Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo, projetado usar ferramentas chemogenetic para manipular a atividade de progenitores corticais do interneurônios transplantados no córtice de ratos pós-natal adiantados.
Abstract
O desenvolvimento neuronal é regulado por uma combinação complexa de fatores ambientais e genéticos. Avaliar a contribuição relativa de cada componente é uma tarefa complicada, o que é particularmente difícil no que diz respeito ao desenvolvimento de interneurônios corticais (GABA) ergálicos de ácido γ-aminobutírico. Os CIs são os principais neurônios inibitórios no córtex cerebral, e desempenham papéis-chave em redes neuronais, regulando tanto a atividade de neurônios piramidais individuais, como também o comportamento oscilatório de conjuntos neuronais. Eles são gerados em estruturas embrionárias transitórias (Eminências gangliônicas medial e caudal-MGE e CGE) que são muito difíceis de direcionar eficientemente usando abordagens de eletroporação de Utero. Os progenitores de interneuron migram distâncias longas durante o desenvolvimento embrionário normal, antes que se integrem no circuito cortical. Esta notável capacidade de dispersão e integração em uma rede em desenvolvimento pode ser seqüestrado por transplante de precursores embrionário do interneurônios em córtices de acolhimento pós-natal precoce. Aqui, nós apresentamos um protocolo que permita a modificação genética de progenitores embrionário do interneurônios usando o electroporation ex vivo focal. Estes precursores projetados do interneurônios são transplantados então em córtices adiantados do anfitrião do borne-Natal, onde matarão em cis fàcilmente identificáveis. Este protocolo permite o uso de múltiplas ferramentas geneticamente codificadas, ou a capacidade de regular a expressão de genes específicos em progenitores do interneurônios, a fim de investigar o impacto de variáveis genéticas ou ambientais sobre a maturação e integração dos CIs.
Introduction
A função das redes neuronais depende da existência de um complemento equilibrado de neurônios de projeção excitatórios e interneurônios inibidores. Embora os interneurônios corticais (CIS) representem somente 20% de todos os neurônios nos córtices de mamíferos, os deficits em seu número ou função são pensados para jogar uma parte chave na patogénese de desordens do neurodesenvolvimento1,2. O estudo do desenvolvimento do CI é desafiador porque os CIS são gerados em estruturas embrionárias transientes que são difíceis de alcançar, e seguem uma migração tangencial longa antes que alcancem o pálio e desenvolvam seu maduro anatômico e physiological Propriedades3. Os mecanismos genéticos e ambientais são conhecidos que regulam o desenvolvimento do CI4, mas provou difícil estudar a contribuição relativa de fatores múltiplos.
Muitas percepções no desenvolvimento do CI foram obtidas usando sistemas in vitro da cultura após o isolamento dos progenitores das Eminências ganglionic5,6. Uma das grandes vantagens desses métodos é o potencial de rotular e modificar geneticamente os progenitores isolados e seguir sua diferenciação em detalhes, para detectar mudanças celulares-autônomas. No entanto, esses métodos não conseguem oferecer informações sobre as interações entre o desenvolvimento de interneurônios e uma rede ativa. Nós adaptamos estes protocolos, pela transplantação dos precursores modificados no córtice borne-Natal adiantado. Os progenitores do interneuron isolados das Eminências ganglionic embrionário podem sobreviver, dispersar e integrar na rede do anfitrião em cima da transplantação no córtice7,8. Este método tem sido utilizado para reduzir a severidade das crises epilépticas em modelos genéticos de camundongo, e tem sido proposto como uma possível nova terapia para diferentes distúrbios do neurodesenvolvimento9,10. Um protocolo precedente descreve um procedimento para transduce estes precursores com vetores virais antes dos transplantações11. O protocolo que descrevemos aqui também permite a modificação genética de interneurônios, mas não requer a criação de um vetor viral, exigindo apenas DNA plasmídeo, o que aumenta consideravelmente a sua flexibilidade. Alguns estudos relataram sucesso na utilização de eletroporação em utero para modificar geneticamente os progenitores do interneurônios nas Eminências gangliónicas caudais (CGE)12, mas este método provou ser muito difícil de reproduzir.
Na seção de resultados representativos, ilustramos o uso deste método para expressar receptores de designers exclusivamente ativados por drogas de grife (DREADDs13) nos cis transplantados, um método que usamos em uma publicação recente14. Nós expressamos hM3D (GQ), um receptor projetado baseado no receptor colinérgicos humano CHRM3, que não afeta a função neuronal a menos que liga seu ligante específico Clozapine-N-óxido (CNO). A administração de CNO seletivamente dispara a ativação de hM3D (GQ) expressando pilhas. Nós usamos este método para mostrar que a despolarização autônoma e transiente da pilha é suficiente para impedir o apoptose dos CI durante o desenvolvimento14. Combinado com as ferramentas genetically codificadas diferentes, este protocolo tem o potencial para acima-ou para baixo-regula a expressão de Gene, e visualiza ou manipula a atividade da pilha durante estágios diferentes da diferenciação do interneurônios.
Protocol
Os animais foram criados e alojados em conformidade com a lei dos animais do Reino Unido (procedimentos científicos) (1986).
Nota: Para a geração do construto pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, um fragmento de SalI-StuI, contendo a seqüência hM3D (GQ), foi isolado do plasmídeo 50463 (Addgene), e inserido na expressão vetor pCAGGs-RFP (presente de F. Guillemot) digerido com XhoI-EcoRV.
1. preparação de fatias corticais do embrião do rato
- Esterilize O equipamento de laboratório (por exemplo, microscópios estereofónicos) e as superfícies (por exemplo, bancos) com um solvente detergente apropriado e uma solução do ethanol 70% (EtOH) na água (H2O).
- Use ferramentas de dissecção que foram autoclavadas e mantê-los o tempo todo em 100% EtOH.
- Prepare 3 20 mL de alíquotas de agarose de baixa temperatura de 4% em solução tampão fosfato 1x (PBS), em tubos de 50 mL, e mantenha-os a 55 ° c.
- Sacrifique camundongos gestantes por luxação cervical em 13,5 ou 14,5 dias de gestação (dia embrionário E 13,5-E 14,5).
- Com um par de tesouras de dissecção, abra o abdômen dos camundongos grávidas, retire os chifres uterinos (com os embriões) e coloque-os em solução de Krebs gelada (tabela 1), em um prato de Petri de 90 mm.
- Com um par de fórceps fino do estudante reto, abra os sacos líquido amniótico, remova os embriões e transfira-os na solução Ice-Cold fresca de Krebs, em um prato de Petri novo de 90 milímetros. Dissecar o cérebro do embrião do rato (forebrain, midbrain, hindbrain) do descanso do corpo do embrião.
- Segurando os cérebros dissecados do hindbrain, transferi-los em solução de Krebs gelada em um novo prato de Petri de 90 mm, e mantê-los no gelo.
- Com uma caneta impermeável, desenhe uma linha reta na superfície exterior, no meio da parte inferior de 6 35 mm pratos de Petri.
- Coloque uma alíquota de 4% de agarose/PBS de 20 mL a 37 ° c por 5 min. imediatamente depois de 10 mL em pratos de Petri de 2 35 mm e incorpore os cérebros dissecados.
Nota: Os bulbos olfactory devem enfrentar para baixo (parte inferior do prato de Petri). Incorpore 3-4 cérebros por prato de Petri, alinhe-os na linha reta previamente desenhada. Deixe um espaço de 3 − 5 mm entre cada dois cérebros. - Repita as etapas 1,8 e 1,9 até que todos os cérebros dissecados tenham sido incorporados.
- Coloc os cérebros incorporados em 4 ° c, para que o agarose solidifique, e cinzele subseqüentemente os três cérebros em um único bloco do tamanho e da orientação apropriados.
Nota: Deixe cerca de 3 mm em torno das bordas das amostras cerebrais. Mude a orientação dos cérebros, com os bulbos olfactory na parte superior. - Cole o bloco na superfície de uma base de micrótomo e usando uma lâmina cirúrgica cortada todo o caminho através da parte inferior do bloco, entre cada dois cérebros, a fim de criar 3 blocos independentes (cada mini bloco contendo um cérebro).
- Seção os blocos, em solução de Krebs gelada, em fatias grossas de 250 μm, usando um micrótomo vibratório da lâmina.
- Com um micro-spatula liso-terminado dobrado colete somente as fatias que contêm as Eminências ganglionic medial ou caudal (MGE ou CGE; Figura 1) e transferi-los individualmente para as membranas filtrantes (diâmetro de 13 μm, tamanho de poros de 8,0 μm), flutuando em meio essencial mínimo (MEM, tabela 1) em pratos de cultura de órgãos de centro-poço de poliestireno (60 mm x 15 mm).
- Coloc os pratos em uma incubadora da cultura do tecido do CO2 , em 37 ° c, para 1 h, e prepare-se para o electroporation focal.
2. Electroporation agudo da fatia do cérebro
- Antes de iniciar o procedimento de electroporação, prepare 50 mL de gel de agarose a 1% num prato de Petri de 100 mm. Deixe o gel de agarose solidificar à temperatura ambiente (RT) durante aproximadamente 30 min.
- Prepare pequenas colunas de agarose (1 mm de diâmetro e 10 mm de comprimento), perfuradas com uma pipeta de vidro (225 mm de comprimento; 2 mL de capacidade) e transferi-las em soluções Krebs geladas.
Nota: Um bulbo conta-gotas de borracha adequado para pipetas de 2 mL é anexado à pipeta, e pressionando-o a coluna pode ser liberada a partir da pipeta de vidro para a solução Krebs. - Com uma lâmina cirúrgica, corte pequenos blocos de agarose de dois tamanhos: um pequeno que se encaixará na superfície do eletrodo (veja abaixo) e um maior, que será usado como base para a realização das injeções focais de DNA nas fatias cerebrais. Transfira os blocos do agarose na solução Ice-Cold de Krebs também.
- Prepare o set-up para as injeções focais e a eletroporação aguda (Figura 2).
Nota: Para as injeções, é necessário o seguinte equipamento: 1) uma dissecção de campo brilhante estéreo-microscópio, 2) um injetor de pico-bomba pneumática, 3) um micromanipulador, 4) um suporte magnético, e 5) uma placa de base de aço. Para o electroporation agudo da fatia, os seguintes equipamentos são necessários: 1) um elétrodo quadrado da placa de Petri de 10 milímetros da platina, 2) um elétrodo quadrado da tampa de 10 milímetros da platina, 3) um micromanipulador, e 4) um electroporator. -
Injeções focais de DNA
- Prepare uma mistura de DNA de vetores de expressão: pCAGGs-IRES-GFP (vetor de controle) + pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, em uma concentração de 1 μg/μL para cada vetor e adicionar solução verde rápida (estoque 25 mg/mL) em uma diluição 1/10.
- Encha uma micropipeta de vidro puxada (diâmetro interno de 0,5 mm e diâmetro externo de 1 mm) com 10 μL de mistura de DNA e injete pequenas quantidades (na faixa de 25-50 nL) na região selecionada (MGE/CGE) da fatia (Figura 1 e Figura 2).
-
Eletroporação aguda
Nota: O electroporation deve ser executado imediatamente depois da injeção focal do ADN.- Coloc o bloco pequeno do agarose no elétrodo da placa de Petri e prenda a coluna do agarose ao elétrodo da tampa móvel com a ajuda de um microspatula liso-terminado.
- Transfira a fatia com sua membrana de apoio para o bloco de agarose e coloque o eletrodo superior com a coluna de agarose na parte superior da região selecionada (MGE/CGE) da fatia.
Nota: as tensões de carregamento de 125 V (dois pulsos de 5 ms cada, intervalo 500 MS) renderá um Electroporation bem sucedido (Figura 3).
- Após o electroporation, coloc a fatia com sua membrana de apoio no prato e transfira o prato em uma incubadora da cultura do tecido do CO2 , em 37 ° c.
- Após 1 h, troque o meio de MEM para um meio básico apropriado para culturas neuronal preliminares (meio básico do Neuron; Tabela 1) e incubar as fatias durante a noite, por aproximadamente 18-24 h.
3. preparação de enxertos celulares
- Verifique a eficiência do Electroporation em todas as fatias. Selecione apenas as fatias onde um número aceitável de células fluorescentes é observado (Figura 3).
Nota: Electroporate aproximadamente 30 fatias/por o experimento a fim adquirir o número apropriado de pilhas para transplantar (veja abaixo). - Dissecar a região selecionada (MGE/CGE) de cada fatia e cortar o tecido em partes pequenas na solução fria do Krebs do gelo, um estéreo-microscópio fluorescente da dissecção.
- Entretanto, coloque um tubo de 1,5 ml com meio básico de neurônio de 900 μl em um banho de água a 37 ° c.
- Transfira as peças do tecido com um micropipeta P1000 para um tubo de 1,5 ml contendo 500 μL de meio L15/DNase preparados adicionando 100 μl de 1 mg/ml de estoque de DNase em meio DMEM/F12 em 900 μL de meio L15. Lave as partes do tecido tocando.
- Adicionar 100 μl de DNase (estoque 1 mg/ml em meio DMEM/F12) no meio básico do neurônio de 900 μl.
- Descarte o meio L15/DNase e ressuspender as partes do tecido em 200 μl neurônio Basic/DNase médio preparado na etapa 3,5.
- Definir um micropipetador P200 para 180 μL e dissociar mecanicamente as peças do tecido, introduzindo suavemente para cima e para baixo, 20-30 vezes, até que seja obtida uma suspensão suave e "cremosa".
- Adicionar 200 μL de neurônio básico/DNase médio (volume total final 400 μL) e ressuscitpend.
- Tomar uma alíquota de 4 μL de células, diluir adequadamente e montar em um haemocytometer.
- um microscópio de campo brilhante, verificar a eficiência da dissociação e contar o número de células.
Nota: Se a dissociação for bem-sucedida, as células únicas brilhantes (vivas) e não os agregados celulares serão observados. - Suspensão de célula centrífuga da etapa 3,8, em 1.000 rpm, em RT, por 5 min, e subsequentemente, retire o sobrenadante do tubo e adicione o meio L15/DNase apropriado (geralmente 5-7 μL) para que a concentração final de células será 8 x 105-1,2 x 106 células/μl.
Nota: Durante o Resuspension, é extremamente importante evitar bolhas de ar. - Coloque a alíquota da célula no gelo e tenha um meio adicional de L15/DNase para as injeções.
4. injeções intracranianas
Nota: Os seguintes procedimentos acontecem em uma sala de procedimento dentro do animal House Facility. Desde que as pilhas serão injetadas diretamente ao cérebro de filhotes de cachorro recém-nascidos sem expor o cérebro, as circunstâncias assépticas são mantidas esterilizando o espaço de funcionamento com solução de 70% EtOH e usando agulhas de vidro autoclavado. Os seguintes equipamentos são necessários para as injeções intracranianas: 1) uma dissecção de campo brilhante estéreo-microscópio, 2) um micro-injector, e 3) uma almofada de aquecimento para a recuperação do mouse.
- Prepare uma agulha de vidro puxando as agulhas de acordo com as recomendações do fabricante. As agulhas de vidro com um diâmetro exterior de 80 μm, um diâmetro interno de 40 μm, e um bisel de 30 ° são usadas neste protocolo.
Nota: Como mencionado acima, as agulhas devem ser autoclavadas antes de usar. - Encha manualmente a agulha com óleo biologicamente inerte utilizando uma agulha de 30 G, 2 polegadas e uma seringa.
- Montar e inserir a agulha na unidade injetora de acordo com as instruções do fabricante.
- Determine as configurações de injeção no volume máximo (69 nL) e uma taxa de lentidão relativa (23 nL/s).
- Esvazie a agulha até que o êmbolo esteja totalmente estendido.
-
Encha a agulha.
- Corte um pequeno pedaço de uma fita enxertia e colocá-lo uma dissecção de campo brilhante estéreo-microscópio. Com uma micropipeta P10, transfira 5 μL da amostra (alíquota da célula) para a fita, para que uma gota esférica seja formada.
- Coloque a ponta da agulha na amostra e encha a agulha (o êmbolo retraí e desenha a amostra com ele).
Nota: Uma vez que a amostra deve ser bastante viscosa, encha a agulha em pequenos degraus para que a amostra seja equilibrada, e a uma taxa lenta que impeça a formação de bolhas. A amostra deve ser lisa e homogênea dentro da agulha. Se a amostra é demasiado viscosa e não é possível encher a agulha, adicione tanto o meio L15/DNase como é exigido para obter a viscosidade correta. No entanto, isso vai mudar a concentração da amostra, e idealmente deve ser evitado.
- Anestesiam filhotes novos nascidos (dia pós-natal 0-2 [P0-P2]) no gelo por 2-5 min.
Nota: Certifique-se de que o filhote não está se movendo. - Coloc o filhote de cachorro anestesiados o estéreo-microscópio brilhante da dissecção do campo.
- Realize 3-4 injeções de 69 nL cada em cada hemisfério.
Nota: Os locais de injeção estão localizados aproximadamente 1 mm de lateral para a linha média, e entre 1 mm caudal a Bregma e 1 mm rostral para a linha interaural. A ponta da agulha deve ser colocada aproximadamente 1 mm de profundidade na superfície pial. Após cada injeção, a agulha é deixada no lugar por aproximadamente 30 s e retirada em períodos. - Imediatamente após as injeções, coloque o filhote em uma almofada de aquecimento com o aquecimento em sua configuração mais baixa (37 ° c). Quando o filhote se recupera transferi-lo para a gaiola com sua mãe.
Nota: Nunca deixe a mãe sem filhotes na gaiola. Todo o procedimento (de remover o filhote de seus littermates, até que ele é devolvido) deve durar menos de 10 min.
5. injeções de Clozapine-N-óxido
- Prepare o ligante de DREADD, solução de estoque de CNO diluindo 1 mg de CNO em 50 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) até que a solução seja translúcida. Top-até 10 mL com soro fisiológico para que a concentração final de CNO seja 0,1 mg/mL.
Nota: DMSO é tóxico. Evite usá-lo para uma concentração superior a 0,1%. Use como controle uma solução salina contendo a mesma concentração de DMSO que a solução contendo CNO. - Do dia pós-natal 14 e para 3 constitutivamente dias (P14-P16), em cada rato realize duas injeções intraperitoneal (I.P.) de CNO (concentração de CNO: 1 Magnésio/quilograma) ou 0, 5% DMSO no soro fisiológico, por o dia, 12 h distante.
- No último dia (P17), realize uma única injeção e Sacrifique camundongos por luxação cervical dentro de uma janela de tempo de 30 min-1 h.
Representative Results
Usando o procedimento apresentado aqui, nós testamos se a sobrevivência de interneurônios corticais durante estágios pós-natal adiantados é regulada pela atividade em uma maneira autônoma da pilha. Realizamos 3 experimentos de eletroporação de fatia cerebral (12-16 embriões [E 14,5 embriões] por experimento) com os vetores de expressão pCAGGs-IRES-GFP (Control) e pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, com uma concentração de 1 μg/μL para cada construto. Em nossos experimentos de eletroporação, apenas uma fração (aproximadamente 50%; Figura 3) do GFP+ neurônios HM3D (GQ) (RFP+) e, portanto, o GFP+RFP- população serviu como um controle interno para o efeito de ligantes de dreadd. Os interneurônios embrionário corticais transfected foram dissociados mecanicamente e a suspensão de pilha resultante (8 x 105 Cells/μL) enxertadas no córtice de P0-P1 ratos selvagens do tipo. Tínhamos realizado 6 injeções por cérebro. Em cada experimento, um mínimo de 6 filhotes novos nascidos foram injetados. A administração de CNO aumentou seletivamente a atividade das células RFP+ transfectadas, como demonstrado pela expressão da proteína cFos dependente da atividade (Figura 4). O tratamento com CNO de acordo com o protocolo descrito (administrar duas vezes por dia P14-P17) resultou em um aumento na proporção de GFP+ RFP+ em relação ao GFP+RFP- cells, em comparação com o veículo (0,5% DMSO em soro fisiológico) littermates administrados (Figura 5).
Figura 1: cortes telencefálicos representativos utilizados para experimentos agudos de eletroporação. (A-C) As fatias telencephalic obtiveram em três níveis rostro-caudal sequenciais distintos, manchados com 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). LGE: Eminência gangliónica lateral; MGE: Eminência gangliónica medial; CGE: Eminência ganglionic caudal. Barras de escala = 200 μm. Os asteriscos amarelos indicam o local do Electroporation em cada fatia. A linha branca marca a borda da Eminência gangliónica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. (A) as fatias do cérebro do rato são em com construções apropriadas, e (B) depois que 12 h precursores corticais modificados do interneurônios (CI) são isolados e (C) transplantados no pálio de filhotes de cachorro recém-nascidos do rato (P0 − P2). Para modificar a atividade dos CIs imaturos, os filhotes de P14 que haviam recebido transplantes celulares foram injetados com CNO ou veículo por quatro dias constitutivos de acordo com o protocolo apresentado. (A ') Fotografia da montagem aguda do Electroporation da fatia do cérebro do rato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Experimento de eletroporação de fatia aguda bem sucedida representativa. (A) seção coronal representativa de um cérebro do embrião de e 14.5 transfected no CGE com os plasmídeos de pcaggs-ires-GFP (GFP) e de pcaggs-hM3D (GQ)-ires-RFP (RFP) e cultivado por 12 h. A seção foi imunomanchada para GFP (A, B, C) e RFP (A, B, D). A área encaixotada no painel A é ampliada para mostrar a expressão de ambos os repórteres fluorescentes (B), GFP (C) e RFP somente (D). A linha branca marca a borda da Eminência gangliónica. B-D: mesma foto, diferentes canais ou combinação dos dois canais diferentes. Barras de escala = 200 μm (A), 100 μm (B-D). Este número foi modificado de Denaxa et al.14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: aumento autônomo de células na atividade de m3d (GQ)-expressando cis transplantados na administração de CNO. (A-D) As imagens confocal representativas de uma seção coronal de um rato P17 transplantaram em P1 com os precursores do CI transfected com pcaggs-ires-GFP (GFP) e pcaggs-hM3D (GQ)-ires-RFP (RFP) plasmídeos e tratado com o CNO. A seção foi imuno-manchada para GFP (a), RFP (B), e CFOs (C). (D) a imagem combinada de imunofluorescência a, B e C (Combo). Note-se que apenas os CIs coexpressando ambos os plasmídios (setas brancas em A-D) também são cFos+ em comparação com cis expressando apenas o plasmídeo Control-GFP (setas amarelas em a-d). (E) quantificação de cFos+RFP+ células encontradas no pálio de camundongos P17 transplantados em P1 (normalizado ao total de RFP+ população) e tratados com veículo ou CNO (N = 2). A-D: mesma foto, canais diferentes, ou combinação dos três canais diferentes. Barras de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Aumento autônomo de células na atividade dos CIS aumenta a sobrevida . (A-D) Imagens confocais representativas das fatias coronais do córtex somatossensorial de camundongos P17 transplantados em P0-P2 com precursores de CI transfectados com ambos pCAGGs-IRES-GFP (GFP) e pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmíticos e tratados com veículo (A-B) ou CNO (C-D). (E) quantificação de RFP+ células encontradas no prosencéfalo de camundongos P17 transplantados em P0-P2 (normalizado para o total da GFP+ população). RFP+(veículo) = 47% ± 3%, cno = 61% ± 3%, p = 0, 1, teste t de amostra pareada do aluno, n = 3 veículo e 3 CNO, um mínimo de 150 células contados por cérebro. A e B: mesma foto, canais diferentes. C e D: mesma foto, canais diferentes. Barras de escala = 50 μm. Este número foi modificado de Denaxa et al.14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: informações adicionais relativas aos meios de comunicação utilizados neste protocolo.
Discussion
Aqui nós descrevemos uma metodologia extensamente acessível para modificar genetically a atividade de precursores do CI para estudar o impacto da atividade intrínseca na maturação do CI, e/ou o efeito da atividade modulada CIs na montagem/função do cortical integrado Circuitos.
No passado, vários laboratórios, incluindo o nosso, tinham realizado em experimentos de eletroporação utero, a fim de modificar geneticamente os neurônios de projeção6. Entretanto, no utero o electroporation em Eminências ganglionic que incluem progenitores do CI é muito difícil, devido aos problemas elétricos do trajeto da condução. A fim resolver este problema, um número pequeno de laboratórios está realizando injeções guiadas do ultra-som seguidas pelo Electroporation, que é uma técnica de exigência que exija o equipamento caro. Este protocolo fornece uma alternativa a estas metodologias que é acessível à maioria da comunidade científica.
Um dos aspectos mais desafiadores deste protocolo é maximizar o número de células que sobrevivem no córtex hospedeiro para estágios maduros, quando a análise fenotípica é geralmente realizada (muito dependente do experimento, mas tipicamente mais velho que P17). Há três etapas chaves que o investigador deve prestar atenção: (1) a eficiência do Electroporation. Isto pode ser maximizado assegurando a pureza de Plasmids do ADN. Somente os plasmíos de DNA de alta qualidade (uma relação de A260/a280 de 1.9-2.0) devem ser usados para este procedimento. Nós obtemos tais preparações de alta qualidade do ADN empregando a purificação do ADN do cloreto do césio. Outro fator crucial é o promotor que impulsiona a expressão do gene de interesse. Descobrimos que o vetor pCAGGs, que consiste no promotor de frango b-actina, é extremamente poderoso e pode aumentar drasticamente a eficiência de eletroporação. (2) o número de embriões Doadores iniciais. É importante certificar-se de que um grande número (12-16) de embriões da mesma fase é electroporated. Esse número pode ser aumentado, se mais experimentadores estiverem realizando dissecções embrionárias e seccionando juntas, pois é importante que as fatias corticais embriônicas sejam obtidas, eletroporadas e transferidas para a incubadora o mais rápido possível. (3) é importante certificar-se de que um grande número de pilhas está injetada em cada filhote de cachorro para assegurar uma possibilidade elevada de sobrevivência transplantada da pilha até estágios maduros. Além disso, isso melhorará drasticamente a probabilidade de transplantes bem-sucedidos, uma vez que as preparações celulares de baixa densidade resultarão na mistura desigual das células com o meio, o que produzirá variabilidade significativa nos cérebros transplantados15 .
O protocolo aqui descrito foi adaptado para investigar o papel da atividade na regulação da sobrevida do CI de forma autônoma de células. A janela de tempo de P14-P17 para realizar as injeções de CNO foi escolhida especificamente de acordo com dados publicados, que mostram que o pico da morte celular dos progenitors transplantados do CI ocorre durante este período16. Portanto, este período de tempo ou a frequência de injeções de CNO podem não ser verdadeiras para outros tipos de células ou regiões cerebrais, e o investigador deve ajustar esses parâmetros de acordo com as finalidades experimentais específicas. Finalmente, a metodologia descrita aqui para as injeções intracranial dos CIS é somente praticável para filhotes P0-P5 (dependendo também do fundo da linha do rato). Em princípio, qualquer injeções sobre P5 exigirá desbaste ou remoção do crânio15.
Uma das principais vantagens deste protocolo é a capacidade de usar novas ferramentas geneticamente codificadas para visualizar ou manipular a atividade dos CIs durante diferentes estágios de diferenciação à medida que eles se integram em uma rede em desenvolvimento. Com o ritmo de descoberta de novos sensores de tensão e cálcio geneticamente codificados, bem como novas ferramentas quimiogenéticas e optogenéticas, este protocolo permite que os pesquisadores os usem dentro de semanas de lançamento em repositórios de plasmídeo, como o Addgene.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma concessão do acionador de partida de ERC (282047), um prêmio do investigador da confiança de Wellcome (095589/Z/11/Z), uma concessão do desejo do EC do FP7, e um prêmio do Instituto do Lister a JB. O trabalho no laboratório do vice-presidente é apoiado pelo BBSRC (BB/L022974/1), pelo Conselho de pesquisa médica do Reino Unido (MRC), e pelo Instituto Francis Crick (que recebe financiamento do MRC, pesquisa do câncer do Reino Unido e do Wellcome Trust). A pesquisa em laboratório M.D. foi possível através da concessão da Fundação Stavros Niarchos para o B.S.R.C. "Alexander Fleming", como parte da iniciativa da Fundação para apoiar a pesquisa grega.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium/Supplements | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
| FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
| 100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| Equipment | |||
| Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
| Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
| Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
| Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
| Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
| Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
| Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Other Material | |||
| Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
| Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
| Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
| Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
References
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- Glausier, J. R., Lewis, D. A. GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go. Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).
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