भवती चूहों के पेट को खोलने, गर्भाशय सींग को हटाने (भ्रूण के साथ) और उन्हें बर्फ ठंडा Krebs समाधान में जगह (तालिका1),एक 90 मिमी पेट्री डिश में.
  6. सीधे छात्र ठीक forceps की एक जोड़ी के साथ, amniotic थैली खुला, भ्रूण को हटाने और उन्हें ताजा बर्फ ठंडा Krebs समाधान में स्थानांतरण, एक नया 90 मिमी पेट्री डिश में. भ्रूण शरीर के बाकी हिस्सों से माउस भ्रूण मस्तिष्क (फोरब्रेन, मिडब्रेन, हिंदमस्तिष्क) को अलग करें।
  7. Hindbrain से विच्छेदित दिमाग पकड़े, उन्हें एक नया 90 मिमी पेट्री पकवान में बर्फ ठंडा Krebs समाधान में स्थानांतरण, और उन्हें बर्फ पर रहते हैं.
  8. एक निविड़ अंधकार कलम के साथ, बाहर की सतह पर एक सीधी रेखा आकर्षित, छह 35 मिमी पेट्री व्यंजनों के नीचे भाग के बीच में.
  9. एक 4% कम-गिलिंग agarose/ PBS 20 एमएल alicot 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए जगह. तुरंत बाद में गरीब 10 एमएल दो 35 मिमी पेट्री व्यंजन में और विच्छेदन दिमाग एम्बेड.
    नोट: घ्राण बल्ब नीचे की ओर (पेट्री डिश के नीचे) का सामना करना चाहिए। पेट्री डिश प्रति 3-4 दिमाग एम्बेड करें, उन्हें पहले से तैयार की गई सीधी रेखा में संरेखित करें। प्रत्येक दो दिमागों के बीच 3 डिग्री 5 मिमी स्थान दें।
  10. कदम दोहराएँ 1.8 और 1.9 जब तक सभी विच्छेदित दिमाग एम्बेडेड किया गया है.
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेडेड दिमाग प्लेस, agarose के लिए आदेश में ठोस करने के लिए, और बाद में उचित आकार और अभिविन्यास के एक एकल ब्लॉक में तीन दिमाग उत्कीर्ण.
    नोट: मस्तिष्क के नमूनों के किनारों के आसपास लगभग 3 मिमी छोड़ दें. शीर्ष पर घ्राण बल्ब के साथ, दिमाग के उन्मुखीकरण बदलें।
  12. एक microtome आधार की सतह पर ब्लॉक गोंद और एक शल्य ब्लेड का उपयोग कर ब्लॉक के नीचे के माध्यम से सभी तरह से कटौती, प्रत्येक दो दिमाग के बीच, 3 स्वतंत्र ब्लॉक बनाने के लिए (एक मस्तिष्क युक्त प्रत्येक मिनी ब्लॉक).
  13. खंड ब्लॉक, बर्फ ठंडा Krebs समाधान में, 250 डिग्री मीटर मोटी स्लाइस में, एक हिल ब्लेड microtome का उपयोग कर.
  14. एक झुका हुआ फ्लैट-एंडेड माइक्रो-स्पैटुला के साथ केवल मध्यम या पुच्छ गुच्छिक एमिनेंस (एमजीई या CGE) युक्त स्लाइस इकट्ठा करते हैं; चित्र 1) और व्यक्तिगत रूप से उन्हें फिल्टर झिल्ली पर हस्तांतरण (13 मीटर व्यास, 8.0 मीटर pores आकार), न्यूनतम आवश्यक माध्यम पर चल (एमईएम, तालिका 1) polystyrene केंद्र में अच्छी तरह से अंग संस्कृति व्यंजन (60 मिमी x 15 मिमी).
  15. एक सीओ2 ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में व्यंजन प्लेस, 37 डिग्री सेल्सियस पर, 1 ज के लिए, और फोकल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए तैयार करते हैं।

2. तीव्र मस्तिष्क स्लाइस इलेक्ट्रोपोरेशन

  1. इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रक्रिया शुरू करने से पहले, 100 मिमी पेट्री डिश में 1% agarose जेल के 50 एमएल तैयार करते हैं। लगभग 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर ठोस करने के लिए agarose जेल छोड़ दें।
  2. छोटे agarose कॉलम (1 मिमी व्यास और 10 मिमी लंबाई) तैयार करें, एक गिलास पिपेट (225 मिमी लंबाई; 2 एमएल क्षमता) के साथ छिद्रित और उन्हें बर्फ ठंडा Krebs समाधान में स्थानांतरित करें।
    नोट: 2 एमएल पिपेट के लिए उपयुक्त एक रबर ड्रॉपर बल्ब पिपेट से जुड़ा होता है, और इसे दबाकर कॉलम को कांच पिपेट से क्रेब्स समाधान के लिए जारी किया जा सकता है।
  3. एक शल्य ब्लेड के साथ, दो आकारों के छोटे agarose ब्लॉक में कटौती: एक छोटे से एक है कि इलेक्ट्रोड की सतह पर फिट होगा (नीचे देखें) और एक बड़ा एक है, जो मस्तिष्क स्लाइस में फोकल डीएनए इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. बर्फ ठंडा Krebs समाधान में agarose ब्लॉक के रूप में अच्छी तरह से स्थानांतरण.
  4. फोकल इंजेक्शन और तीव्र इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए सेट अप तैयार करें (चित्र2)।
    नोट: इंजेक्शन के लिए, निम्नलिखित उपकरणों की जरूरत है: 1) एक उज्ज्वल क्षेत्र विच्छेदन स्टीरियो-माइक्रोस्कोप, 2) एक वायवीय पिको-पंप इंजेक्टर, 3) एक micromanipulator, 4) एक चुंबकीय स्टैंड, और 5) एक स्टील बेस प्लेट। तीव्र टुकड़ा electroporation के लिए, निम्नलिखित उपकरण की जरूरत है: 1) एक वर्ग प्लैटिनम 10 मिमी पेट्री डिश इलेक्ट्रोड, 2) एक वर्ग प्लैटिनम 10 मिमी कवर इलेक्ट्रोड, 3) एक micromanipulator, और 4) एक electroporator.
  5. फोकल डीएनए इंजेक्शन
    1. अभिव्यक्ति सदिशों का डीएनए मिश्रण तैयार करें: pCAGGs-IRES-GFP (नियंत्रण वेक्टर) + pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, प्रत्येक वेक्टर के लिए 1 $g/$L की सांद्रता पर और तेजी से हरे रंग का समाधान जोड़ें (स्टॉक 25 mg/
    2. डीएनए मिश्रण के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ एक खींचा हुआ ग्लास माइक्रोपिपेट (0.5 मिमी आंतरिक व्यास और 1 मिमी बाहरी व्यास) भरें और टुकड़ा के चयनित क्षेत्र (एमजीई/सीजीई) में छोटी मात्रा (25-50 एनएल रेंज पर) इंजेक्ट करें (चित्र1 और चित्रा 2)।
  6. तीव्र विद्युतपोट्रेशन
    नोट: फोकल डीएनए इंजेक्शन के तुरंत बाद इलेक्ट्रोपोरेशन किया जाना चाहिए।
    1. पेट्री डिश इलेक्ट्रोड पर छोटे agarose ब्लॉक प्लेस और एक फ्लैट एंडेड माइक्रो-स्पेटुला की मदद से मोबाइल कवर इलेक्ट्रोड के लिए agarose स्तंभ देते हैं।
    2. अपने सहायक झिल्ली के साथ स्लाइस को अगारोस ब्लॉक पर स्थानांतरित करें और स्लाइस के चयनित क्षेत्र (एमजीई/सीजीई) के शीर्ष पर अगारोस कॉलम के साथ शीर्ष इलेक्ट्रोड रखें।
      नोट: 125 ट के वोल्टता चार्ज (दो दालों के 5 एमएस प्रत्येक, अंतराल 500 एमएस) एक सफल विद्युत पोर्शन उपज होगी (चित्र 3).
  7. इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद, पकवान में अपने समर्थन झिल्ली के साथ टुकड़ा जगह है और एक सीओ2 ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में पकवान हस्तांतरण, 37 डिग्री सेल्सियस पर.
  8. 1 ज के बाद, प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों के लिए उपयुक्त एक बुनियादी माध्यम के लिए एमईएम माध्यम का आदान-प्रदान करें (न्यूरॉन बुनियादी माध्यम; तालिका 1) और स्लाइस रात भर इनक्यूबेट, लगभग 18-24 एच के लिए.

3. सेल-ग्राफ्ट की तैयारी

  1. सभी स्लाइस में इलेक्ट्रोपोट्रेशन की दक्षता की जाँच करें। केवल उन स्लाइस का चयन करें जहां फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की स्वीकार्य संख्या देखी जाती है (चित्र 3)।
    नोट: कलम के लिए कोशिकाओं की उचित संख्या प्राप्त करने के लिए लगभग 30 स्लाइस/प्रति प्रयोग इलेक्ट्रोपोरेट करें (नीचे देखें)।
  2. प्रत्येक स्लाइस से चयनित क्षेत्र (एमजीई/CGE) को अलग करें और ऊतक को एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन स्टीरियो-माइक्रोस्कोप के तहत, बर्फ ठंड क्रेब्स समाधान में छोटे टुकड़ों में काट लें।
  3. इस बीच, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 900 डिग्री एल न्यूरॉन बुनियादी माध्यम के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब जगह है।
  4. एक P1000 माइक्रोपाइपेटर के साथ ऊतक के टुकड़े को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 500 डिग्री सेल्सियस L15/DNase माध्यम के 500 $L होते हैं, जो DMEM/F12 माध्यम में 1 मिलीग्राम/एमएल DNase स्टॉक के 100 $L को जोड़कर तैयार किया जाता है। दोहन द्वारा ऊतक के टुकड़े धो लें.
  5. DNase के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (स्टॉक 1 मिलीग्राम/एमएल DMEM/F12 माध्यम में) 900 डिग्री एल न्यूरॉन बुनियादी माध्यम में.
  6. L15/DNase माध्यम को छोड़ दें और 200 डिग्री एल न्यूरॉन बुनियादी /
  7. 180 डिग्री सेल्सियस के लिए एक P200 micropipettor सेट और यंत्रवत् ऊपर और नीचे धीरे से pipeting द्वारा ऊतक टुकड़े अलग, 20-30 बार, जब तक एक चिकनी और "क्रीमी" निलंबन प्राप्त किया जाता है.
  8. न्यूरॉन मूल/DNase माध्यम के 200 डिग्री एल जोड़ें (अंतिम कुल मात्रा 400 $L) और resuspend.
  9. कोशिकाओं का 4 डिग्री एल एलिकोट लीजिए, उचित रूप से पतला करें और हीमोसाइटोमीटर पर माउंट करें।
  10. एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत, वियोजन की दक्षता की जाँच करें और कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    नोट: यदि वियोजन सफल होता है, तो चमकीले (अजीव) एकल कोशिकाओं और न कि कोशिका-समुच्चयों का अवलोकन किया जाएगा।
  11. चरण 3.8 से सेंट्रीफ्यूज सेल निलंबन, 1,000 आरपीएम पर, आरटी पर, 5 मिनट के लिए, और बाद में, सुपरनेट को ट्यूब से हटा दें और उपयुक्त L15/DNase माध्यम (आमतौर पर 5-7 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें ताकि कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता 8 x 105-1.2 x 106 कोशिकाओं /
    नोट: पुनर्निलंबन के दौरान, हवा के बुलबुले से बचने के लिए बेहद महत्वपूर्ण है।
  12. बर्फ पर सेल alicot प्लेस और इंजेक्शन के लिए अतिरिक्त L15/DNase माध्यम है.

4. इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन

नोट: निम्नलिखित प्रक्रियाएं पशु गृह सुविधा के भीतर एक प्रक्रिया कक्ष में होती हैं। चूंकि कोशिकाओं को मस्तिष्क को उजागर किए बिना नवजात पिल्ले के मस्तिष्क में सीधे इंजेक्ट किया जाएगा, इसलिए 70% EtOH समाधान के साथ काम करने की जगह को स्टरलाइज करके और ऑटोक्लेव्ड ग्लास सुइयों का उपयोग करके एसेप्टिक स्थितियों को रखा जाता है। निम्नलिखित उपकरण इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन के लिए आवश्यक है: 1) एक उज्ज्वल क्षेत्र विच्छेदन स्टीरियो-माइक्रोस्कोप, 2) एक माइक्रो इंजेक्शन, और 3) माउस वसूली के लिए एक हीटिंग पैड.

  1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार सुइयों खींच कर एक गिलास सुई तैयार करें। एक 80 डिग्री मीटर बाहरी व्यास, 40 डिग्री मीटर आंतरिक व्यास के साथ ग्लास सुई, और एक 30 डिग्री बेवल इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है।
    नोट: जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, सुई का उपयोग करने से पहले ऑटोक्लेव किया जाना चाहिए।
  2. Backfill मैन्युअल रूप से एक 30 जी, 2 इंच सुई और एक सिरिंज का उपयोग जैविक रूप से निष्क्रिय तेल के साथ सुई.
  3. इकट्ठा और निर्माता के निर्देशों के अनुसार इंजेक्टर इकाई के लिए सुई डालने।
  4. अधिकतम वॉल्यूम (69 nL) और एक संबंधित धीमी दर (23 nL/s) पर इंजेक्शन सेटिंग्स निर्धारित करें।
  5. प्लंजर पूरी तरह से बढ़ाया जाता है जब तक सुई खाली.
  6. सुई भरें.
    1. एक grafting टेप से एक छोटा सा टुकड़ा कट और यह एक उज्ज्वल क्षेत्र विच्छेदन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत जगह है. एक P10 micropipette के साथ, टेप पर नमूना (सेल alicot) से 5 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण, ताकि एक गोलाकार ड्रॉप का गठन किया है.
    2. नमूने में सुई की नोक प्लेस और सुई को भरने (प्लंजर retracts और इसके साथ नमूना खींचता है).
      नोट: चूंकि नमूना काफी चिपचिपा होना चाहिए, छोटे चरणों में सुई को भरने के लिए इतना है कि नमूना बराबर होगा, और एक धीमी दर है कि बुलबुले के गठन से रोकता है पर. नमूना सुई के भीतर चिकनी और सजातीय होना चाहिए. यदि नमूना बहुत चिपचिपा है और सुई को भरना संभव नहीं है, तो इसे सही चिपचिपापन प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में ज्यादा L15/DNase माध्यम जोड़ें। फिर भी, यह नमूना की एकाग्रता बदल जाएगा, और आदर्श से बचा जाना चाहिए.
  7. 2-5 मिनट के लिए बर्फ पर नवजात पिल्ले (प्रसव के बाद 0-2 [पी-पी 2]) के लिए बर्फ पर Anaesthetize।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पिल्ला नहीं चल रहा है।
  8. उज्ज्वल क्षेत्र विच्छेदन स्टीरियो-माइक्रोस्कोप के तहत anaesthetized पिल्ला रखें।
  9. प्रत्येक गोलार्द्ध में प्रत्येक 69 एनएल के 3-4 इंजेक्शन प्रदर्शन.
    नोट: इंजेक्शन साइटों लगभग स्थित हैं 1 मिमी पार्श्व midline करने के लिए, और के बीच 1 मिमी पुच्छल bregma करने के लिए और 1 मिमी rostral interaural लाइन के लिए. सुई की नोक लगभग रखा जाना चाहिए 1 मिमी pial सतह के लिए गहरी. प्रत्येक इंजेक्शन के बाद, सुई लगभग 30 s के लिए जगह में छोड़ दिया है और अवधि में वापस ले लिया.
  10. इंजेक्शन के तुरंत बाद, अपनी सबसे कम सेटिंग (37 डिग्री सेल्सियस) पर हीटिंग के साथ एक हीटिंग पैड पर पिल्ला जगह है। जब प्यूप ठीक हो जाता है तो उसे अपनी मां के साथ पिंजरे में स्थानांतरित कर दिया जाता है।
    नोट: कभी पिंजरे में कोई पिल्ले के साथ माँ छोड़ दें. पूरी प्रक्रिया (अपने littermates से पिल्ला हटाने से, जब तक यह वापस आ गया है) कम से कम 10 मिनट पिछले चाहिए.

5. क्लोज़ापिन-एन-ऑक्साइड इंजेक्शन

  1. DREADD ligand, CNO स्टॉक समाधान dimethyl sulfoxide (DMSO) के 50 डिग्री एल में CNO के 1 मिलीग्राम को कम करके तैयार जब तक समाधान पारदर्शी है. अप-अप करने के लिए 10 mL नमकीन के साथ इतना है कि CNO के अंतिम एकाग्रता है 0.1 mg/
    नोट: DMSO विषाक्त है. 0.1% से अधिक एकाग्रता के लिए इसका उपयोग करने से बचें। समाधान युक्त CNO के रूप में एक ही DMSO एकाग्रता युक्त एक नियंत्रण एक नमकीन समाधान के रूप में प्रयोग करें.
  2. प्रसव के बाद के दिन से 14 और 3 गठन के दिनों के लिए (P14-P16), प्रत्येक माउस में दो intraperitoneal प्रदर्शन (आई.पी.) CNO के इंजेक्शन (CNO एकाग्रता: 1 mg/kg) या 0.05% DMSO नमकीन में, प्रति दिन, 12 ज अलग.
  3. अंतिम दिन (P17), 30 मिनट-1 एच की एक समय खिड़की के भीतर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा एक भी इंजेक्शन और बलिदान चूहों प्रदर्शन.

Representative Results

यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हम परीक्षण किया है कि क्या प्रारंभिक प्रसव के बाद चरणों के दौरान cortical interneurons के अस्तित्व एक सेल स्वायत्त तरीके से गतिविधि द्वारा विनियमित है. हम 3 मस्तिष्क टुकड़ा electroporation प्रयोगों प्रदर्शन किया (12-16 भ्रूण [E14.5 भ्रूण] प्रति प्रयोग) pCAGGs-IRES-GFP (नियंत्रण) और pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP अभिव्यक्ति वेक्टर, प्रत्येक निर्माण के लिए एक एकाग्रता पर 1g/ हमारे इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रयोगों में, केवल एक अंश (लगभग 50%; चित्र 3) GFP+ न्यूरॉन्स सह expressed hM3D (जीक्यू) (RFP+) और इसलिए GFP+आरएफपी- जनसंख्या DREADD ligands के प्रभाव के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा की. पारंक्रमित वल्कुट भ्रूणीय अंतर-न्यूरॉन्स यंत्रवत् अलग हो गए थे और परिणामस्वरूप कोशिका निलंबन (8 x 105 कोशिकाओं/ हम मस्तिष्क प्रति 6 इंजेक्शन प्रदर्शन किया था. प्रत्येक प्रयोग में, कम से कम 6 नवजात पिल्ले इंजेक्ट किए गए थे। CNO के प्रशासन चुनिंदा transfected आरएफपी+ कोशिकाओं की गतिविधि में वृद्धि हुई, के रूप में गतिविधि पर निर्भर प्रोटीन cFos की अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शन (चित्र 4). CNO उपचार वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार (प्रशासन दो बार दैनिक P14-P17) GFP के अनुपात में वृद्धि हुई+आरएफपी+ GFP के सापेक्ष+आरएफपी- कोशिकाओं, वाहन की तुलना में (0.5% dmSO नमकीन में) प्रशासित कूड़े -- (चित्र 5)।

Figure 1
चित्र 1: प्रतिनिधि टेलीनेसेफेलिक स्लाइस तीव्र विद्युत-संकरण प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है। (ए-सी) टेलीनसेफेलिक स्लाइस तीन अलग-अलग अनुक्रमिक रोस्ट्रो-कॉडल स्तर पर प्राप्त किए गए, जो 4$,6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनोल (डीएपीआई) के साथ दागित हैं। एलजीई: पार्श्व गुच्छिका eminence; MGE: मध्य गुच्छिका eminence; CGE: पुच्छ गुच्छिका eminence. स्केल बार्स $ 200 डिग्री मी. पीला तारांकन प्रत्येक स्लाइस में इलेक्ट्रोपोरेशन साइट को इंगित करता है। सफेद रेखा गुच्छिका के किनारे को चिह्नित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. () माउस मस्तिष्क स्लाइस उपयुक्त constructs के साथ electroporated हैं, और (बी) 12 ज संशोधित cortical interneuron के बाद (सीआई) अग्रदूतों अलग कर रहे हैं और (सी) नवजात माउस पिल्ले के पैलियम में प्रतिरोपित (P0 $P2 ). अपरिपक्व CIs की गतिविधि को संशोधित करने के लिए, P14 पिल्ले कि सेल प्रत्यारोपण प्राप्त किया था प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार चार गठन दिनों के लिए CNO या वाहन के साथ इंजेक्शन थे. (ए') तीव्र माउस मस्तिष्क टुकड़ा इलेक्ट्रोपोरेशन सेट-अप की तस्वीर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि सफल तीव्र टुकड़ा विद्युत पोचेशन प्रयोग. (ए) एक E14.5 भ्रूण मस्तिष्क से प्रतिनिधि कोरोनल अनुभाग दोनों pCAGGs-IRES-GFP (GFP) और pCAGGs-hM3D (GQ) -IRES-RFP (RFP) प्लाज्मिड और 12 एच के लिए सुसंस्कृत के साथ CGE में transfected. अनुभाग GFP (ए, बी, सी) और आरएफपी (ए, बी, डी) के लिए प्रतिरक्षा किया गया है। पैनल ए में बॉक्स्ड क्षेत्र को फ्लोरोसेंट पत्रकारों (बी), जीएफपी (सी) और आरएफपी केवल ( डी ) दोनों की अभिव्यक्ति दिखाने के लिए बढ़ाया गयाहै. सफेद रेखा गुच्छिका के किनारे को चिह्नित करता है। बी-डी: एक ही तस्वीर, विभिन्न चैनलों या दो अलग अलग चैनलों के संयोजन। स्केल बार्स ] 200 डिग्री मी (ए), 100 डिग्री मीटर (बी-डी)। यह आंकड़ा Denaxa एट अल14से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सेल स्वायत्त वृद्धि M3D (GQ) की गतिविधि में वृद्धि-Expressing CNO प्रशासन पर प्रतिरोपित CIs. (ए-डी) एक P17 माउस के एक कोरोनल अनुभाग के प्रतिनिधि confocal छवियों CI अग्रदूतों दोनों pCAGGs-IRES-GFP (GFP) और pCAGGs-hM3D (जीक्यू)-IRES-RFP (RFP) प्लाज्मिड के साथ transfected और CNO के साथ इलाज के साथ transfected. इस खंड को जीएफपी (), आरएफपी (बी) और सीएफओ ( सी ) के लिए प्रतिरक्षण किया गयाहै. (घ) ए, बी और सी इम्यूनोफ्लोरेसेंस (कंबो) की संयुक्त छवि। ध्यान दें कि केवल CIs सह दोनों प्लाज्मिड (ए-डी में सफेद तीर) भी cFos+ केवल नियंत्रण GFP प्लाज्मिड व्यक्त करने के लिए की तुलना में cFos हैं (पीले तीर ए-डी में). () सीएफओका का परिमाणीकरण+आरएफपी+ पी 17 चूहों के पैलियम में पाई जाने वाली कोशिकाओं को पी 1 (कुल आरएफपी+ जनसंख्या के लिए सामान्यीकृत) में प्रत्यारोपित किया गया और वाहन या सीएनओ (एन जेड 2) के साथ इलाज किया गया। A-D: एक ही फ़ोटो, विभिन्न चैनल या तीन अलग-अलग चैनलों का संयोजन. स्केल बार्स ] 50 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: सीआईए की गतिविधि में सेल स्वायत्त वृद्धि अस्तित्व को बढ़ाता है . (ए-डी) P17 चूहों के somatosensory प्रांतस्था कोरोनल स्लाइस के प्रतिनिधि confocal छवियों सीआई अग्रदूतों के साथ P0-P2 में प्रत्यारोपित दोनों pCAGGs-IRES-GFP (GFP) और pCAGGs-hM3D (जीक्यू)-IRES-RFP (RFP) plasmids और वाहन के साथ इलाज किया(ए-बी)या वाहन के साथ इलाज किया (सी-डी)। () पी0-पी2 (कुल जीएफपी+ जनसंख्या के लिए सामान्यीकृत) पी0पी2 में प्रतिरोपित पी017 चूहों के फोरब्रेन में पाई जाने वाली आरएफपी+ कोशिकाओं का परिमाणीकरण। RFP+(वाहन) - 47% - 3%, CNO - 61% $ 3%, p $ 0.01, छात्र के युग्मित नमूना टी परीक्षण, n - 3 वाहन और 3 CNO, मस्तिष्क के अनुसार गिना 150 कोशिकाओं की एक न्यूनतम. ए और बी: एक ही तस्वीर, विभिन्न चैनलों. सी और डी: एक ही तस्वीर, विभिन्न चैनलों. स्केल बार $ 50 डिग्री मी. यह आंकड़ा Denaxa एट अल14से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए मीडिया से संबंधित अतिरिक्त जानकारी.

Discussion

यहाँ हम सीआई परिपक्वता पर आंतरिक गतिविधि के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सीआई अग्रदूतों की गतिविधि आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन, और / सर्किट.

अतीत में, हमारे सहित कई प्रयोगशालाओं, आनुवंशिक रूप से प्रक्षेपण न्यूरॉन्स6को संशोधित करने के क्रम में utero इलेक्ट्रोपोर्शन प्रयोगों में प्रदर्शन किया था। हालांकि, यूटेरो इलेक्ट्रोपोरोन में गुच्छिकाीय एमिनेंस में जिसमें सीआई संतति शामिल है, विद्युत चालन पथ समस्याओं के कारण बहुत मुश्किल है। आदेश में इस समस्या को हल करने के लिए, प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं, जो एक मांग तकनीक है कि महंगा उपकरण की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल इन तरीकों जो वैज्ञानिक समुदाय के बहुमत के लिए सुलभ है के लिए एक विकल्प प्रदान करता है.

इस प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू में से एक कोशिकाओं है कि मेजबान प्रांतस्था में जीवित रहने के लिए चरणों परिपक्व करने के लिए की संख्या को अधिकतम करने के लिए है, जब phenotypic विश्लेषण आमतौर पर किया जाता है (बहुत प्रयोग डिजाइन पर निर्भर है, लेकिन आम तौर पर P17 से पुराने). वहाँ तीन महत्वपूर्ण कदम है कि अन्वेषक ध्यान देना चाहिए रहे हैं: (1) विद्युत पोर्शन की दक्षता. यह डीएनए प्लाज्मिड की शुद्धता सुनिश्चित करके अधिकतम किया जा सकता है। केवल उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए प्लाज्मिड (एकA 260/A280 अनुपात 1.9-2.0) इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम सीजियम क्लोराइड डीएनए शुद्धि को रोजगार द्वारा इस तरह के उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए तैयारी प्राप्त करते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक प्रमोटर है कि ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव है. हमने पाया है कि pCAGGs वेक्टर, जो चिकन बी-actin प्रमोटर के होते हैं, अत्यंत शक्तिशाली है और नाटकीय रूप से विद्युत उत्पादन दक्षता में वृद्धि कर सकते हैं. (2) शुरू दाता भ्रूण की संख्या. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि एक ही चरण के भ्रूणों की एक बड़ी संख्या (12-16) विद्युतीकृत हो। इस संख्या को बढ़ाया जा सकता है, यदि अधिक प्रयोगकर्ता भ्रूण विच्छेदन और एक साथ अनुभागकर प्रदर्शन कर रहे हैं, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि भ्रूण cortical स्लाइस प्राप्त कर रहे हैं, electroporated और जितनी जल्दी हो सके इनक्यूबेटर को स्थानांतरित. (3) यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या परिपक्व चरणों तक प्रतिरोपित सेल अस्तित्व के एक उच्च मौका सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक पिल्ला में इंजेक्शन रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह नाटकीय रूप से सफल प्रत्यारोपण की संभावना में सुधार होगा के बाद से कम घनत्व सेल की तैयारी मध्यम के साथ कोशिकाओं के असमान मिश्रण में परिणाम होगा, जो प्रत्यारोपित दिमाग में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता का उत्पादन होगा15 .

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक सेल-स्वायत्त तरीके से सीआई अस्तित्व को विनियमित करने में गतिविधि की भूमिका की जांच के लिए तैयार किया गया था। CNO इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए P14-P17 समय खिड़की विशेष रूप से प्रकाशित डेटा के अनुसार चुना गया था, जो बताते हैं कि प्रतिरोपित सीआई संतति 'सेल मौत की चोटी इस अवधि के दौरान होता है16. इसलिए, इस समय सीमा या CNO इंजेक्शन की आवृत्ति अन्य सेल प्रकार या मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए सच नहीं पकड़ सकता है, और अन्वेषक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रयोजनों के अनुसार इन मापदंडों को समायोजित करना चाहिए. अंत में, CIs के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन के लिए यहाँ वर्णित पद्धति केवल P0-P5 पिल्ले के लिए संभव है (माउस लाइन पृष्ठभूमि पर भी निर्भर करता है)। सिद्धांत रूप में, P5 पर किसी भी इंजेक्शन thinning या खोपड़ी15को हटाने की आवश्यकता होगी.

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभों में से एक वे एक विकासशील नेटवर्क में एकीकृत के रूप में भेदभाव के विभिन्न चरणों के दौरान CIs की गतिविधि कल्पना या हेरफेर करने के लिए नए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरण का उपयोग करने की क्षमता है. नई आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज और कैल्शियम सेंसर की खोज की गति के साथ, साथ ही नए chemogenetic और optogenetic उपकरण, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं उन्हें प्लाज्मिड खजाने में रिलीज के सप्ताह के भीतर उपयोग करने की अनुमति देता है, जैसे Addgene.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम एक ईआरसी स्टार्टर अनुदान (282047), एक वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक पुरस्कार (095589/$/11/]), एक FP7 ईसी DESIRE अनुदान, और जेबी के लिए एक लिस्टर संस्थान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। वी.पी. की प्रयोगशाला में काम BBSRC (BB/L022974/1), ब्रिटेन चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी), और फ्रांसिस क्रिक संस्थान (जो एमआरसी, कैंसर अनुसंधान ब्रिटेन, और वेलकम ट्रस्ट) से धन प्राप्त करता है द्वारा समर्थित है। एमडी प्रयोगशाला में अनुसंधान के लिए B.S.R.C. "Alexander फ्लेमिंग", ग्रीक अनुसंधान का समर्थन करने के लिए फाउंडेशन की पहल के भाग के रूप में Stavros Niarchos फाउंडेशन से अनुदान के माध्यम से संभव बनाया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium/Supplements
B-27 GIBCO (ThermoFisher Scientific) 175040-044
DMEM/F12  GIBCO (ThermoFisher Scientific) 21331-020
DNAse SIGMA DN15-100MG
FBS GIBCO (ThermoFisher Scientific) 10270-098
100x Glutamine GIBCO (ThermoFisher Scientific) 35050-061
L15 GIBCO (ThermoFisher Scientific) 11415-049
MEM alpha, GlutaMAX GIBCO (ThermoFisher Scientific) 32561-029
Neurobasal medium GIBCO (ThermoFisher Scientific) 21103-049 Neuron basic medium
100x P/S GIBCO (ThermoFisher Scientific) 15140-122
Equipment
Electroporator BTX ECM 830 generator
Injector for acute slice electroporation  Eppendorf FemtoJet Microinjector
Injector for cell transplantation (I) Visual Sonics Vevo Injector System
Injector for cell transplantation (II) WPI NANOLITER2010
Magnetic Stand WPI M10L Magnetic Stand
Kite Manual Micromanipulator WPI KITE-M3-R
Platinum Elecrode (I) Protech International Inc. CUY-700-1
Platinum Elecrode (II) Protech International Inc. CUY-700-2
Steel Base Plate WPI 5479
Vibratome Leica VT1200S
Other Material
Glass capillaries for electroporation VWR 1B100-4
Glass capillaries for cell transplantation Visual Sonics provided by  Visual Sonics
Nuclepore 8 µm whatman membrane SLS 110414
Organ tissue culture dishes BD Biosciences (Falcon) 353037

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References

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प्रारंभिक प्रसवोत्तर माउस दिमाग में रसायनजन्य रूप से इंजीनियर कॉर्टिकल इंटरन्यूरॉन संततिकाका का प्रत्यारोपण
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Denaxa, M., Neves, G., Burrone, J., Pachnis, V. Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (150), e59568, doi:10.3791/59568 (2019).More

Denaxa, M., Neves, G., Burrone, J., Pachnis, V. Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (150), e59568, doi:10.3791/59568 (2019).

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