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Genetics

ध्वनिक नैनोडिजिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए उच्च-थ्रूपुट डीएनए प्लास्मिड मल्टीप्लेक्सिंग और ट्रांसफेक्शन

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

इस प्रोटोकॉल ध्वनिक छोटी बूंद इंजेक्शन प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक 384 अच्छी तरह से थाली में स्तनधारी कोशिकाओं के उच्च-थ्रूपुट प्लाज्मिड transfection का वर्णन करता है। समय लेने वाली, त्रुटि-प्रवण डीएनए वितरण और मल्टीप्लेक्सिंग, लेकिन यह भी ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक वितरण, सॉफ्टवेयर संचालित कर रहे हैं और एक नैनोडिस्पेंसर डिवाइस द्वारा प्रदर्शन किया। कोशिकाओं तो इन prefilled कुओं में बीज रहे हैं.

Abstract

सेल transfection, कई जैविक अध्ययन के लिए अपरिहार्य, एक सटीक और सफल उपलब्धि के लिए कई मापदंडों को नियंत्रित करने की आवश्यकता है. अक्सर कम थ्रूपुट पर प्रदर्शन किया जाता है, यह अधिक समय लेने वाली और त्रुटि-प्रवण होता है, और भी अधिक जब कई प्लाज्मिड्स का संकेत होता है। हम ध्वनिक छोटी बूंद इंजेक्शन (एडीई) प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक 384 अच्छी तरह से प्लेट लेआउट में सेल transfection प्रदर्शन करने के लिए एक आसान, तेज, और सटीक विधि विकसित की है। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया नैनोडिस्पेंसर डिवाइस इस तकनीक पर आधारित है और एक स्रोत अच्छी तरह से प्लेट से एक गंतव्य के लिए उच्च गति पर सटीक नैनोvolume वितरण की अनुमति देता है। यह एक पूर्व डिजाइन स्प्रेडशीट के अनुसार और मल्टीप्लेक्स डीएनए और transfection अभिकर्मक वितरित कर सकते हैं. यहाँ हम एडीई आधारित उच्च-थ्रूपुट प्लाज्मिड ट्रांसफेक्शन करने के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो 90% तक की दक्षता तक पहुंचना संभव बनाता है और सह-परिवर्तन प्रयोगों में लगभग 100% सह-परिवर्तन करता है। हम एक उपयोगकर्ता के अनुकूल स्प्रेडशीट आधारित मैक्रो का प्रस्ताव द्वारा प्रारंभिक काम का विस्तार, अप करने के लिए एक पुस्तकालय से चार plasmids / मैक्रो स्रोत प्लेट (ओं) के आवश्यक टेम्पलेट (ओं) डिजाइन और नैनोडिस्पेंसर और टैबलेट आधारित आवेदन के लिए तैयार करने के लिए उपयोग फ़ाइलों को उत्पन्न करता है। चार कदम transfection प्रोटोकॉल मैं शामिल है) एक शास्त्रीय तरल हैंडलर के साथ एक diluent वितरण, ii) प्लाज्मिड वितरण और मल्टीप्लेक्सिंग, iii) नैनोडिस्पेंसर द्वारा एक transfection अभिकर्मक वितरण, और iv) सेल prefilled कुओं पर चढ़ाना. एई प्लाज्मिड मल्टीप्लेक्सिंग और ट्रांसफेक्शन का वर्णित सॉफ्टवेयर आधारित नियंत्रण क्षेत्र में गैर-विशेषज्ञों को भी एक तेज और सुरक्षित तरीके से एक विश्वसनीय सेल ट्रांसफेक्शन करने की अनुमति देता है। इस विधि एक दिया सेल प्रकार के लिए इष्टतम सेटिंग्स की तेजी से पहचान सक्षम बनाता है और उच्च पैमाने पर और मैनुअल दृष्टिकोण को स्थानांतरित किया जा सकता है. प्रोटोकॉल ऐसे मानव ORFeome प्रोटीन के रूप में अनुप्रयोगों को आसान बनाता है (एक जीनोम में खुला पढ़ने फ्रेम [ORFs] का सेट) अभिव्यक्ति या CRISPR-Cas9 आधारित जीन समारोह सत्यापन, nonpooled स्क्रीनिंग रणनीतियों में.

Introduction

यहाँ प्रस्तुत विधि विस्तार से वर्णन करता है कि कैसे डीएनए प्लाज्मिड मल्टीप्लेक्सिंग और उच्च थ्रूपुट में स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन करने के लिए एक ध्वनिक-आधारित तरल नैनोडिस्पेंसर का उपयोग करते हुए 384-वेल प्लेट में, यहां तक कि क्षेत्र में गैर विशेषज्ञों के लिए। यह हाल ही में प्रकाशित विधि1 के रूप में ज्यादा के रूप में प्रदर्शन की अनुमति देता है 384 स्वतंत्र प्लाज्मिड डीएनए multiplexing और एक प्रयोग में transfection शर्तों, कम से कम 1 ज. एकल या cotransfection प्रयोगों सफल रहे थे, एक के पास तक पहुँचने 100% transfected कोशिकाओं की आबादी के भीतर cotransfection. इस प्रोटोकॉल transfection आसान बनाता है क्योंकि थकाऊ, समय लेने वाली, और त्रुटि प्रवण कदम के सबसे अब सॉफ्टवेयर संचालित कर रहे हैं (एक सामान्य सिंहावलोकन के लिए चित्र 1 देखें). समग्र प्रक्रिया के दौरान मानव त्रुटियों से बचने और क्षेत्र में गैर-विशेषज्ञों के लिए भी सफल ट्रांसफेक्शन को बढ़ावा देने के दौरान उपयोग में आसानी को बढ़ाने के लिए समर्पित उपकरण विकसित करने के लिए और भी प्रयास किए गए हैं। वर्णित प्रोटोकॉल में एक "उपयोगकर्ता-अनुकूल" मैक्रो स्प्रेडशीट शामिल है जिसे हमने प्रत्येक कुएं में चार प्लाज्मिड ्स्स तक के मल्टीप्लेक्सिंग संभावनाओं के साथ 384 स्वतंत्र ट्रांसफेक्शन स्थितियों का प्रबंधन करने के लिए विकसित किया है। मैक्रो स्वचालित रूप से स्टॉक समाधान शुरू करने से अपेक्षित डीएनए प्लाज्मिड वॉल्यूम लोड करने के लिए स्रोत प्लेट (ओं) के टेम्पलेट्स उत्पन्न करता है और इनपुट किए गए प्रयोगात्मक डिजाइन पर नैनोडिस्पेंसर सॉफ्टवेयर को चलाने के लिए आवश्यक फ़ाइलें। एक 384-वेल स्रोत प्लेट में डीएनए के मैनुअल वितरण थकाऊ और त्रुटि-प्रवण है के रूप में, हम भी एक समर्पित गोली आधारित आवेदन विकसित करने के लिए उपयोगकर्ता मार्गदर्शन करते हुए टेम्पलेट के अनुसार डीएनए समाधान वितरण.

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक कार्यप्रवाह. इष्टतम स्वचालित उच्च-थ्रूपुट रिवर्स ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल (प्रयोगात्मक डिजाइन से कस्टम जैविक परख तक) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। मैनुअल कदम हाथ प्रतीक द्वारा इंगित कर रहे हैं और प्रत्येक चरण के लिए अनुमानित समय एक लाल बॉक्स में लिखा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कई सेल आधारित प्रयोगों प्लाज्मिड डीएनए transfection के साथ शुरू, और यहां तक कि अगर कई समर्पित अभिकर्मकों गया है और अभी भी transfection दक्षता बढ़ाने के लिए विकसितकिया जा रहा है और / , 4. डीएनए प्लाज्मिड सेल ट्रांसफेक्शन में उच्च दक्षता तक पहुंचने के लिए कई कदम शामिल हैं, जैसे प्रारंभिक जटिल तेज, एंडोसोमल पलायन, और कोशिकाद्रव्यी परिवहन नाभिक5,6. कैल्शियम वर्षा या समर्पित उपकरणों का उपयोग कर microporation या माइक्रोइंजेक्शन के रूप में शारीरिक तकनीकों के अलावा7, आधुनिक रासायनिक तरीकों डीएनए सेल वितरण को बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि सेल cytoxicity8को कमकरने , 9. लिपिड या cationic पॉलिमर का उपयोग liposome की तरह परिसरों बनाने और, हाल ही में, nonliposomal बहुलक रसायन प्रणालियों transfection आसान और अधिक कुशल10बना दिया है. इन घटनाओं के बावजूद, सेल transfection अभी भी इन भौतिक या रासायनिक transfection प्रोटोकॉल के अधिकांश के रूप में सही प्रदर्शन किया जा करने के लिए विशिष्ट कौशल की आवश्यकता है मैन्युअल रूप से प्रत्येक डीएनए transfection प्रतिक्रिया हालत तैयार करने के लिए वैज्ञानिकों की आवश्यकता है, इस प्रकार थ्रूपुट को बाधित करना. इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, रिवर्स ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल को रासायनिक ट्रांसफेक्शन अभिकर्मकों11,12,13का उपयोग करके विकसित किया गया है, जिससे उपयोगकर्ता को कई प्लाज्मिड को तेज़ तरीके से परीक्षण करने या संयोजित करने में सक्षम बनाया जा सकता है। इन प्रोटोकॉल में, ट्रांसफेक्शन अभिकर्मकों के साथ न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्स परिसरों पर कोशिकाओं को बोने से पहले बनते हैं। हालांकि, इन रिवर्स प्रोटोकॉल अभी भी डीएनए समाधान के मैनुअल हैंडलिंग द्वारा और स्वतंत्र स्थितियों में से प्रत्येक के संयोजन से सीमित हैं. हालांकि यह उन्हें एक 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में प्रदर्शन करने के लिए संभव है, डीएनए की तैयारी और dispenses थकाऊ हो जाएगा, और वहाँ की संभावना गलतियों हो जाएगा. जब कई डीएनए प्लाज्मिड की विभिन्न मात्रा ओंटीया जाता है और एक दूसरे के साथ multiplexed होते हैं, तो सेल ट्रांसफेक्शन को प्राप्त करना और अधिक समय लेने वाली और अधिक समय लेने वाली और मानव त्रुटियों को प्राप्त करना और मानवीय त्रुटियां काफी अपरिहार्य हो जाती हैं। रिवर्स ट्रांसफेक्शन दृष्टिकोण में 384-वेल प्लेट प्रारूप तक स्केलिंग, कुछ बहुसंकेतित डीएनए ट्रांसफेक्शन स्थितियों के बावजूद, निम्नलिखित कारणों के कारण एक असंभव चुनौती बन जाती है। i) डीएनए मात्रा, transfection अभिकर्मक, या प्रतिक्रिया मिश्रण मात्रा का प्रबंधन करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए 1 डिग्री सेल्सियस से कम कर रहे हैं. ii) 384 स्वतंत्र स्थितियों के लिए प्लाज्मिड का बहुसंकेतन अत्यंत जटिल हो जाता है। प्रत्येक 384 कुओं में वितरण भी iii) अत्यधिक समय लेने वाली और iv) त्रुटि-प्रवण है। वास्तव में, उम्मीद कुओं में सही समाधान वितरण का प्रबंधन करना मुश्किल है क्योंकि पहले से ही कम मात्रा में वितरित खाली और पहले से ही भरे कुओं के बीच दृश्य निगरानी की अनुमति नहीं है. v) अंत में, आवश्यक वितरण चरणों को करने के लिए आवश्यक समय के कारण कोशिकाओं को जोड़ने से पहले वाष्पीकरण द्वारा मिश्रण को सुखाने का उच्च जोखिम होता है। संक्षेप में, उच्च-थ्रूपुट डीएनए प्लाज्मिड ट्रांसफेक्शन परख स्थापित करने के लिए सीमित कारक परख का लघुकरण प्रतीत होता है, जिसका अर्थ है कि कम मात्रा वाले मल्टीप्लेक्सिंग और प्रबंधन जिसे मैन्युअल रूप से अब और नहीं संभाला जा सकता है, लेकिन यह भी शायद ही एक में प्राप्त किया जा सकता है शास्त्रीय peristatic तरल संचालकों द्वारा विश्वसनीय तरीका है.

कठिनाई का एक सबूत के रूप में इस तरह के assays automatize और उच्च-थ्रूपुट लाभ, केवल कुछ प्रयास transfection को स्वचालित करने के लिए अब तक प्रकाशित किया गया है: एक 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप एक वाणिज्यिक तरल हैंडलिंग डिवाइस और कैल्शियम फॉस्फेट वर्षा14 का उपयोग कर और, हाल ही में, एक lipoplex अभिकर्मक, और एक microfluidic चिप सक्षम करने के 280 स्वतंत्र transfections15 लेकिन इस क्षेत्र में विशेष कौशल की आवश्यकता होती है. एक अन्य विधि, acoustophoresis, तरल levitation की अनुमति और तरल पदार्थ हेरफेर और मिश्रण करने के लिए अग्रणी, 24 में डीएनए transfection प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूपों16. हालांकि संभव है, इस दृष्टिकोण एक बहुत कम थ्रूपुट से ग्रस्त है क्योंकि डीएनए ट्रांसफेक्शन मिश्रण के साथ कोशिकाओं के मिश्रण को बोने से पहले हर एक बिंदु के लिए 60 एस ऊष्मायन की आवश्यकता होती है। यह एक पूर्ण 96 अच्छी तरह से थाली के लिए कम से कम 96 मिनट की अवधि का तात्पर्य है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल दूर समग्र जीवविज्ञानियों 'दर्शकों के लिए अनुकूल होने से दूर है के रूप में यह काम एक घर में डिजाइन और निर्मित उपकरण है जो वर्तमान में बाजार पर उपलब्ध नहीं है के साथ किया गया था. इसके विपरीत, पिछले कुछ वर्षों में, सॉफ्टवेयर संचालित ध्वनिक आधारित वितरण प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए एक आसान नैनोवॉल्यूम मशीन उपकरणों के साथ उभरा है। केंद्रित ध्वनिक ऊर्जा का उपयोग करके, इन उपकरणों के एक गंतव्य एक17करने के लिए एक स्रोत प्लेट से 500 एनएल करने के लिए 2.5 एनएल से छोटे तरल मात्रा के कसकर नियंत्रित निष्कासन की अनुमति देते हैं। इस तकनीक, ध्वनिक छोटी बूंद निष्कासन (एडीई) कहा जाता है, कई फायदे हैं: यह पूरी तरह से स्वचालित है, contactless, tipless, सटीक, सटीक, और अत्यधिक reproduible, और यह एक उच्च थ्रूपुट18है. सबसे पहले डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) समाधान देने के लिए समर्पित, सेटिंग्स जलीय बफ़र्स19वितरित करने के लिए बढ़ाया गया है। ध्वनिक नैनोडिस्पेंसर, तो, रिवर्स सेल ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त लगते हैं और उपर्युक्त मैनुअल सीमाओं में से अधिकांश को दरकिनार कर सकते हैं। के रूप में कोई प्लाज्मिड transfection प्रयास पहले इस तकनीक का उपयोग कर वर्णित किया गया था, हम हाल ही में रिवर्स सेल transfection प्रदर्शन करने के लिए एक ध्वनिक आधारित वितरण प्रणाली की उपयुक्तता का मूल्यांकन किया।

नैनोडिस्पेंसर थ्रूपुट और उपयोग में आसानी का लाभ उठाते हुए, हमने Hela कोशिकाओं के लिए एक रिवर्स ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल को कई पैरामीटरों का क्रॉस-टेस्टिंग करके अनुकूलित किया है जो 384-वेल पर डीएनए ट्रांसफेक्शन को प्रभावित कर सकते हैं, एकल प्लेट, अर्थात्, कुल डीएनए राशि और स्रोत डीएनए शुरू एकाग्रता, diluent मात्रा, transfection अभिकर्मक, और प्रसार कोशिकाओं की संख्या. विकसित प्रोटोकॉल सेल transfection के ऊपर वर्णित मैनुअल सीमाओं को दरकिनार और अन्य स्वचालित transfection प्रयासों पर कई लाभ प्रस्तुत करता है. सबसे पहले, यह miniaturized है, इस प्रकार डीएनए प्लाज्मिड तैयारी और transfection अभिकर्मक को बचाने के द्वारा लागत प्रभावी transfection अभिकर्मक के लिए अनुमति देता है. दूसरे, यह बहुत अधिक उच्च throughput और मैनुअल प्रोटोकॉल की तुलना में reproducible है (यहां तक कि शुरुआती के लिए), एक पूरे 384 अच्छी तरह से थाली के transfection के रूप में कम से कम 1 एच में प्राप्त किया जा सकता है. अंत में, यह सॉफ्टवेयर संचालित है, वितरित डीएनए राशि के नियंत्रण और कई प्लाज्मिड के multixing की अनुमति. दरअसल, नैनोडिस्पेंसर सॉफ्टवेयर(सामग्री कीतालिका) के लिए धन्यवाद, उपयोगकर्ता एक निर्धारित स्रोत अच्छी तरह से एक गंतव्य के लिए प्लेट से वितरित किया जा करने के लिए मात्रा को नियंत्रित करने के लिए एक अध्ययन योजना विस्तृत कर सकते हैं।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मुख्य रूप से जो एक नैनोडिस्पेंसर के लिए उपयोग किया है और उच्च थ्रूपुट पर transfection प्रयोगों की स्थापना करना चाहते हैं के लिए करना है, लेकिन यह भी जो तेजी से एक दिया सेल प्रकार के लिए अपने transfection मापदंडों का अनुकूलन करना चाहते हैं के लिए उच्च थ्रूपुट पर कई पैरामीटर का क्रॉस-परीक्षण करने के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करना. वास्तव में, हमने दिखाया है कि इस नैनोस्केल प्रोटोकॉल के साथ पहचाने गए अनुकूलित पैरामीटरों को बड़े पैमाने पर और मैन्युअल ट्रांसफेलेशन प्रयोगों में स्थानांतरित किया जा सकता है। अंत में, के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल transfection अभिकर्मक निर्माता के अनुसार डीएनए या siRNA transfection की अनुमति देता है, प्रोटोकॉल भी जीन overexpression या knockdown के लिए सरणी दृष्टिकोण प्रदर्शन करने पर लक्ष्य उन लोगों के लिए ब्याज की है. गंतव्य प्लेटें डीएनए के साथ prefilled अप करने के लिए संरक्षित किया जा सकता है 7 प्रभावोत्पादकता के नुकसान के बिना एक transfection परख में उपयोग करने से पहले, जो आवेदन के इस प्रकार के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का एक और लाभ है.

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Protocol

1. अग्रिम तैयारी

  1. peristaltic तरल हैंडलर कार्यक्रमों की तैयारी
    नोट: प्रोटोकॉल के diluent और सेल वितरण चरणों के लिए, एक समर्पित कार्यक्रम तैयार किया जाना चाहिए, खाते में इस्तेमाल किया थाली और कदम आशय के लिए वितरण सिर की ऊंचाई ले.
    1. 1 $L diluent वितरण कदम के लिए, एक 1 $L कैसेट माउंट और सेटिंग्स के साथ एक कार्यक्रम तैयार के रूप में चरण 1.1.1.1 और 1.1.1.2 में वर्णित है.
      1. कोई जैविक सामग्री क्षति इस चरण में अपेक्षित है के रूप में सबसे अच्छा प्रवाह के लिए उच्च करने के लिए प्रवाह दर पैरामीटर समायोजित करें। वितरण के दौरान कुओं के तल को छूने के लिए 1 डिग्री सेल्सियस ड्रॉप को अनुमति देने के लिए 9ण्6 मिमी (सेल कल्चर प्लेट के अनुसार,उपयोग की जाने वाली कोशिका संस्कृति प्लेट के अनुसार) को समायोजित करें ताकि 1 डिग्री सेल्सियस ड्रॉप को वितरण के दौरान कुओं के नीचे को छूने की अनुमति दी जा सके।
        नोट: यह चरण ड्रॉप करने के लिए एक पर्याप्त मात्रा तक पहुँचने तक वितरण सिर पर बूंदों की अवधारण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
      2. प्रत्येक पंक्ति के वितरण के बाद प्लेट स्पष्ट ऊंचाई को 14.4 मिमी तक समायोजित करें ताकि वितरण सिर को प्लेट के ऊपर मुक्त विस्थापन की अनुमति दी जा सके। नेत्रहीन peristaltic तरल हैंडलर सिर ऊंचाई की उचित सेटिंग्स को नियंत्रित: सुनिश्चित करें कि कोई बूँदें वितरण और सत्यापित करें कि सिर प्रत्येक पंक्ति वितरण के बाद सिर के विस्थापन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त उच्च है, जबकि वितरण युक्तियाँ पर बनाए रखा जाता है.
        नोट: ड्रॉप प्रतिधारण से बचना एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है क्योंकि यह वितरण की मात्रा की सटीकता को ख़राब कर देगा।
    2. 40 $L सेल निलंबन के वितरण के लिए, एक 10 $L कैसेट माउंट और सेटिंग्स के साथ एक कार्यक्रम तैयार के रूप में चरण 1.1.2.1.1.1.2.2 में वर्णित है.
      1. एक कम गति के साथ कोशिकाओं को वितरित करने के लिए प्रवाह दर पैरामीटर समायोजित कतरनी तनाव और कुओं के तल पर उच्च प्रभाव से कोशिकाओं को संभावित नुकसान को बढ़ावा देने से बचने के लिए. वितरण की ऊंचाई को 11.43 मिमी (सेल कल्चर प्लेट के अनुसार उपयोग किया गया, पूरक चित्र ा१)को समायोजित करें, जो वितरण प्रक्रिया के दौरान कुओं के नीचे पर कोशिका प्रभाव को कम करने के लिए पर्याप्त उच्च है लेकिन पर्याप्त कम है जिससे बूंदों की अवधारण से बचा जा सके सिर वितरण. प्रत्येक पंक्ति को वितरित करने के बाद प्लेट के ऊपर वितरण सिर के मुक्त विस्थापन की अनुमति देने के लिए 16 मिमी के लिए प्लेट स्पष्ट ऊंचाई समायोजित करें।
      2. नेत्रहीन peristaltic तरल हैंडलर सिर ऊंचाई की उचित सेटिंग्स को नियंत्रित: सुनिश्चित करें कि कोई बूँदें वितरण और सत्यापित करें कि सिर प्रत्येक पंक्ति वितरण के बाद सिर के विस्थापन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त उच्च है, जबकि वितरण युक्तियाँ पर बनाए रखा जाता है.
        नोट: ड्रॉप प्रतिधारण से बचना एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में यह एक अविश्वसनीय सेल संख्या वितरण करने के लिए नेतृत्व करेंगे है.
  2. डीएनए प्लाज्मिड तैयारी (क्लासिक मिनिप्रेप निष्कर्षण प्रोटोकॉल)
    1. LB मध्यम में एक परिवर्तित DH5 बैक्टीरिया तनाव हो जाना 125 ग्राम /एमएल एम्पीसिलिन चयन एंटीबायोटिक (सामग्री की तालिका) रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर और कोमल आंदोलन के तहत (200 आरपीएम ) एक कक्षीय शेकर पर ( सामग्री कीतालिका) के साथ पूरक .
    2. संस्कृति की फसल 2 एमएल, 6000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा कोशिकाओं गोली, और supernatant त्यागें.
    3. RNase ए ( सामग्री की तालिका ) युक्त resuspension बफर के 250 $Lकेसाथ सेल गोली को पुन: निलंबित. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 250 जेडएल lysis बफर और इनक्यूबेट जोड़ें।
    4. तटस्थ बफर ( सामग्री कीतालिका) और vortexting शीघ्र ही के 300 डिग्री सेल्सियस जोड़कर lysis प्रतिक्रिया बंद करो. 11,000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए ट्यूब ों का केंद्रण ।
    5. 2 एमएल संग्रह ट्यूब में एक नया प्लाज़्मिड मिनीकॉलम (सामग्री की तालिका) रखें और कॉलम में सुपरनेंट को 1 11,000 x छपर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगिंग द्वारा रद्द कर दें .
    6. प्रवाह के माध्यम से छोड़ें और संग्रह ट्यूब में minicolumn वापस जगह है.
    7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्लासमिड मिनीकॉलम को 500 डिग्री सेल्सियस वैकल्पिक वॉशिंग बफर (सामग्री की तालिका) और 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए 1 1,000 x ग्रामके साथ धोएं।
    8. प्रवाह के माध्यम से छोड़ें और संग्रह ट्यूब में वापस प्लाज्मिड minicolumn जगह है.
    9. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, धोने के बफर (सामग्री की तालिका) के 700 $L जोड़ें , 11,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए इथेनॉल और अपकेंद्रित्र के साथ पूरक।
    10. सिलिका झिल्ली को सुखाने के लिए प्रवाह-थ्रू और अपकेंद्रण को छोड़ दें प्लाज्मिड मिनीकॉलम और इसके संग्रह ट्यूब 1x अधिक 2 मिनट के लिए 11,000 x ग्राम पर।
    11. सूखे प्लाज्मिड मिनीकॉलम को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में रखें और 60 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म्ड 30 डिग्री सेल्सियस आसुत जल डालें, इसे कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर, इसे 11,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    12. प्लाज्मिड मिनीकॉलम को छोड़ दें और शुद्ध डीएनए प्लाज्मिड युक्त एल्यूएट रखें।
    13. एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर eluted डीएनए के डीएनए एकाग्रता को मापने (सामग्री की तालिका) .
      1. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर चालू करें और डीएनए माप सेटिंग्स का चयन करें।
      2. एक खाली अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए माप आसन पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और पिपेट 1 $L पानी के नमूना हाथ उठाएँ।
      3. नमूना आर्म कम करें, रिक्त माप प्रारंभ करें, और पूरा होने की प्रतीक्षा करें.
      4. नमूना हाथ उठाएँ और ऊपरी और निचले आसनों से नमूना पोंछ.
      5. इसे मापने के लिए निचले कुरसी पर डीएनए समाधान के 1 डिग्री एल।
      6. नमूना हाथ कम, डीएनए एकाग्रता माप शुरू, और पूरा करने के लिए प्रतीक्षा करें.
      7. नमूना हाथ उठाएँ और ऊपरी और निचले आसनों से नमूना पोंछ.
      8. आगे डीएनए एकाग्रता माप के लिए, चरणों को दोहराएँ 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. माप समाप्त हो जाने के बाद, उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए समाधानों को संग्रहीत करें।

2. प्रायोगिक डिजाइन और चयनकों की पीढ़ी एडीई आधारित dispenses ड्राइव करने के लिए

नोट: एक समर्पित "उपयोगकर्ता के अनुकूल" स्प्रेडशीट मैक्रो डीएनए मात्रा का प्रबंधन और एक 384 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में चार प्लाज्मिड के लिए मिश्रण करने के लिए विकसित किया गया था. दर्ज प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, इस मैक्रो नैनोडिस्पेंसर द्वारा एडीई आधारित डीएनए transfection प्रोटोकॉल ड्राइव करने के लिए आवश्यक फ़ाइलें उत्पन्न करता है। इन फ़ाइलों को जनरेट करने के लिए, कई फ़ील्ड को चित्र पत्रक में भरना होगा जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है।

Figure 2
चित्र 2 : स्प्रेडशीट मैक्रो का उपयोग कर ADE वितरण ड्राइव करने के लिए चयनलिस्टों का उत्पादन. कई पैरामीटरों को भरना होगा, अर्थात् (1) ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक (टीआर) और स्रोत प्लेट में उपयोग किए जाने वाले न्यूनतम/अधिकतम मात्रा, (2) स्रोत प्लेट में वितरित किए जाने वाले प्रारंभिक प्लाज्मिड सांद्रता, और (3) 384 कुओं में से प्रत्येक में अपेक्षित प्लाज्मिड मात्रा और मल्टीप्लेक्सिंग सहित पूरे प्लेट डिजाइन,। (4) Picklists सक्रियण उत्पन्न विभिन्न क्षेत्रों सत्यापित किया जा करने के लिए अनुमति देता है और, एक बार ठीक से भरा, डीएनए और टी.आर. वितरण के लिए picklists और आवश्यक स्रोत प्लेट टेम्पलेट स्वचालित रूप से उत्पन्न कर रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. गुलाबी फ़ील्ड में नैनोडिस्पेंसर प्रोटोकॉल पैरामीटर दर्ज करें. ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक (टीआर) मिश्रण मान को 500 एनएल पर सेट करें। स्रोत प्लेट कुओं में न्यूनतम आयतन मान को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। स्रोत प्लेट कुओं में अधिकतम आयतन को 11ण्25 प्र.
    नोट: यहाँ इस्तेमाल किया नैनोडिस्पेंसर केवल एडीई के एक रन में 500 nL की एक अधिकतम स्थानांतरित कर सकते हैं। इन गुलाबी क्षेत्रों की सिफारिश की मान के साथ पहले से भरे हैं, लेकिन उपयोगकर्ता की जरूरत के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
  2. अंतर्निहित डीएनए के अनुरूप नीले क्षेत्रों में सांद्रता शुरू करने वाले 100 एनजी/जेडएल डीएनए दर्ज करें।
    नोट: यह मान इष्टतम एकाग्रता पहले परिभाषित है, लेकिन कर सकते हैं, हालांकि, विभिन्न उपयोगकर्ता की जरूरत के लिए संशोधित किया.
  3. ग्रे/हरी क्षेत्रों में वांछित डीएनए राशि दर्ज करें। मात्रा और प्लाज्मिड नाम 384 कुओं के लिए दर्ज करें, एक ही वर्तनी सुनिश्चित करने अगर एक ही प्लाज्मिड कई कुओं में प्रयोग किया जाता है.
  4. स्रोत प्लेट डिजाइन, picklists फ़ाइलें, और pipeting गाइड फ़ाइल उत्पन्न करें। मैक्रो डीएनए-Picklist.csv, T.R.-Picklist.csv और 384-Wells-Pipeting-Guide.csv फ़ाइलों को इसी शीट पर एकत्र डेटा से उत्पन्न करने के लिए अनुमति देने के लिए पिकलिस्ट्स उत्पन्न करें पर क्लिक करें। यदि अनुरोध किया गया है, तो नारंगी-भरे कक्ष मानों को ठीक करें क्योंकि यह उन त्रुटियों या वॉल्यूम को इंगित करता है जिन्हें नैनोडिस्पेंसर द्वारा हैंडल नहीं किया जा सकता है.
  5. स्रोत प्लेट पत्रक से टेम्पलेट (ओं) मुद्रित करें. प्लासमिड नाम और कुओं में भरने के लिए न्यूनतम मात्रा में संकेत दिया जाता है। इसी तरह, transfection अभिकर्मक मिश्रण संस्करणों है कि अगले निम्नलिखित कुओं में भरा होगा टी.आर. के रूप में संकेत दिया है और हरे रंग में प्रकाश डाला.

3. डीएनए स्रोत प्लेट तैयारी 384-वेल पाइपिंग गाइड आवेदन का उपयोग कर

  1. आसुत जल का उपयोग करके भंडारित डीएनए प्लाज़्मिड को 1ण्2ण्14 से 100 एनजी/एल तक दूर किया जाता है।
  2. प्लेट आयाम के लिए 384-वेल ग्रिड कैलिब्रेट करें: एक गोली पर 384-वेल पाइपिंग गाइड अनुप्रयोग खोलें (चित्र 3)। निचले स्क्रीन पर ग्रिड पर स्रोत प्लेट रखें, और ऊपरी बाएँ अंशांकन मेनू में, क्लिक करें + या - (या लाल कर्सर का उपयोग करें) को बढ़ाने या ग्रिड और कुओं के आकार को कम करने के क्रम में थाली के चार कोने कुओं को समायोजित करने के लिए .

Figure 3
चित्र 3 : 384-वेल पाइपिंग गाइड आवेदन का उपयोग करें। (1) प्लेट आकार के लिए 384-वेल ग्रिड के अंशांकन; (2) ) ) एक सार्वभौमिक 3 डी मुद्रित प्लेट एडाप्टर के माउंट गोली के लिए दो तरफा टेप का उपयोग कर; (3) एडाप्टर पर प्लेट का प्लेसमेंट; (4) ग्रिड का विस्थापन इसे माउंटेड प्लेट में केंद्रित करने के लिए। (5) अंशांकन कदम का ताला. (6) 384 कुओं पाइपिंग guide.csv फ़ाइल का उद्घाटन. (7) फ़ाइल सूची को देखते हुए, आवेदन अपेक्षित स्रोत प्लेट नाम, अभिकर्मक (डीएनए या transfection अभिकर्मक), एकाग्रता, और मात्रा लक्ष्य कुओं, जो एक के बाद एक प्रकाशित किया जाएगा में वितरित करने के लिए संकेत देगा। (8) बाएँ और दाएँ तीर बटन उपयोगकर्ता आसानी से स्प्रेडशीट मैक्रो स्रोत प्लेट टेम्पलेट (एस) के अनुसार अभिकर्मकों वितरित करने के लिए पाइपिंग गाइड का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. डबल पक्षीय टेप का उपयोग करना, वितरण करते समय स्रोत प्लेट आंदोलनों से बचने के लिए स्क्रीन पर 3 डी मुद्रित प्लेट एडाप्टर माउंट. यदि आवश्यक हो, तो स्क्रीन पर ग्रिड को प्लेट स्थिति में समायोजित करने के लिए रोटेशन तीर और ऊपर/ दाएँ/ बाएँ बटनों का उपयोग करके कैलिब्रेट किए गए ग्रिड को ले जाएँ. एक बार ग्रिड और अच्छी तरह से आकार ठीक से calibrated और स्थित हैं, बंद अंशांकन बॉक्स टिक.
  2. फाइल पर क्लिक करें और 384 कुओं पाइपिंग guide.csv फ़ाइल खोलें. सफेद में संकेत दिया सांद्रता पर संकेत प्लाज्मिड के संकेत मात्रा को मैन्युअल रूप से वितरित करने के लिए स्क्रीन निर्देशों का पालन करें अच्छी तरह से अपेक्षित प्लेट के उचित लक्ष्य गंतव्य के लिए इसी पर प्रकाश डाला। का प्रयोग करें - या + तीर वापस जाने के लिए या डीएनए वितरण प्रक्रिया में आगे. लोड करने के लिए पहली Transfection अभिकर्मक समाधान तक पहुँचने जब वितरण बंद करो.
  3. एक बार डीएनए वितरण समाप्त हो रहे हैं, एडाप्टर से स्रोत प्लेट को हटा दें. यदि कई स्रोत प्लेटों को भरा जाना है, तो एडाप्टर पर एक नई स्रोत प्लेट रखें और वितरण निर्देशों का पालन करें। एक बार डीएनए वितरण समाप्त हो गया है, उचित तरल leveling सुनिश्चित करने के लिए और ADE आधारित स्थानान्तरण में अशुद्धि के लिए अग्रणी बुलबुले को दूर करने के लिए डीएनए से भरे स्रोत प्लेट (एस) (2 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर) centrifuge।

4. Peristaltic तरल हैंडलर-आधारित 1 $L डिलुएंट वितरण गंतव्य प्लेट में

नोट: एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में कदम 4-1-4.5 प्रदर्शन.

  1. यह एक स्प्रे कीटाणुनाशक (सामग्री कीतालिका) के साथ छिड़काव द्वारा 1 जेडएल कैसेट सिर को संक्रमित, और टिप धारक में प्रवेश करने के लिए इस समाधान की अनुमति. कागज को अवशोषित करने पर अवशेष कीटाणुनाशक को अवशोषित करें। peristaltic तरल हैंडलर डिवाइस पर 1 जेडएल कैसेट माउंट. डिवाइस चालू करें और सुनिश्चित करें कि कैसेट प्रकार सेटिंग सही है (1 $L), साथ ही प्लेट प्रारूप (384 कुओं).
  2. ट्यूबिंग के पूरे लुमेन को संक्रमित करें: ट्यूब आयोजक (आठ ट्यूबों को एक साथ रखने) को एक बाँझ पोत में डालें और इसे 70% अल्कोहल के 5 एमएल से भरें। peristaltic तरल हैंडलर के प्राइमिंग समारोह का उपयोग करना, पहले ट्यूबिंग में शराब फ्लश और फिर यह आसुत पानी के 5 एमएल और सीरम मुक्त माध्यम के 5 एमएल पारित करके कुल्ला (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम [DMEM] 100 U/ पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन; सामग्री की तालिका), क्रमिक रूप से एक ही पोत में भरने। सुनिश्चित करें कि टिप में से कोई भी नेत्रहीन उन सभी से तरल प्रवाह का निरीक्षण करके भरा हुआ है।
  3. प्रीवार्म्ड सीरम मुक्त माध्यम के 10 एमएल के साथ एक नया बाँझ पोत भरने और उस में ट्यूब आयोजक डाइविंग द्वारा सीरम मुक्त माध्यम के साथ ट्यूबिंग प्रधानमंत्री। के बारे में 10 s के लिए peristaltic तरल हैंडलर के प्रमुख बटन दबाएँ. एक बार फिर, सुनिश्चित करें कि कोई टिप नेत्रहीन उन सभी से तरल प्रवाह का निरीक्षण करके भरा हुआ है.
  4. थाली को 1 डिग्री सेल्सियस के साथ भरें। peristaltic तरल हैंडलर प्लेट वाहक पर एक बाँझ 384 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (गंतव्य) प्लेस और उसके ढक्कन हटा दें।
  5. 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 डिग्री सेल्सियस वितरित करने के लिए पूर्वकैलिब्रेटेड प्रोग्राम चलाएं। वितरण समय लगभग 8 s है. फिर 384-वेल प्लेट के ढक्कन को बदलें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इस चरण को मैन्युअल रूप से हैंडल किया जा सकता, एक सुरक्षा कैबिनेट में, एक multichannel micropipette का उपयोग कर.

5. मैन्युअल रूप से वितरित मात्रा को नियंत्रित करने के लिए एक सर्वेक्षण का प्रदर्शन

नोट: विवरण के लिए, चित्र 4देखें.

  1. नैनोडिस्पेंसर प्रोग्राम चलाएं, नैदानिक टैब पर जाएं, स्रोत प्लेट आउट बॉक्स को सही कसे, प्लेट होल्डर पर स्रोत प्लेट लोड करें, और प्लेट में प्रवेश करने के लिए टिक करें। जब संकेत मिले, तो नैनोडिस्पेंसर को जलीय बफ़र वितरण मोड पर सेट करने के लिए 384LDV$AQ$B2 का चयन करें, और Okदबाएँ.
  2. विविध मेनू में सर्वेक्षण का चयन करें और लॉन्चपर क्लिक करें. विश्लेषण और जाओ बटन पर क्लिक करने के लिए prefilled कुओं का चयन करें. सत्यापित करें कि मापा मात्रा अपेक्षित लोगों से मेल खाते हैं और यह सुनिश्चित करें कि कोई कुओं से अधिक की मात्रा के साथ लोड किया गया है 12 $L के रूप में यह स्थानान्तरण से बचना होगा.

Figure 4
चित्र 4 : सर्वेक्षण सॉफ्टवेयर मापदंडों को परिभाषित. (1) नैनोडिस्पेंसर प्रोग्राम प्रारंभ करें। (2) निदान टैब खोलें. (3) स्रोत प्लेट को स्रोत प्लेट के लिए बाहर टिक करके डालें और फिर , में. (4) संकेत मिलने पर मेनू में स्रोत प्लेट प्रकार निर्धारित करें. (5) विविध बॉक्स में, ड्रॉप-डाउन मेनू में सर्वेक्षण का चयन करें। (6) लॉन्च पर क्लिक करके सर्वेक्षण कार्यक्रम लॉन्च करें. (7) मापने के लिए पहले से भरे कुओं का चयन करें। (8) जाओ पर क्लिक करके विश्लेषण शुरू करो. (9) एक बार सर्वेक्षण किया जाता है, मापा मात्रा इसी चयनित कुओं में लिखा जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. गंतव्य प्लेट में एडीई संचालित डीएनए वितरण

  1. पिकलिस्ट सॉफ्टवेयर चलाने के लिए, 384-अच्छी तरह से स्रोत और गंतव्य प्लेट प्रकार 384-LDV और Greiner 384PS $781096, क्रमशः सेट (चित्र5)। डिवाइस जलीय बफर वितरण मोड के लिए सेट करें 384LDV$AQ$B2का चयन करके, और untick "स्थानांतरण थ्रूपुट को अनुकूलित करें"।

Figure 5
चित्र 5 : पिकलिस्ट आधारित वितरणों का प्रदर्शन। (1) नैनोडिस्पेंसर सॉफ्टवेयर शुरू करें। प्रोटोकॉल टैब में, का चयन करें (2) नमूना प्लेट प्रारूप, (3) गंतव्य प्लेट प्रकार और (4) unticks "अनुकूलन स्थानांतरण थ्रूपुट". (5) सूची चुनें टैब का चयन करें . (6) आयात पर क्लिक करें और उचित *.csv फ़ाइल (डीएनए-पिकलिस्ट या T.R.-Picklist) का चयन करें। (7) एक बार चयनित, आयातपर क्लिक करें . (8) प्ले पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल को बचाने के। (9) सिम्युलेशनपर क्लिक करके , या (10) रनपर क्लिक करके प्रोग्राम किए गए वितरण को शुरू करें . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. "सूची चुनें" टैब का चयन करें, आयातपर क्लिक करें, डीएनए-Picklist.csv फ़ाइल का चयन करें. प्ले पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल को बचाने के। पिकलिस्ट अपेक्षित प्रयोगात्मक डिजाइन से मेल खाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए क्रमादेशित वितरण का एक अनुकरण करने के लिए अनुकरण पर क्लिक करें। एक बार पूरा हो जाने पर, बंदकरें पर क्लिक करें.
  2. प्लेपर क्लिक करें, और फिर भागो,वितरण कार्यक्रम शुरू करने के लिए: जब पूछा, अनुरोध स्रोत प्लेट (डीएनए समाधान मैन्युअल रूप से भरा) और गंतव्य प्लेट (diluent भरा) नैनोडिस्पेंसर में डालें।
    नोट: वितरण समय एक पूर्ण 384-अच्छी प्लेट के लिए लगभग 5-20 मिनट है, चयनित संस्करणों और प्रयोगात्मक डिजाइन में वितरण की कुल संख्या पर निर्भर करता है।
  3. वैकल्पिक रूप से, प्रोटोकॉल को यहाँ रोकें क्योंकि diluent- और डीएनए से भरी प्लेटें 7 दिनों तक सूखी या जमे हुए भंडारण को संभाल सकती हैं। शुष्क भंडारण के लिए, प्लेटों को कमरे के तापमान पर बेंच पर सूखने दें और फिर उन्हें उसी तरह स्टोर करें। Thaw और अपकेंद्रित्र (2 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर) एक transfection चरण (अनुभाग 7) में उपयोग करने से पहले जमा प्लेटों जमे हुए.
     

7. एडीई संचालित transfection अभिकर्मक वितरण

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, extemporaneously एक 1x अंतिम एकाग्रता के लिए सीरम मुक्त माध्यम में lipopolyplex transfection अभिकर्मक कमजोर. भंवर और तुरंत मैक्रो द्वारा डिजाइन पूर्वनिर्धारित स्रोत प्लेट (एस) के अनुसार इस transfection अभिकर्मक मिश्रण वितरित और चरण 3.4 में वर्णित के रूप में precalibrated 384-अच्छी तरह से पाइपिंग गाइड आवेदन का उपयोग कर।
    नोट: स्रोत प्लेट को एक बार अभिक्रियक के साथ लोड होने के बाद अपकेंद्रन न करें क्योंकि सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद कोई ट्रांसफेलेशन नहीं देखा जाता है।
  2. 12 डिग्री सेल्सियस से अधिक की मात्रा के कारण वितरण त्रुटियों से बचने के लिए स्रोत प्लेट (एस) के सभी मैन्युअल रूप से भरे टी.आर. कुओं की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए, खंड 5 में वर्णित के रूप में एक "सर्वेक्षण" करने के लिए नैनोडिस्पेंसर प्रोग्राम चलाएँ।
  3. चयनसूची सॉफ्टवेयर में डीएनए चयनसूची का नमूना सूची साफ़ करने के लिए रीसेट करें पर क्लिक करें, और सत्यापित करें कि डिवाइस पैरामीटर अभी भी जलीय बफ़र्स के लिए और स्रोत और गंतव्य प्लेट प्रकार के लिए सेट कर रहे हैं, के रूप में चरण 6.1 में.
  4. आयात पर क्लिक करें और TR-Picklist.csv फ़ाइल चुनें. प्ले पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल को बचाने के लिए अगर संकेत दिया, और (यह वैकल्पिक है, लेकिन दृढ़ता से सिफारिश की) प्रोग्राम transfection अभिकर्मक मिश्रण dispensations के एक अनुकरण प्रदर्शन पर क्लिक करके वितरण की उचित डिजाइन सुनिश्चित करने के लिए बटन अनुकरण। एक बार पूरा हो जाने पर, बंदकरें पर क्लिक करें.
  5. प्लेपर क्लिक करें, और फिर चलाने के लिए वितरण कार्यक्रम शुरू करने के लिए बटन: के रूप में अनुरोध किया, स्रोत प्लेट (एस) (टीआर मिश्रण से भरे) और गंतव्य प्लेट (diluent- और डीएनए से भरा) नैनोडिस्पेंसर में जगह है.
    नोट: वितरण समय एक पूर्ण 384 अच्छी तरह से थाली के लिए कम से कम 20 मिनट है जब टी.आर. मिश्रण के 500 nL वितरण.
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा संकेत के रूप में डीएनए के लिए टी.आर. जोड़ने के बाद कमरे के तापमान पर 15-30 मिनट इनक्यूबेट।

8. Peristaltic तरल हैंडलर आधारित सेल वितरण

  1. कोशिकाओं के वितरण के लिए peristaltic तरल हैंडलर तैयार करें. Aniospray सर्फ 29 disinfectant के साथ छिड़काव और कागज पर अवशेष अवशोषित द्वारा एक 10 जेडएल कैसेट सिर को संक्रमित. peristaltic तरल हैंडलर डिवाइस पर कैसेट माउंट, कैसेट प्रकार सेटिंग को बदलने के लिए 10 $L, और सुनिश्चित करें कि प्लेट प्रारूप 384 कुओं के लिए सेट है.
  2. पहले चरण 4.2 में वर्णित के रूप में 10 जेडएल कैसेट टयूबिंग को संक्रमित. एक बाँझ पोत में ट्यूब आयोजक गोता और 70% शराब के 5 एमएल के साथ ट्यूबिंग फ्लश, तो आसुत पानी के 5 एमएल के साथ, और अंत में, सीरम मुक्त माध्यम के 5 एमएल के साथ, क्रमिक एक ही बर्तन में भरा और जब तक प्रत्येक ट्यूब खाली है.
  3. वितरित करने के लिए सेल निलंबन तैयार करें। एक confluent HeLa सेल B10-संस्कृति पकवान से, कोशिकाओं को 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) समाधान के साथ धोने, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए trypsin/EDTA के साथ कोशिकाओं को अलग।
  4. एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल वियोजन की पुष्टि करें और पूर्ण माध्यम के 10 एमएल जोड़कर trypsin/EDTA कार्रवाई बंद करो (DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 U/mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक; संस्कृति पकवान में सामग्री की तालिकादेखें)। एक 50 एमएल ट्यूब में हार्वेस्ट कोशिकाओं और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की गिनती, एक Malassez सेल या एक स्वत: सेल काउंटर का उपयोग कर.
  5. पूर्ण माध्यम में 37,500 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता पर कम से कम 25 एमएल हेला सेल निलंबन तैयार करें (अर्थात, 1,500 कोशिकाओं/40 जेडएल) को पूर्ण 384-वेल प्लेट के लिए, ताकि ट्यूब प्राइमिंग और 40 डिग्री एल/वेल वितरण सुनिश्चित किया जा सके।
  6. कोशिकाओं को वितरित करने के लिए, तैयार सेल निलंबन के साथ एक नया बाँझ पोत भरें और अवसादन से बचने के लिए इसे हिलाएं जिससे वितरण के सेल घनत्व में अशुद्धि है। इस समाधान में ट्यूब आयोजक डालें और सेल निलंबन वितरण सिर से फ्लश करने के लिए शुरू कर रहा है जब तक प्रधानमंत्री बटन दबाएँ। सुनिश्चित करें कि टिप में से कोई भी नेत्रहीन उन सभी से तरल प्रवाह का निरीक्षण करके भरा हुआ है, और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ट्यूब सेल निलंबन के साथ भरी हुई है।
  7. peristaltic तरल हैंडलर प्लेट वाहक पर डीएनए और टी.आर. भरा 384 अच्छी तरह से गंतव्य प्लेट लोड और उसके ढक्कन हटा दें। पूरी 384-वेल प्लेट (यानी, 1,500 कोशिकाओं/ वितरण समय के बारे में 8 s. 384 अच्छी थाली के ढक्कन बदलें.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 40 डिग्री सेल्सियस सेल निलंबन मैन्युअल रूप से एक मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग कर वितरित किया जा सकता है।

9. कस्टम जैविक परख (सेल transfection दक्षता निगरानी)

नोट: प्रयोगात्मक सेटिंग्स और प्रयोग के इरादे के बाद, luminescence, फ्लोरोसेंट, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक तरीकों का उपयोग करें, और रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-QPCR). प्रोटोकॉल के इस खंड में, सेल transfection दक्षता स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जाता है।

  1. एक पानी संतृप्त वातावरण में 5% सीओ2 के साथ और उचित प्रोटीन अभिव्यक्ति तक 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यहाँ, एक 48 एच ऊष्मायन समय hela कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जाता है transfection दक्षता पर नजर रखने के लिए, tdTomato का उपयोग कर- और mVenus-expressing प्लाज्मिड.
  2. संस्कृति मध्यम 48 एच प्लेट उलटा द्वारा संक्रमण निकालें, 30 $L/
  3. प्लेट को उलटकर फॉर्मेलिन निकालें; फिर, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को 0.1 एनजी/एमएल होचस्ट के साथ 1x पीबीएस समाधान में पतला इनक्यूबेट करें।
  4. फॉर्मलिन समाधान ऊष्मायन चरण के 6.9 पीएच द्वारा खोए गए उच्च फ्लोरोसेंट सिग्नल को पुनर्प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस के 80 डिग्री सेल्सियस के साथ 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को धोएं।
  5. एक स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, दो या तीन फ्लोरोसेंट चैनलों की छवियों को प्राप्त (Hoechst, tdTomato, और mVenus) क्रमिक रूप से 10x उद्देश्यों और एक उचित उत्सर्जन फिल्टर सेट के साथ (4 ",6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], dsRed, और फ्लोरेसीन आइसोथियोसायनेट [FITC], क्रमशः).
  6. transfection क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, नाभिक धुंधला पर आधारित स्क्रिप्ट विश्लेषण का उपयोग कर transfection क्षमता निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

एडीई प्रौद्योगिकी एक स्वचालित रिवर्स transfection प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तो यह निर्धारित करने के लिए fमें आदेश, हम एक लाल फ्लोरोसेंट tdTomato plsmid व्यक्त का उपयोग कर, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल transfection दक्षता पर नजर रखी। सबसे अच्छा transfection मापदंडों का निर्धारण करने के लिए पहला लक्ष्य, विभिन्न diluent मात्रा और डीएनए की कुल मात्रा पार परीक्षण किया गया. प्रारंभिक प्रयोगों में पाए जाने वाले असमांग ट्रांसफेक्शन को दरकिनार करने के लिए डीएनए बूंदों को एक बार वितरित करने के बाद, डीयूएन बूंदों को अनुमति देने के लिए उपयोग किया गया था (यानी, केवल कुओं के केंद्र में)। जैसा कि चित्र 6कमें दर्शाया गया है , लिपोपॉलीप्लेक्स अभिकर्मक20 का उपयोग करके हेला कोशिकाओं का रूपांतरण सफल रहा। दिलचस्प है, एक 1 डिग्री एल diluent मात्रा का उपयोग करके, डीएनए मात्रा से लेकर 5 करने के लिए 30 एनजी एक ही दक्षता और अप करने के लिए 90% सेल transfection उच्च मात्रा की तुलना में दिखाया, जैसे 50 और 100 एनजी, जिसके लिए एक अचानक कमी देखा गया था. हमने 15 एनएल से लेकर 4 डिग्री सेल्सियस तक विभिन्न मंद मात्रा की कोशिश की और 1 डिग्री सेल्सियस की पहचान की जो सबसे अच्छी स्थिति है, जैसा कि डीएनए के 30 एनजी का उपयोग करके यहां काफी उदाहरण दिया गया है।

Figure 6
चित्र 6 : प्रतिनिधि परिणाम. (क) डीएनए राशि का प्रभाव और ट्रांसफेक्शन दक्षता पर मंद मात्रा। HeLa कोशिकाओं नैनोडिस्पेंसर डिवाइस और lipopolyplex का उपयोग कर रिवर्स transfected थे, एक 1x एकाग्रता का उपयोग कर के रूप में निर्माता द्वारा सिफारिश की. की सिफारिश की diluent (सीरम मुक्त माध्यम), 15-4,000 nL के साथ इस्तेमाल किया गया था 10-100 ng मात्रा के साथ लाल-फ्लोरोसेंट-expressing प्लाज्मिड (tdTomato). Transfection क्षमता निर्धारित किया गया 48 एच पोस्ट-ट्रांसफेक्शन छवि आधारित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. परिणाम बढ़ती डीएनए राशि के लिए transfected कोशिकाओं के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, और diluent मात्रा इष्टतम स्थितियों से पता चलता है: एक बढ़ती diluent मात्रा के साथ कुल डीएनए के 30 एनजी और डीएनए मात्रा में वृद्धि के साथ diluent के 1 $L. त्रुटि सलाखों n के साथ SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं $ 4. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए दो-तरफा एनोवा और बोनफेरोनी पोस्ट-टेस्ट का उपयोग किया गया। अन्य डॉट्स की तुलना में *पी एंड 0.05। (बी) तैयार डीएनए प्लेटों की स्थिरता. Diluent (1 $L) peristaltic तरल हैंडलर का उपयोग कर वितरित किया गया था, और डीएनए के 30 एनजी वितरित किया गया था और तुरंत एडीई (नियंत्रण) द्वारा वितरित lipopolyplex अभिकर्मक का उपयोग कर या या तो कमरे के तापमान पर संग्रहीत एक बार सूखी या -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए. दिन 0, 2, या 7, शुष्क डीएनए peristaltic तरल हैंडलर का उपयोग कर diuent के 1 $L के साथ rehydrated किया गया था, और जमे हुए प्लेटों कमरे के तापमान और centrifuged पर (2 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर) thawed थे. तब वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार परिस्थाक द्रव संचालक का उपयोग करके कोशिकाओं को वरीयता दी जाती थी। त्रुटि सलाखों n के साथ SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं $ 3. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए दो-तरफा एनोवा और बोनफेरोनी पोस्ट-टेस्ट का उपयोग किया गया। एन एस ] अमहत्वपूर्ण रूप से अलग है। (सी) प्लाज़्मिड डीएनए सह-परिवर्तन दक्षता। HeLa कोशिकाओं mVenus के 30 एनजी के साथ transfected थे- और tdTomato-एक्सप्रेसिंग प्लाज्मिड दो अलग स्रोत कुओं में भरी हुई (अपने रिश्तेदार फ्लोरोसेंट उत्पादन के स्तर के लिए tdTomato पर mVenus के एक 1.7 अनुपात का उपयोग). ट्रांसफेक्शन क्षमता की तुलना छवि-आधारित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 48 एच पोस्ट-ट्रांसफेक्शन से की गई थी और ट्रांसफेेक्टेड कोशिकाओं के प्रतिशत और ट्रांसफेेक्टेड आबादी के भीतर सह-ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी। cotransfected कोशिकाओं का प्रतिशत लाल फ्लोरोसेंट जनसंख्या कोशिकाओं में हरे-फ्लोरोसेंट-निर्दंव कोशिका संख्या की गणना करके निर्धारित किया गया था। त्रुटि सलाखों n के साथ SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं $ 3. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए दो-तरफा एनोवा और बोनफेरोनी पोस्ट-टेस्ट का उपयोग किया गया। एन एस ] अमहत्वपूर्ण रूप से अलग है। (डी) तीन फ्लोरोसेंट चैनलों (Hoechst, tdTomato, और mVenus) का उपयोग करके पैनल सी में दिखाए गए छवि अधिग्रहण से फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के प्रतिनिधि क्षेत्रों क्रमिक रूप से एक इमेजिंग प्लेटफॉर्म द्वारा अधिग्रहीत (सामग्री कीतालिका) ), 10x उद्देश्यों और एक उचित उत्सर्जन फिल्टर सेट (DAPI, dsRed, और FITC, क्रमशः) का उपयोग कर. यह आंकड़ा कॉलिन एट अल1से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आदेश में आगे इस प्रोटोकॉल के थ्रूपुट बढ़ाने के लिए, हम अगले जांच अगर एक स्रोत प्लेट भंडारण डीएनए और diluent समाधान के साथ prefilled संग्रहीत किया जा सकता है और एक बाद के चरण में इस्तेमाल किया. डीएनए को कुशलतापूर्वक संग्रहीत करने के दो तरीकों का परीक्षण किया गया, अर्थात् इसे बेंच पर सूखा या जमे हुए भंडारण (-20 डिग्री सेल्सियस पर) देकर प्लेट को सूखा भंडारण किया गया। दोनों भंडारण विधियों ने 7 दिनों तक संग्रहित हौसले से वितरित डीएनए समाधान की तुलना में काफी भिन्न परिणाम नहीं दिए (चित्र 6B), और दोनों विधियों ने संग्रहीत डीएनए प्रीफिल्ड प्लेटों से ट्रांसफेक्शन करना संभव बनाया, जैसे कि एक बैंक Plasmids.

अंत में, के रूप में प्लाज्मिड transfection सबसे अधिक बार कम से कम दो अलग प्लाज्मिड का उपयोग कर होता है, हम अगले सबसे अच्छा पहचान की शर्तों का उपयोग कर यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के डीएनए multiplexing क्षमता की जांच की (1 diluent के एल और डीएनए के 30 एनजी). पहले इस्तेमाल किया tdTomato लाल-फ्लोरोसेंट प्रोटीन-एक्सप्रेस्ड प्लाज्मिड mVenus व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया था, एक उज्ज्वल पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और दोनों तो cotransfection प्रयासों में इस्तेमाल किया गया. लाल या हरे रंग की फ्लोरोसेंट-सकारात्मक कोशिका विश्लेषण (चित्र 6C) ने ट्रांसफेक्शन दक्षता को लगभग 80% होने के लिए दिखाया; हालांकि, लाल आबादी में, लगभग 100% कोशिकाओं को भी mVenus-expressing प्लाज्मिड के साथ cotransfected थे के रूप में प्रतिनिधि सॉफ्टवेयर आधारित चित्र विश्लेषण में देखा जा सकता है चित्रा 6D.

पूरक चित्र 1 : प्लाप के नीचे को छूने के लिए एक उपयुक्त डिस्पेंसरी ऊंचाई दिखारहा आरेख, वितरण टिप पर अपनी अवधारण से बचने के लिए। बाईं ओर, उचित सेटिंग्स ड्रॉप वितरण युक्तियाँ पर अपनी अवधारण से बचने के लिए अच्छी तरह से सतह पर फैल करने के लिए अनुमति देते हैं। सही पर, बुरा सेटिंग्स अगले कच्चे करने के लिए सिर आंदोलन के दौरान देखा जा सकता है कि छोटी बूंद प्रतिधारण के लिए नेतृत्व. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

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Discussion

किसी दिए गए सेल लाइन के लिए एक सटीक उच्च-थ्रूपुट ट्रांसफेक्शन विधि की स्थापना और अनुकूलन के लिए वैज्ञानिकों को इस खंड में वर्णित कुछ प्रमुख मापदंडों का पालन करने की आवश्यकता होती है। हम दृढ़ता से प्रोटोकॉल भर में सिफारिश की मूल्यों के साथ शुरू करने के रूप में इन सेटिंग्स HeLa कोशिकाओं के लिए अनुकूलित भी HEK कोशिकाओं के लिए कुशल साबित कर दिया प्रोत्साहित करते हैं. हालांकि, के रूप में सबसे अच्छा पैरामीटर सेल लाइनों और transfection अभिकर्मकों पर निर्भर हो सकता है, इष्टतम शर्तों सेल संख्या अलग द्वारा परिभाषित किया जा सकता है, diluent मात्रा, कुल डीएनए राशि, और transfection अभिकर्मक प्रकृति, एकाग्रता, या यहां तक कि मात्रा के रूप में इस्तेमाल किया गया था Hela कोशिकाओं1के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान मामला .

यहाँ प्रस्तुत समग्र प्रोटोकॉल विकसित किया गया है और आगे भी क्षेत्र में novices द्वारा सेल transfection की अनुमति देने के लिए अनुकूलित. इस लक्ष्य तक पहुंचने के लिए, प्रोटोकॉल को यथासंभव सरल रूप में प्रस्तुत करने और मानवीय त्रुटियों से बचने के लिए मुख्य उपकरण विकसित किए गए हैं: उपयोगकर्ता के अनुकूल स्प्रेडशीट मैक्रो आसानी से प्रयोग और टैबलेट अनुप्रयोग को डिज़ाइन करने के लिए उपयोगकर्ता को ठीक से स्रोत भरने के लिए मार्गदर्शन करने के लिए एक टैब्लेट अनुप्रयोग डिज़ाइन करता है प्लेट (ओं)।

इस प्रकार, प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए, केवल कुछ महत्वपूर्ण कदम को नियंत्रित किया जाना है: i) एक उचित प्रयोगात्मक डिजाइन; ii) शास्त्रीय परिस्थातरल द्रव संचालक से उचित peristaltic वितरण; iii) उचित डीएनए और ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक ध्वनिक आधारित वितरण; iv) ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक वितरण से पहले स्रोत प्लेट के अपकेंद्रण से बचना क्योंकि ऐसा लग रहा था कि ट्रांसफेक्शन को बाधित किया जा रहा है। इन कुछ सिफारिशों के बाद कोशिकाओं के कुशल transfection सुनिश्चित करेगा.

उचित प्रयोगात्मक डिजाइन

प्रयोगात्मक सेटअप उपयोगकर्ता के अनुकूल मैक्रो स्प्रेडशीट जो सिर्फ उम्मीद डीएनए प्लाज्मिड नाम, वांछित राशि, और कुछ महत्वपूर्ण पैरामीटर मूल्यों के साथ भरा जाना है के विकास के द्वारा प्रदान किया गया है. एक बार भरा, मैक्रो पहले इस तरह के स्रोत कुओं और transfection अभिकर्मक वितरण मात्रा के लिए दर्ज की गई उपयुक्त न्यूनतम और अधिकतम मात्रा के रूप में संभावित त्रुटियों का पता लगाने के लिए दर्ज मानकों का विश्लेषण करती है। इसके अलावा, चार संभावित पंक्तियों में से प्रत्येक में दर्ज डीएनए सांद्रता और अंतर्निहित क्षेत्रों में दर्ज प्लाज्मिड मात्रा के आधार पर, मैक्रो सत्यापित करता है अगर वितरित करने के लिए अपेक्षित मात्रा 2.5 एनएल के गुणक हैं (बूंदों की मात्रा द्वारा वितरित नैनोडिजर) एक बार किसी भी त्रुटि के लिए एक जांच किया गया है, मैक्रो प्रत्येक डीएनए नमूना है कि वितरित किया जाना होगा की कुल राशि की गणना करता है और, फिर, (वर्णमाला क्रम में डीएनए नाम छँटाई द्वारा) स्रोत प्लेट टेम्पलेट डिजाइन. स्रोत प्लेट (s) में इंगित वॉल्यूम किसी स्रोत में अपेक्षित कार्य वॉल्यूम को अच्छी तरह से खाते में लेते हैं (टेम्पलेट पत्रक में भरे गए न्यूनतम और अधिकतम वॉल्यूम मानों से परिकलित). प्रत्येक कुएं में सभी अपेक्षित डीएनए वितरण तो डीएनए-पिकलिस्ट शीट पर लिखे जाते हैं। डीएनए-ट्रांसफेक्टेड कुओं की सूची का उपयोग टेम्प्लेट शीट पर इंगित ट्रांसफेक्शन रिएजेंट वॉल्यूम का उपयोग करके टी.आर.-पिकलिस्ट शीट लिखने के लिए किया जाता है। स्रोत प्लेट शीट पर परिकलित संस्करणों तो 384 अच्छी तरह से pipeting गाइड शीट को स्थानांतरित कर रहे हैं. डीएनए-पिकलिस्ट, टी.आर.पिकलिस्ट, और 384-वेल पाइपिंग गाइड से डेटा तो *.csv प्रारूप में इसी फ़ाइलों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है।

स्रोत प्लेट पर उचित डीएनए और टी.आर.

एक 384 अच्छी तरह से स्रोत प्लेट पर वितरण के रूप में और, अधिक विशेष रूप से, लक्ष्य का पता लगाने अच्छी तरह से त्रुटियों को बढ़ावा देने और अधिक समय लेने वाली हैं, हम एक समर्पित गोली आधारित iPipet21के समान आवेदन विकसित किया है. iPipet के विपरीत, यहाँ वर्णित एक Android के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है (केवल एंड्रॉयड संस्करण 4.4 और ऊपर का समर्थन किया है). मैक्रो स्प्रेडशीट द्वारा उत्पन्न 384-वेल्स-पाइपिंग-गाइड.csv फ़ाइल के आधार पर, यह उपयोगकर्ता को समग्र वितरण प्रक्रिया में मदद करता है। जबकि कुछ वितरण के लिए इसके उपयोग के लायक नहीं है, यह समय बचाने के लिए और त्रुटियों से बचने के लिए दिलचस्प हो सकता है अगर डीएनए और टी.आर. वितरण की एक बड़ी संख्या की उम्मीद कर रहे हैं. .csv फ़ाइल में अच्छी तरह से, प्लेट, नाम, सांद्रता, और वॉल्यूम जानकारी होनी चाहिए. यह आवेदन तो इस तरह के एक उपयोगकर्ता समर्पित csv फ़ाइल के अनुसार, लक्ष्य में समाधान (अभिकरण, डाई, यौगिक, आदि) वितरण के रूप में अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, यह उपयोगकर्ता इस अपेक्षित प्रारूप का उपयोग कर लक्ष्य अच्छी तरह से कॉलम में प्रासंगिक जानकारी दर्ज करके एक पूरी पंक्ति या पंक्ति रोशन करने के लिए अनुमति देता है: Row$1 (24 करने के लिए) या Line$A (पी करने के लिए).

खराब सेल ट्रांसफेक्शन दक्षता का समस्या निवारण

नीचे वर्णित कई पैरामीटर वर्णित एडीई-आधारित प्रोटोकॉल में सेल ट्रांसफेक्शन को ख़राब कर सकते हैं और दक्षता समस्याओं के मामले में व्यक्तिगत रूप से जांच और दरकिनार करना होगा।

transfection के लिए पहले महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक कोशिकाओं की गुणवत्ता और बुवाई के दौरान इस्तेमाल किया घनत्व है। हालांकि प्रत्येक सेल प्रकार विभिन्न मापदंडों की आवश्यकता होगी, उनमें से कुछ एक सफल transfection सुनिश्चित करने के लिए सम्मान किया जाना चाहिए. सबसे पहले, सेल निलंबन transfection से पहले सेल तनाव से बचने के लिए एक subconfluent प्लेट से extemporaneously तैयार किया जाना चाहिए, और वे बहुत लंबे समय के लिए बेंच पर झूठ बोल नहीं छोड़ा जाना चाहिए (2 एच अधिकतम). दूसरा, कोशिकाओं का बीज घनत्व दो कारणों से काफी कम होना चाहिए: सेलुलर संपर्कों से बचने और एक उच्च कोशिका की सतह को बढ़ावा देने के लिए एक बार फैल लेकिन यह भी क्योंकि सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं को बेहतर विदेशी न्यूक्लिक एसिडले 22,23. दुर्भाग्य से, transfection के लिए इष्टतम सेल घनत्व सेल प्रकार और transfection प्रौद्योगिकी के आधार पर भिन्न होता है और प्रत्येक सेल लाइन के लिए निर्धारित किया जाना है. प्रभावी ट्रांसफेक्शन सुनिश्चित करने के लिए ये महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं।

एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर जो ट्रांसफेक्शन दक्षता को मॉड्युलेट कर सकता है वह है सेल मार्ग संख्या24. दरअसल, संस्कृति में कोशिकाओं को लगातार प्रतियोगिता और प्राकृतिक चयन के कारण विकास के अधीन हैं. यह सर्वविदित है कि निम्न और उच्च कोशिका मार्ग संख्याओं के बीच अंतर जीन अभिव्यक्ति की अपेक्षा अधिकांश कोशिका रेखाओं में विभेद के कारण की जाती है क्योंकि मार्ग संख्या में वृद्धि होती है। इस घटना के बाद, transfection दक्षता भी प्रभावित हो सकता है. हालांकि, मार्ग से संबंधित प्रभाव सेल लाइन और संस्कृति की स्थिति पर भारी निर्भर होने के लिए प्रदर्शन किया गया है। उस के शीर्ष पर, क्या एक "उच्च" मार्ग स्तर माना जाता है एक सेल लाइन से दूसरे में भिन्न होता है. इसका मतलब यह है कि मार्ग संख्या सीमा जिसके तहत प्रयोगों का एक सेट मज़बूती से प्रदर्शन किया जा सकता है प्रत्येक दिए गए सेल लाइन के लिए निर्धारित किया जाना है.

एक अन्य पैरामीटर जो transfection के लिए सबसे अच्छी स्थितियों का निर्धारण करने में कठिनाई को बढ़ाता है वह यह है कि संस्कृति माध्यम संरचना भी सीरम और/या एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति के बाद से एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है transfection दक्षता modulate. वास्तव में , अधिकांश वाणिज्यिक प्रोटोकॉल ट्रांसफेक्शन चरण के दौरान सीरम मुक्त माध्यम के उपयोग की सिफारिश करते हैं ताकि दक्षता में वृद्धि हो या खराब दक्षता की समस्याओं को दूर कियाजासके 3 ,25,26,27. हालांकि, यह पैरामीटर वास्तव में अधिक जटिल है के रूप में यह दिखाया गया है कि, एक दिया सेल लाइन के लिए, जल्दी बनाम देर मार्ग बढ़ाने या संस्कृति मध्यम28में सीरम उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर दक्षता कम कर सकते हैं. अन्य शोधकर्ताओं ने ट्रांसफेक्शन29के लिए उच्च गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, ट्रांसफेक्शन से पहले ट्रांसफेक्शन से पहले पारित होने के लिए एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम के उपयोग को पूर्व-संप्रेरण ित ामाल किया है। समाप्त करने के लिए, जब किसी दिए गए सेल प्रकार के लिए transfection शर्तों का अनुकूलन, इन मापदंडों में से प्रत्येक का परीक्षण किया जाना चाहिए: जल्दी या देर से पारित कोशिकाओं और के साथ या बिना सीरम के माध्यम का उपयोग कोशिकाओं की कटाई से पहले और / transfection कदम ही.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, अभिकर्मक के दो प्रकार का उपयोग किया गया: एक liposomal अभिकर्मक liposome की तरह परिसरों और lipopolyplex अभिकर्मक, एक nonliposomal बहुलक यौगिक1बनाने. जबकि हम साल के लिए सफलता थी मैन्युअल रूप से पहले एक के साथ Hela कोशिकाओं transfecting, गरीब transfection दक्षता वर्तमान स्वचालित प्रोटोकॉल में मनाया गया था. यह शायद एक आवश्यक भंवर कदम के कारण था जब ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक है कि 384 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में नहीं किया जा सकता के साथ डीएनए मिश्रण. lipopolyplex इस तरह के एक कदम की जरूरत नहीं है और, इसलिए, सभी परीक्षण सेटिंग्स में उच्च transfection क्षमता के लिए नेतृत्व किया. हालांकि यह वर्तमान अध्ययन में पुष्टि नहीं की गई है, transfection अभिकर्मकों कि एक भौतिक मिश्रण कदम की आवश्यकता से बचने ऐसे pipetting या भंवर शायद बेहतर परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे.

हम यह भी प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक रिवर्स transfection पर आधारित है के रूप में रिवर्स transfection के साथ संगत एक transfection अभिकर्मक के उपयोग की सलाह देते हैं। कुछ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करना कठिन माना जाता है और कुछ समर्पित रासायनिक यौगिकों का विकास उच्च संक्रमण दक्षता30,31को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है . यदि हार्ड-टू-ट्रांसफेक्ट कोशिकाओं को ट्रांसफेक्टिंग करने का लक्ष्य है, तो हम दिए गए सेल-प्रकार या सेल-लाइन-समर्पित ट्रांसफेक्शन अभिकर्मकों का परीक्षण करने की सलाह देते हैं, यह मानते हुए कि रिवर्स ट्रांसफेक्शन इन लोगों के साथ संभव है।

कई अंतर्निहित पैराग्राफ में विस्तृत मानकों एक प्रभाव हो सकता है और कुछ हद तक एडीई वितरण प्रक्रिया ख़राब, संभवतः अंतिम प्रयोग को बर्बाद कर.

नैनोडिस्पेंसर को जलीय बफर (अर्थात9 डिग्री सेल्सियस कार्य मात्रा) से भरे हुए स्रोत कुओं से 2.5 एनएल बूंदों को वितरित करने के लिए विकसित किया गया था। इस अध्ययन में प्रयुक्त नैनोडिस्पेंसर उपकरण स्रोत प्लेट में तरल संरचना और तरल ऊंचाई के निर्धारण के लिए एक गतिशील तरल विश्लेषण प्रौद्योगिकी को एकीकृत करता है ताकि 2.5 एनएलबूंदोंको बाहर निकालने के लिए आवश्यक शक्ति को नियंत्रित किया जा सके . जबकि स्रोत प्लेट मैन्युअल रूप से भरने या एक शास्त्रीय peristaltic तरल हैंडलर का उपयोग कर, मात्रा सबसे अधिक बार गतिशील तरल पदार्थ विश्लेषण द्वारा निर्धारित उन लोगों की तुलना में इतना सटीक नहीं हैं. यह ध्यान में रखना एक महत्वपूर्ण बिंदु है क्योंकि डिवाइस 12 डिग्री सेल्सियस से अधिक लोड किए गए स्रोत कुओं से वितरण करने में सक्षम नहीं है। इस प्रकार, उनकी उपस्थिति प्रयोग समझौता होगा. बेशक, प्रदर्शन की व्यवस्था की एक सूची कार्यक्रम के अंत में उत्पन्न किया जा सकता है, लेकिन यह उपयोगकर्ता की आवश्यकता है संस्करणों को समायोजित करने और एक कार्यक्रम चलाने के लिए केवल चूक dispensations ठीक है. इन असहमति से बचने के लिए, यह एक "सर्वेक्षण" एक बार डीएनए प्लाज्मिड प्रत्येक संबंधित अच्छी तरह से में अपेक्षित मात्रा सत्यापित करने के लिए लोड किया गया है प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है.

छोटी बूंद के निष्कासन के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर तरल सतह तनाव17,32में भिन्नता है . जल डीएनए समाधान उनके चिपचिपापन के लिए जाना जाता है; इससे एडीई द्वारा वितरण प्रक्रिया को बाधित किया जा सकता है। जबकि भौतिक मानकों हमारे पिछले अध्ययन में निर्धारित नहीं किया गया1, स्रोत प्लेट में उच्च डीएनए समाधान सांद्रता कम transfection दक्षता में हुई, यहां तक कि डीएनए की एक ही कुल राशि के लिए वितरित, शायद इस वजह से घटना. इस प्रकार, हम सबसे अच्छा परिणाम के लिए 100 एनजी/जेडएल के एक प्लाज़्मिड कमजोर पड़ने का उपयोग करने की सलाह देते हैं, हालांकि अन्य सांद्रता उपयोगकर्ता सुविधा के लिए परीक्षण किया जा सकता है। उपयोगकर्ता की जरूरत डीएनए एकाग्रता के साथ उचित एडीई सुनिश्चित करने के लिए, एक डाई कुओं में छोटी बूंद निष्कासन की निगरानी करने के लिए समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है या, यहां तक कि बेहतर, प्लेट ढक्कन पर. प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पहला लक्ष्य उच्च थ्रूपुट हासिल करने के लिए था, सस्ते minicolumn आधारित प्लाज्मिड डीएनए minipreparation किट प्लेट आधारित उच्च throughput प्लाज्मिड शोधन प्रोटोकॉल के साथ संगत इस्तेमाल किया गया. जबकि यह प्रयोग के प्रदर्शन के दौरान ठीक से काम किया, कम दक्षता और transfection के बाद गरीब सेल व्यवहार्यता के मामले में, यह इस तरह के मिडी या मैक्सी तैयारी या यहां तक कि endotoxin मुक्त के रूप में उच्च ग्रेड डीएनए शोधन तरीकों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट जोकोशिकाओंके लिए बेहतर डीएनए शुद्धता और कम विषाक्तता सुनिश्चित करेंगी .

अच्छी सतह पर असमांग कोशिका ट्रांसफेक्शन का समस्या निवारण

पहले प्रयास जब प्रोटोकॉल की स्थापना केवल कुओं के केंद्र में सेल transfection के लिए नेतृत्व किया, जहां बूँदें एडीई द्वारा भेजे गए थे. वास्तव में, हमने देखा कि डीएनए और transfection मिश्रण सभी अच्छी तरह से सतह पर फैल नहीं था और कम मात्रा में वितरित की वजह से सेल इसके अलावा से पहले सूख रहा था (लगभग 500 एनएल). इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, एक diluent वितरण कदम जोड़ा गया था डीएनए / टी आर मिश्रण सेल जोड़ने से पहले सभी कुओं में फैल करने के लिए अनुमति देने के लिए। इसके परिणामस्वरूप कुएं में एक सजातीय कोशिका रूपांतरण हुआ। इस प्रकार, जब प्रयोग और डीएनए / टी आर मिश्रण सभी कुओं में फैल नहीं है, diluent मात्रा उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है.

ध्वनिक तरल हैंडलर नैनोलीटर रेंज में संस्करणों को वितरित कर सकते हैं के रूप में, वर्णित विधि संभावित रूप से किसी भी तकनीकी सीमाओं नहीं है। तथापि, हमने देखा कि जलीय-समाधान से भरे कुओं वाष्पीकरण के अधीन हैं, जो एक सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। यदि वितरित किया जा करने के लिए सटीक मात्रा इस वाष्पीकरण द्वारा कम कर रहे हैं, नैनो डिस्पेंसरी अपेक्षित अंत करने के लिए नहीं किया जाएगा। इस स्थिति में, एक त्रुटि रिपोर्ट नैनोडिस्पेंसर द्वारा जनरेट किया गया है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, स्वीकार्य ऊपरी श्रेणी में रहते समय अपेक्षा से अधिक वॉल्यूम का उपयोग करें (वास्तव में, 12 डिग्री सेल्सियस से कम)। हालांकि, यदि वाष्पीकरण कुछ वितरणों की हानि की ओर जाता है, तो एक त्रुटि रिपोर्ट नैनोडिस्पेंसर द्वारा उत्पन्न होती है। इस फाइल को संबंधित गंतव्य कुओं पर वितरित किए जाने वाले नए अभिकर्मक के साथ स्रोत प्लेट को भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक कम समय अंतराल में ऐसा करने से ट्रांसफेक्शन दक्षता ख़राब नहीं लग रहा था।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल स्वतंत्र डीएनए प्लाज्मिड transfections के लिए इस तरह के थ्रूपुट प्राप्त करने के लिए पहले से एक है। पहले तक पहुँच ी सर्वोत्तम दरें 288 विभिन्न परिस्थितियोंके लिए थीं जिनमें 15 के साथ एक साथ अत्यधिक विशिष्ट कौशल की आवश्यकता थी . यह, इसके उच्च प्रवाह के अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल अन्य महत्वपूर्ण लाभ के रूप में समग्र प्रक्रिया nonspecialists और उपकरणों द्वारा इसके उपयोग की अनुमति के लिए अनुकूलित किया गया है त्रुटियों से बचने के लिए विकसित किया गया है, अर्थात् मैं) एक समर्पित स्प्रेडशीट मैक्रो की अनुमति प्रयोगात्मक टेम्पलेट के आसान डिजाइन, ii) इस मैक्रो द्वारा इसी डीएनए और transfection अभिकर्मक स्रोत प्लेट (एस) टेम्पलेट की स्वचालित पीढ़ी, iii) डीएनए के सॉफ्टवेयर चालित वितरण को नियंत्रित करने के लिए दो तैयार-से-उपयोग फ़ाइलों की पीढ़ी और नैनोडिस्पेंसर डिवाइस द्वारा transfection अभिकर्मक, और iv) एक समर्पित गोली आधारित आवेदन द्वारा भी विकसित करने के लिए बनाया गया स्रोत प्लेट (एस) के लिए इसी एक "384 अच्छी तरह से pipeting गाइड" फ़ाइल के निर्यात, जबकि मानव त्रुटियों से बचने के लिए भी विकसित की है 384-वेल सोर्स प्लेट (एस) में वितरण।

प्रोटोकॉल के भविष्य में सुधार

थ्रूपुट और पुन: उत्पादन क्षमता को बढ़ाने के लिए, प्लाज्मिड से भरी स्रोत प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या डीएनए स्टॉक समाधानके लिए हमेशा की तरह जमे हुए किया जा सकता है। इसके अलावा, हमने दिखाया कि डीएनए के साथ पहले से भरी हुई गंतव्य प्लेट को भी ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक और कोशिकाओं को जोड़ने से पहले कम से कम 7 दिनों के लिए सूखी या जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है, जिससे समग्र थ्रूपुट और प्रोटोकॉल की आसानी में वृद्धि हुई है। 4 से अधिक वर्षों के लिए डीएनए संरक्षण पहले अनुकूलित मीडिया34 का उपयोग कर सूचित किया गया है और, इसलिए, इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में परीक्षण किया जाना चाहिए के रूप में यह एक कदम आगे धक्का होगा, प्लेटों के दीर्घकालिक भंडारण को सक्षम करने के बैंकों के साथ prefilled प्लाज्मिड और ट्रांसफेक्शन प्रयोगों में उपयोग के लिए तैयार।

हम पहले से पता चला है कि पहचान इष्टतम transfection शर्तों उच्च पैमाने पर प्रयोगों के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है, 96 से अच्छी तरह से 10 सेमी संस्कृति व्यंजन1, डीएनए राशि की गणना करके, transfection अभिकर्मक मात्रा, और सेल घनत्व है कि चाहिए अनुकूलित 384-वेल प्लेट प्रोटोकॉल के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है। के रूप में 1536 अच्छी तरह से प्लेट वितरण नैनोडिस्पेंसर द्वारा भी प्रबंधनीय है, प्रोटोकॉल भी एक कम पैमाने पर किया जा सकता है, इस प्रकार अपने थ्रूपुट बढ़ाने. हालांकि, इस प्रारूप तक पहुँचने के लिए एक प्रमुख सीमा कोशिकाओं को वितरित करने और इस तरह के एक miniaturized प्रारूप में अंतिम पठन-आउट का प्रबंधन करने की क्षमता है। एडीई द्वारा सेल वितरण पहले से ही सफलतापूर्वक 1536 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप35 में तटस्थ घनत्व है कि सेल बोने को रोका और समय में समान सेल घनत्व सुनिश्चित के एक समाधान का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. यहाँ प्रयुक्त कक्ष संख्या और 384 (0.056 सेमी2) बनाम 1536 कुओं (0.025 सेमी2), 500-650 कोशिकाओं के आधार पर इस अंतिम प्रारूप में वितरित किया जाएगा। इस तरह के एक सेल वितरण संख्या रेंज अत्यधिक विश्वसनीय होना दिखाया गया है अगर 14%-18% तटस्थ घनत्व के केंद्रित समाधान का उपयोग किया जाता है. इन सेटिंग्स के तहत, सेल निलंबन के 100 एनएल 1536 कुओं पर वितरित किया जाएगा। ऐसे कुओं में 5-8 डिग्री सेल्सियस के एक काम समाधान के साथ, शास्त्रीय peristaltic तरल संचालकों का उपयोग संस्कृति माध्यम के 5-8 डिग्री एल जोड़ने से कम से कम 0.3% के लिए antiseeding समाधान पतला होगा, इस प्रकार उचित सेल बोने की अनुमति. इस तरह के एक कम पैमाने पर ट्रांसफेक्टिंग कोशिकाओं इस प्रकार तकनीकी रूप से संभव लगता है; हालांकि, transfection दक्षता पर तटस्थ घनत्व समाधान के अवशिष्ट एकाग्रता के प्रभाव को आगे काम से निर्धारित किया जा रहता है.

कोशिकाओं को वितरित करने के लिए उच्च कार्य मात्रा वाले स्रोत प्लेट प्रकारों का उपयोग करना, जैसे कि 384-वेल पॉलीप्रोपीलीन स्रोत प्लेट्स जिनकी कार्य मात्रा 45 डिग्री सेल्सियस है, एक समग्र 1536-वेल प्लेट के लिए केवल चार स्रोत कुओं से 100 एनएल सेल समाधान वितरण की अनुमति देगा। इसके अलावा, नए नैनोडिस्पेंसर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए गए 2.5 एनएल के बजाय 25 एनएल की बूंदों को वितरित करने में सक्षम हैं। इस ड्रॉप आकार, तो, वितरण समय 10 गुना विभाजित करता है, लेकिन 25 nL संस्करणों जो, तथापि, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वितरित विभिन्न संस्करणों के साथ संगत रहने के कई का उपयोग करने के लिए संकेत मिलता है।

इन नवीनतम कार्यों और तकनीकी सुधार के आधार पर, एक 1536 अच्छी तरह से प्लेट transfection प्राप्त करने के लिए एक और एडीई सेल वितरण कदम आसानी से वर्तमान प्रोटोकॉल में जोड़ा जा सकता है. हालांकि, इस तरह के miniaturizations तक पहुँचने केवल इसके लायक है अगर bioassay इस तरह के एक miniaturized प्रारूप में संयोग से संभव है.

अंत में, हमने एक आसान, उच्च-थ्रूपुट और सटीक ट्रांसफेक्शन विधि विकसित की है जिसमें लघुकरण के कारण कई फायदे हैं: (1) ट्रांसफेलेशन अभिकर्मक की लागत को कम करना; (2) डीएनए की तैयारी की बर्बादी को कम करने; (3) यह सुनिश्चित करना है कि यहां तक कि शुरुआती सफलतापूर्वक सेल transfection प्रदर्शन कर सकते हैं. वास्तव में, यह केवल कुछ आसान मैनुअल कदम की आवश्यकता है, अर्थात् 100 एनजी / $L के लिए डीएनए को कम करने, यह एक स्रोत प्लेट पर वितरण (एक प्लासमिड / बोने से पहले. एडीई आधारित नैनोडिस्पेंसर प्रयोग के दिए गए टेम्पलेट के अनुसार, समय लेने वाली और त्रुटि-प्रवण खुराक वितरण और प्लाज्मिड के मल्टीप्लेक्सिंग के प्रभारी हैं।

इसके अलावा, जबकि इस प्रोटोकॉल शास्त्रीय transfection प्रयोगों के बुनियादी जैविक मंशा के सबसे सुनिश्चित कर सकता है, यह भी सरणी आधारित प्रयोगों के लिए नए तरीके खोल सकता है. उदाहरण के लिए, मानव ORFeome संग्रह36 या CRISPR-Cas9 पुस्तकालय आधारित दृष्टिकोण37से प्रत्येक मानव प्रोटीन-कोडिंग जीन को व्यक्त या दस्तक देना, क्रमशः, एक समर्पित स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म पर 24 घंटे से कम की आवश्यकता होगी (53 x 384- अच्छी तरह से प्लेटें), बजाय मानव काम के 2-3 दिनों, एक डीएनए-प्रीलोडेड प्लेट बैंक के उपयोग को संभालने. अपनी उच्च दक्षता और उच्च-थ्रूपुट प्रदर्शन के कारण, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी Gएसआरएसआर-Cas9 आधारित अध्ययन के लिए GRएसआर-Cas9-expressing प्लाज्मिड के साथ नए nonpooled दृष्टिकोण प्राप्त करने में सक्षम हो सकता है। वास्तव में, हल्के सेलुलर phenotype परिवर्तन, जो वर्तमान में आवश्यक सेल छँटाई कदम की अनुमति नहीं दे सकते, अंत में प्रबंधनीय होगा, के रूप में एक अच्छी तरह से एक खटखटाया जीन का प्रतिनिधित्व करेंगे.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों अनुसंधान, authorship, और / या इस लेख के प्रकाशन के लिए निम्नलिखित वित्तीय सहायता की एक रसीद का खुलासा किया: Inserm, लील पाश्चर संस्थान, Conseil R$gional du Nord, और PRIM-HCV1 और 2 (P$le de Recherche Interdisciplinaire sur le M$dicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), फेडर (12001407 (D-AL) लैसेक्स कल्पना बायोमेड) और यूरोपीय समुदाय (ईआरसी-एसटीजी इन्ट्रासेलटीबी एन डिग्री 260901)। लेखक डॉ एस Moureu, डॉ बी Villemagne, डॉ आर Feru-Clment, और डॉ एच Groult उनकी महत्वपूर्ण समीक्षा और पांडुलिपि के सुधार के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

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References

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ध्वनिक नैनोडिजिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए उच्च-थ्रूपुट डीएनए प्लास्मिड मल्टीप्लेक्सिंग और ट्रांसफेक्शन
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Colin, B., Rocq, N., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology. J. Vis. Exp. (150), e59570, doi:10.3791/59570 (2019).

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