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Genetics

Multiplexación y transfección de plasmión de ADN de alto rendimiento mediante tecnología de nanodispensación acústica

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

Este protocolo describe la transfección de plásmido de alto rendimiento de células de mamíferos en una placa de 384 pocillos utilizando tecnología de eyección de gotas acústicas. La dispensación y multiplexación de ADN, que consume mucho tiempo y propensa a errores, pero también la dosificación del reactivo de transfección, son impulsadas por software y realizadas por un dispositivo de nanodispensador. Las células son sembradas en estos pozos precargados.

Abstract

La transfección celular, indispensable para muchos estudios biológicos, requiere controlar muchos parámetros para un logro preciso y exitoso. La mayoría de las veces se realiza a bajo rendimiento, además es lento y propenso a errores, aún más cuando multiplexa varios plásmidos. Hemos desarrollado un método fácil, rápido y preciso para realizar la transfección celular en un diseño de placa de 384 pocillos utilizando la tecnología de eyección de gotas acústicas (ADE). El dispositivo de nanodispensador utilizado en este estudio se basa en esta tecnología y permite la entrega precisa de nanovolúmenes a alta velocidad desde una placa de pozo de origen a una placa de destino. Puede dispensar y multiplexar ADN y reactivo de transfección de acuerdo con una hoja de cálculo prediseñada. Aquí presentamos un protocolo óptimo para realizar la transfección de plásmido de alto rendimiento basada en ADE que permite alcanzar una eficiencia de hasta el 90% y una cotransfección de casi el 100% en experimentos de cotransfección. Ampliamos el trabajo inicial proponiendo una macro basada en hojas de cálculo fácil de usar, capaz de administrar hasta cuatro plásmidos/pozos de una biblioteca que contiene hasta 1.536 plásmidos diferentes, y una aplicación de guía de pipeteo basada en tabletas. La macro diseña las plantillas necesarias de las placas de origen y genera los archivos listos para usar para la aplicación basada en nanodispensador y tableta. El protocolo de transfección de cuatro pasos implica i) un diluyente dispense con un manipulador de líquidos clásico, ii) distribución y multiplexación de plásmidos, iii) un reactivo de transfección dispensando por el nanodispensador, y iv) chapado celular en los pozos precargados. El control basado en software descrito de multiplexación y transfección de plástidos ADE permite incluso a los no especialistas en el campo realizar una transfección celular confiable de una manera rápida y segura. Este método permite una rápida identificación de la configuración óptima para un tipo de celda determinado y se puede transponer a enfoques manuales y de mayor escala. El protocolo facilita aplicaciones, como la proteína ORFeome humana (conjunto de marcos de lectura abiertos [ORF] en un genoma) o la validación de la función génica basada en CRISPR-Cas9, en estrategias de cribado no agrupadas.

Introduction

El método presentado aquí describe en detalle cómo realizar multiplexación y transfección de plásmido de ADN en células de mamíferos a alto rendimiento utilizando un nanodispensador líquido de base acústica en una placa de 384 pocillos, incluso para no especialistas en el campo. Este método publicado recientemente1 permite realizar hasta 384 condiciones independientes de multiplexación y transfección de ADN plásmido en un experimento, en menos de 1 h. Los experimentos individuales o de cotransfección tuvieron éxito, alcanzando un cotransfección dentro de la población de células transtrinfectadas. Este protocolo facilita la transfección porque la mayoría de los pasos tediosos, lentos y propensos a errores ahora son controlados por software (consulte la figura 1 para obtener una visión general). Se han hecho más esfuerzos para desarrollar herramientas específicas para mejorar la facilidad de uso evitando al mismo tiempo errores humanos durante el proceso general y para promover la transfección exitosa incluso para los no especialistas en la materia. El protocolo descrito incluye una hoja de cálculo macro "fácil de usar" que hemos desarrollado con el fin de gestionar 384 condiciones de transfección independientes con posibilidades de multiplexación de hasta cuatro plásmidos en cada pozo. La macro genera automáticamente plantillas de las placas de origen para cargar el volumen de plásmido de ADN esperado desde el inicio de las soluciones de stock y los archivos necesarios para conducir el software nanodispensador sobre el diseño experimental que se ha introducido. Como la dosificación manual del ADN en una placa fuente de 384 pocillos es tediosa y propensa a errores, también desarrollamos una aplicación dedicada a la tableta para guiar al usuario mientras dispensamos la solución de ADN de acuerdo con la plantilla.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo experimental. Representación esquemática del protocolo automatizado óptimo de transfección inversa de alto rendimiento (desde el diseño experimental hasta el ensayo biológico personalizado). Los pasos manuales se indican mediante el símbolo de la mano y la hora aproximada de cada paso se escribe en un cuadro rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muchos experimentos basados en células comienzan con la transfección de ADN de plásmido, e incluso si muchos reactivos dedicados han sido y todavía se están desarrollando para mejorar la eficiencia de la transfección y / o facilitar el procedimiento, queda mucho por hacer2,3 , 4. La transfección celular de plásmido de ADN implica varios pasos para alcanzar una alta eficiencia, como una toma compleja inicial, escape endosomal y transporte citoplasmático al núcleo5,6. Además de la precipitación de calcio o técnicas físicas como la electroporación o la microinyección utilizando dispositivos dedicados7, los métodos químicos modernos se han centrado en mejorar la entrega de células de ADN mientras se reduce la toxicidad celular8, 9. El uso de lípidos o polímeros catiónicos que forman complejos liposomas y, más recientemente, sistemas de química polimérica no liposómica ha hecho que la transfección sea más fácil y eficiente10. A pesar de estos avances, la transfección celular todavía requiere habilidades específicas para ser realizadas con precisión, ya que la mayoría de estos protocolos de transfección física o química requieren que los científicos preparen manualmente cada condición de reacción de transfección de ADN, por lo tanto deteriorando el rendimiento. Para evitar este problema, se han desarrollado protocolos de transfección inversa utilizando reactivos de transfección química11,12,13,lo que permite al usuario probar o combinar varios plásmidos de una manera más rápida. En estos protocolos, se forman complejos de ácido nucleico con reactivos de transfección antes de sembrar las células en los complejos. Sin embargo, estos protocolos inversos siguen estando limitados por el manejo manual de las soluciones de ADN y por la combinación de cada una de las condiciones independientes. Aunque es factible realizarlos en un formato de placa de 96 pocillos, la preparación del ADN y los dispensadores serán tediosos, y es probable que haya errores. Cuando se requieren diferentes cantidades de varios plásmidos de ADN y se multiplexan entre sí, la transfección celular se vuelve aún más difícil de lograr y consume más tiempo, y los errores humanos se vuelven bastante inevitables. Escalar hasta el formato de placa de 384 pocillos en un enfoque de transfección inversa, a pesar de las pocas condiciones de transfección de ADN multiplexado, se convierte en un desafío imposible debido a las siguientes razones. i) Las cantidades de ADN, el reactivo de transfección o los volúmenes de mezcla de reacción que se deben manejar son inferiores a 1 l para cada poca. ii) La multiplexación de plásmidos para 384 condiciones independientes se vuelve extremadamente complicada. La entrega en cada uno de los 384 pozos también es iii) muy lento y iv) propenso a errores. De hecho, la dispensación de la solución correcta en los pozos esperados es difícil de gestionar porque los volúmenes bajos ya dispensados no permiten la supervisión visual entre los pozos vacíos y ya llenos. v) Por último, existe un alto riesgo de secado de la mezcla por evaporación antes de que se añadan las células debido al tiempo necesario para realizar los pasos de dosificación necesarios. En resumen, el factor limitante para configurar ensayos de transfección de plaños de ADN de alto rendimiento parece ser la miniaturización del ensayo, lo que implica multiplexación y gestión de bajo volumen que ya no se puede manejar manualmente, pero que tampoco se pueden lograr en un forma fiable por los manipuladores de líquidos peristáticos clásicos.

Como prueba de dificultad para automatizar tales ensayos y obtener un alto rendimiento, sólo unos pocos intentos de automatizar la transfección se han publicado hasta ahora: un formato de placa de 96 pocillos utilizando un dispositivo comercial de manipulación de líquidos y precipitación de fosfato cálcico14 y, más recientemente, un reactivo lipoplex, y un chip microfluídico que permite 280 transfecciones independientes15 pero que requieren habilidades especializadas en este campo. Otro método, la acoustopforesis, que permitía la levitación de líquidos y que conducía a la manipulación y mezcla de fluidos, se utilizó para realizar la transfección de ADN en formatos de placa de 24 a 96 pocillos16. Aunque es factible, este enfoque sufre de un rendimiento extremadamente bajo, ya que la mezcla de células con mezcla de transfección de ADN requiere una incubación de 60 s para cada punto antes de la sembración. Esto implica una duración de al menos 96 minutos para una placa completa de 96 pocillos. Además, este protocolo está lejos de ser susceptible de la audiencia general de los biólogos, ya que este trabajo se realizó con un dispositivo interno diseñado y fabricado que actualmente no está disponible en el mercado. Por el contrario, en los últimos años, una tecnología de dosificación basada en acústica basada en software fácil de usar ha surgido con dispositivos dispensadores de nanovolúmenes. Utilizando energía acústica enfocada, estos dispositivos permiten la expulsión estrechamente controlada de pequeños volúmenes de líquido de 2,5 nL a 500 nL desde una placa de origen hasta un destinode 17. Esta tecnología, llamada eyección de gotas acústicas (ADE), tiene numerosas ventajas: es totalmente automatizada, sin contacto, sin puntas, precisa, precisa y altamente reproducible, y tiene un alto rendimiento18. Primero dedicado a la entrega de soluciones de dimetilsulfóxido (DMSO), los ajustes se han mejorado para dispensar tampones acuosos19. Los nanodispensadores acústicos, entonces, parecen adecuados para los protocolos de transfección de células inversas y podrían eludir la mayoría de las limitaciones manuales antes mencionadas. Como no se describieron previamente los intentos de transfección de plásmidos utilizando esta tecnología, recientemente evaluamos la idoneidad de un sistema de dosificación basado en acústica para realizar la transfección de células inversas.

Aprovechando el rendimiento del nanodispensador y la facilidad de uso, optimizamos un protocolo de transfección inversa para las células HeLa mediante pruebas cruzadas de varios parámetros que pueden influir en la transfección del ADN en una placa única de 384 pocillos, a saber, la cantidad total de ADN y concentración inicial del ADN fuente, volumen diluyente, reactivo de transfección y número de células diseminados. El protocolo desarrollado elude las limitaciones manuales de transfección celular antes descritas y presenta varias ventajas sobre otros intentos de transfección automatizados. En primer lugar, se miniaturiza, lo que permite un reactivo de transfección rentable al ahorrar preparaciones de plásmido de ADN y reactivo de transfección. En segundo lugar, es mucho más alto rendimiento y reproducible que el protocolo manual (incluso para principiantes), ya que la transfección de toda una placa de 384 pocillos se puede lograr en menos de 1 h. Por último, está impulsado por software, permitiendo el control de la cantidad de ADN dispensado y la multiplexación de varios plásmidos. De hecho, gracias al software nanodispenser (Tablade Materiales),el usuario puede elaborar un plan de estudio para controlar los volúmenes a dispensar desde una placa de pozo de origen definida a una placa de destino.

El protocolo presentado aquí está destinado principalmente a aquellos que tienen acceso a un nanodispensador y les gustaría establecer experimentos de transfección a alto rendimiento, pero también para aquellos que quieren optimizar rápidamente sus parámetros de transfección para un tipo de celda dado por aplicando este protocolo para probar varios parámetros a un alto rendimiento. De hecho, hemos demostrado que los parámetros optimizados identificados con este protocolo a nanoescala se pueden transponer a experimentos de transfección manuales y a mayor escala. Por último, dado que el reactivo de transfección utilizado en el presente protocolo permite la transfección de ADN o siRNA según el fabricante, el protocolo también es de interés para aquellos que tienen como objetivo realizar enfoques de matriz para la sobreexpresión genética o derribo. Las placas de destino precargadas con ADN se pueden conservar hasta 7 días antes de su uso en un ensayo de transfección sin pérdida de eficacia, que es otra ventaja del siguiente protocolo para este tipo de aplicación.

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Protocol

1. Preparaciones anticipadas

  1. Preparación de los programas de manipulación de líquidos peristálticos
    NOTA: Para los pasos de dosificación de diluyentes y células del protocolo, se debe preparar un programa dedicado, teniendo en cuenta la altura del cabezal dispensador a la placa utilizada y la intención del paso.
    1. Para el paso de dispensación de diluyente de 1 l, monte un cassette de 1 l y prepare un programa con los ajustes descritos en los pasos 1.1.1.1 y 1.1.1.2.
      1. Ajuste el parámetro de caudal a Alto para obtener el mejor rendimiento, ya que no se espera ningún daño material biológico en este paso. Ajustar la altura de la dosificación a 9,6 mm (según la placa de cultivo celular utilizada, Figura suplementaria 1) para permitir que la caída de 1 L toque la parte inferior de los pozos durante la dispensación.
        NOTA: Este paso es crucial para evitar la retención de las gotas en el cabezal dispensador hasta alcanzar un volumen suficiente para caer.
      2. Ajuste la altura clara de la placa a 14,4 mm para permitir un desplazamiento libre del cabezal dispensador sobre la placa después de dispensar cada fila. Controle visualmente los ajustes adecuados de la altura de la cabeza del controlador de líquido peristáltico: asegúrese de que no se conserven gotas en las puntas de dosificación durante la dosificación y compruebe que la cabeza es lo suficientemente alta como para permitir el desplazamiento de la cabeza después de dispensar cada fila.
        NOTA: Evitar la retención de caídas es un parámetro crucial, ya que perjudicará la precisión del volumen de la dispensación.
    2. Para la dosificación de la suspensión de celda de 40 l, monte un cassette de 10 ml y prepare un programa con los ajustes descritos en los pasos 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Ajuste el parámetro de caudal a Bajo para dispensar celdas con una velocidad baja para evitar promover posibles daños a las células por tensión cortante y alto impacto en la parte inferior de los pozos. Ajuste la altura de dispensación a 11,43 mm (según la placa de cultivo celular utilizada, Figura suplementaria 1), lo suficientemente alta como para reducir el impacto celular en la parte inferior de los pozos durante el proceso de dosificación, pero lo suficientemente baja como para evitar la retención de las gotas en el cabeza dispensadora. Ajuste la altura clara de la placa a 16 mm para permitir el desplazamiento libre del cabezal dispensador sobre la placa después de dispensar cada fila.
      2. Controle visualmente los ajustes adecuados de la altura de la cabeza del controlador de líquido peristáltico: asegúrese de que no se conserven gotas en las puntas de dosificación durante la dosificación y compruebe que la cabeza es lo suficientemente alta como para permitir el desplazamiento de la cabeza después de dispensar cada fila.
        NOTA: Evitar la retención de caídas es un parámetro crucial, ya que conducirá a la dispensación de un número de celda poco fiable.
  2. Preparación del plásmido de ADN (protocolo clásico de extracción miniprep)
    1. Cultivar una cepa de bacterias DH5 transformada en medio LB suplementada con 125 g/ml de antibiótico de selección de ampicilina (Tablade materiales)durante la noche a 37 oC y bajo agitación suave (200 rpm) en un agitador orbital (Tabla de materiales).
    2. Cosecha 2 mL del cultivo, peletlas por centrifugación durante 5 min a 6.000 x g, y descarta el sobrenadante.
    3. Resuspenda el gránulo de celda con 250 ml de tampón de resuspensión que contenga RNase A (Tablade materiales). Añadir 250 l de tampón de lisis e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Detenga la reacción de lisis añadiendo 300 s de búfer de neutralización (Tablade materiales)y vortexting en breve. Centrifugar los tubos durante 5 min a 11.000 x g.
    5. Coloque una nueva minicolumna de plásmido (Tablade Materiales)en un tubo de recogida de 2 ml y decantele el sobrenadante en la columna centrifugando durante 1 min a 11.000 x g.
    6. Deseche el flujo y vuelva a colocar la minicolumna en el tubo de recogida.
    7. Lavar la minicolumna de plásmido con 500 ml de tampón de lavado opcional (Tabla deMateriales)y centrífuga durante 1 min a 11.000 x g, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    8. Deseche el flujo y vuelva a colocar la minicolumna plásmido en el tubo de recogida.
    9. Añadir 700 l de tampón de lavado (Tablade materiales)complementado con etanol y centrífuga durante 1 min a 11.000 x g,de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    10. Deseche el flujo y centrifugar la minicolumna plásmido y su tubo de recogida 1 veces más durante 2 min a 11.000 x g para secar la membrana de sílice.
    11. Colocar la minicolumna de plásmido seco en un nuevo tubo de 1,5 ml y añadir 30 ml de agua destilada precalentada a 60 oC, incubarla durante 2 minutos a temperatura ambiente, y luego, centrifugela durante 1 min a 11.000 x g.
    12. Deseche la minicolumna plásmido y mantenga el eluido que contiene el plásmido de ADN purificado.
    13. Mida la concentración de ADN del ADN eludado utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes (Tablade materiales).
      1. Encienda el espectrofotómetro y elija los ajustes de medición de ADN.
      2. Elevar el brazo de muestreo del espectrofotómetro y la pipeta 1 l de agua en el pedestal de medición para realizar una calibración en blanco.
      3. Baje el brazo de muestreo, inicie la medición en blanco y espere a que se complete.
      4. Levante el brazo de muestreo y limpie la muestra de los pedestales superior e inferior.
      5. Pipetear 1 l de la solución de ADN en el pedestal inferior para medirlo.
      6. Baje el brazo de muestreo, inicie la medición de la concentración de ADN y espere a que se complete.
      7. Levante el brazo de muestreo y limpie la muestra de los pedestales superior e inferior.
      8. Para mediciones adicionales de la concentración de ADN, repita los pasos 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. Una vez finalizadas las mediciones, guarde las soluciones de ADN a 4oC hasta su uso.

2. Diseño experimental y generación de las listas de selección para impulsar los dispensadores basados en ADE

NOTA: Se desarrolló una macro de hoja de cálculo "fácil de usar" dedicada para administrar cantidades de ADN y mezclar hasta cuatro plásmidos en un formato de placa de 384 pocillos. Basado en el diseño experimental introducido, esta macro genera los archivos necesarios para conducir el protocolo de transfección de ADN basado en ADE por nanodispenser. Para generar estos archivos, varios campos tienen que ser llenados en la hoja de plantilla tal y como se muestra en de la figura2.

Figure 2
Figura 2 : Generación de las listas de selección para impulsar la dispensación de ADE mediante la macro de hoja de cálculo. Hay que rellenar varios parámetros, a saber ,( 1) el reactivo de transfección (TR) y los volúmenes mínimos/máximos que se utilizarán en la placa de origen, (2) las concentraciones iniciales de plásmido que se dispensarán en la placa de origen, y (3) el diseño de placa completa, incluyendo las cantidades de plásmido esperadas y multiplexación en cada uno de los 384 pozos. (4) La activación Generar listas de selección permite verificar los diferentes campos y, una vez rellenados correctamente, se generan automáticamente listas de selección para la dispensación de ADN y TR y la plantilla de placa de origen necesaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Introduzca los parámetros del protocolo nanodispenser en los campos rosados. Establezca el valor de mezcla del reactivo de transfección (TR) en 500 nL. Fije el valor mínimo del volumen en los pocillos de la placa de origen a 4 l. Ajuste el volumen máximo en los pocillos de la placa de origen a 11,25 l.
    NOTA: El nanodispensador utilizado aquí sólo puede transferir un máximo de 500 nL en una ejecución de ADE. Estos campos rosados se rellenan previamente con los valores recomendados, pero se pueden modificar según las necesidades del usuario.
  2. Introduzca las concentraciones iniciales de ADN de 100 ng/L en los campos azules correspondientes al ADN subyacente.
    NOTA: Este valor es la concentración óptima definida previamente, pero, sin embargo, se puede modificar para diferentes necesidades del usuario.
  3. Introduzca la cantidad de ADN deseada en los campos gris/verde. Introduzca los importes y los nombres plásmidos de los 384 pozos, asegurando la misma ortografía si se utiliza el mismo plásmido en varios pozos.
  4. Genere el diseño de la placa de origen, los archivos de listas de selección y el archivo de guía de pipeteo. Haga clic en Generar listas de selección para permitir que la macro genere los archivos DNA-Picklist.csv, T.R.-Picklist.csv y 384-Wells-Pipetting-Guide.csv a partir de los datos recopilados en la hoja correspondiente. Si se solicita, corrija los valores de celda rellenos de naranja, ya que indica errores o volúmenes que el nanodispensador no puede controlar.
  5. Imprima las plantillas desde la hoja Placa de origen. Se indican los nombres plásmidos y el volumen mínimo para rellenar los pozos. Del mismo modo, los volúmenes de mezcla de reactivos de transfección que a continuación tendrán que rellenarse en los siguientes pozos se indican como TR y se resaltan en verde.

3. Preparación de la placa de origen de ADN utilizando la aplicación de guía de pipeteo de 384 pocillos

  1. Diluir el plásmido de ADN almacenado desde el paso 1.2.14 hasta 100 ng/-L utilizando agua destilada.
  2. Calibre la rejilla de 384 pocillos a las dimensiones de la placa: abra la aplicación de guía de pipeteo de 384 pocillos en una tableta (Figura3). Coloque la placa de origen en la cuadrícula en la pantalla inferior, y en el menú de calibración superior izquierdo, haga clic en + o - (o utilice el cursor rojo) para mejorar o reducir el tamaño de la rejilla y los pozos con el fin de ajustar los pozos verdes a los cuatro pozos de esquina de la placa .

Figure 3
Figura 3 : Uso de la aplicación de guía de pipeteo de 384 pozos. (1) Calibración de la rejilla de 384 pocillos al tamaño de la placa; (2) ) Montaje de un adaptador de placa impreso en 3D universal en la tableta mediante cinta adhesiva de doble cara; (3) Colocación de la placa en el adaptador; (4) Desplazamiento de la rejilla para centrarla en la placa montada. (5) Bloqueo del paso de calibración. (6) Apertura del archivo 384 wells pipetting guide.csv. (7) Dada la lista de archivos, la aplicación indicará el nombre esperado de la placa fuente, el reactivo (ADN o reactivo de transfección), la concentración y el volumen a dispensar en los pozos de destino, que se iluminarán uno por uno. (8) Los botones de flecha izquierda y derecha permiten al usuario seguir la guía de pipeteo para dispensar fácilmente los reactivos de acuerdo con las plantillas de placa de origen de macro de hoja de cálculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Con cinta adhesiva de doble cara, monte el adaptador de placa impresa en 3D en la pantalla para evitar movimientos de la placa de origen durante la dosificación. Si es necesario, mueva la rejilla calibrada utilizando las flechas de rotación y los botones Arriba/Abajo/Derecha/Izquierda para ajustar la cuadrícula de la pantalla a la posición de la placa. Una vez que la rejilla y los tamaños del pozo estén correctamente calibrados y localizados, marque la casilla Bloquear calibración.
  2. Haga clic en ARCHIVO y abra el archivo 384 wells pipetting guide.csv. Siga las instrucciones de la pantalla para dispensar manualmente el volumen indicado del plásmido indicado en la concentración indicada en el pozo blanco resaltado correspondiente al destino objetivo adecuado de la placa esperada. Utilice - o + flechas para volver o más en el proceso de dosificación de ADN. Deje de dispensar al llegar a la primera solución de reactivo de transfección que se va a cargar.
  3. Una vez finalizadas las dispensaciones de ADN, retire la placa fuente del adaptador. Si se tienen que llenar varias placas de origen, coloque una nueva placa de origen en el adaptador y siga las instrucciones de dosificación. Una vez finalizada la dispensación de ADN, centrifugar la(s) placa(s) fuente(s) llena(s) de ADN (a 1.500 x g durante 2 min) para asegurar una nivelación adecuada del líquido y eliminar las burbujas que conducen a la inexactitud en las transferencias basadas en ADE.

4. Dispensación de diluyente peristáltica a base de manipulador de líquidos de 1 l en la placa de destino

NOTA: Realice los pasos 4.1-4.5 en un armario de seguridad biológica.

  1. Desinfectar el cabezal de cassette de 1 l rociándolo con un desinfectante por pulverización (Tablade materiales)y permitir que esta solución entre en el soporte de la punta. Absorba el desinfectante remanente en papel absorbente. Monte el cassette de 1 l en el dispositivo de manipulador de líquidos peristálticos. Encienda el dispositivo y asegúrese de que el ajuste del tipo de cassette es correcto (1 L), así como el formato de la placa (384 pocillos).
  2. Desinfectar todo el lumen del tubo: inserte el organizador del tubo (sosteniendo los ocho tubos juntos) en un recipiente estéril y llénelo con 5 ml de 70% de alcohol. Usando la función de cebado del manipulador de líquidos peristálticos, primero enjuague el alcohol en el tubo y luego enjuáguelo pasando 5 ml de agua destilada y 5 ml de medio libre de suero (medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM] complementado con 100 U/ml penicilina-estreptomicina; Tabla de Material), rellenando sucesivamente el mismo recipiente. Asegúrese de que ninguna de las puntas esté obstruida inspeccionando visualmente el flujo de líquido de todos ellos.
  3. Prepara el tubo con medio libre de suero llenando un nuevo recipiente estéril con 10 ml de medio sin suero precalentado y buceando en él el organizador del tubo. Pulse el botón principal del manipulador de líquidos peristálticos durante unos 10 s. Una vez más, asegúrese de que ninguna punta esté obstruida inspeccionando visualmente el flujo de líquido de todos ellos.
  4. Llene la placa con 1 l de diluyente. Coloque una placa de cultivo estéril de 384 pocillos (destino) en el soporte de la placa controladora de líquido peristáltico y retire su tapa.
  5. Ejecute el programa precalibrado para dispensar 1 l en cada pocal de la placa de 384 pocillos. El tiempo de dosificación es de aproximadamente 8 s. A continuación, reemplace la tapa de la placa de 384 pocillos.
    NOTA: Alternativamente, este paso se puede manejar manualmente, en un gabinete de seguridad, utilizando un micropipeta multicanal.

5. Ejecución de una encuesta para controlar los volúmenes dosificados manualmente

NOTA: Para obtener más información, consulte la Figura 4.

  1. Ejecute el programa de nanodispensador, vaya a la pestaña de diagnóstico, marque la caja de salida de la placa de origen, cargue la placa de origen en el soporte de la placa y marque In para entrar en la placa. Cuando se le solicite, seleccione 384LDV_AQ_B2 para establecer el nanodispensador en el modo de dosificación del búfer acuoso y pulse Ok.
  2. Seleccione Encuesta en el menú Varios y haga clic en Iniciar. Seleccione los pozos precargados para analizar y haga clic en el botón Ir. Compruebe que los volúmenes medidos coincidan con los esperados y asegúrese de que no se hayan cargado pozos con volúmenes de más de 12 ml, ya que esto evitará las transferencias.

Figure 4
Figura 4 : Definición de los parámetros del software de topografía. (1) Inicie el programa nanodispenser. (2) Abra la pestaña Diagnóstico. (3) Inserte la placa de origen marcando Hacia fuera para la placa de origen y, a continuación, en. (4) Defina el tipo de placa de origen en el menú cuando se le solicite. (5) En el cuadro Varios, seleccione Encuesta en el menú desplegable. 6) Inicie el programa de encuestas haciendo clic en Iniciar. (7) Seleccione los pozos precargados para medir. (8) Iniciar el análisis haciendo clic en Ir. (9) Una vez realizada la encuesta, los volúmenes medidos se escriben en los pozos seleccionados correspondientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Dispensación de ADN impulsada por ADE en la placa de destino

  1. Ejecute el software de lista de selección, establezca los tipos de placa de origen y destino de 384 pocillos en 384_LDV y Greiner 384PS_781096, respectivamente (Figura5). Establezca el dispositivo en modo de dosificación de búfer acuoso seleccionando 384LDV_AQ_B2 y desmarque "optimizar el rendimiento de transferencia".

Figure 5
Figura 5 : Rendimiento de las dispensaciones basadas en listas de selección. (1) Inicie el software nanodispenser. En la pestaña Protocolo, seleccione (2) el formato de placa de muestra, (3) el tipo de placa de destino y (4) desmarque "optimizar el rendimiento de transferencia". (5) Seleccione la pestaña Lista de selección. (6) Haga clic en Importar y seleccione el archivo *.csv adecuado (DNA-PickList o T.R.-Picklist). (7) Una vez seleccionado, haga clic en Importar. (8) Haga clic en Reproducir y guarde el protocolo. (9) Realice una simulación de dispensación haciendo clic en Simularo (10) Iniciar la dispensación programada haciendo clic en Ejecutar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Seleccione la pestaña "Lista de selección", haga clic en Importar, seleccione el archivo DNA-Picklist.csv. Haga clic en Reproducir y guarde el protocolo. Haga clic en Simular para realizar una simulación de las dispensaciones programadas para asegurarse de que la lista de selección coincide con el diseño experimental esperado. Una vez completado, haga clic en Cerrar.
  2. Haga clic en Reproduciry, a continuación, en Ejecutar, para iniciar el programa de dosificación: cuando se le pregunte, inserte la placa de origen solicitada (soluciones de ADN rellenadas manualmente) y la placa de destino (rellenada con diluyente) en el nanodispensador.
    NOTA: El tiempo de dosificación es de aproximadamente 5-20 min para una placa completa de 384 pocillos, dependiendo de los volúmenes seleccionados y el número total de dispensaciones en el diseño experimental.
  3. Alternativamente, detenga el protocolo aquí, ya que las placas llenas de diluyente y ADN pueden manejar almacenamiento seco o congelado durante un máximo de 7 días. Para el almacenamiento en seco, deje que las placas se sequen en el banco a temperatura ambiente y luego guárdelas de la misma manera. Descongelar y centrifugar (a 1.500 x g durante 2 min) placas almacenadas congeladas antes de su uso en un paso de transfección (sección 7).
     

7. Dispensación de reactivos de transfección impulsados por ADE

  1. En un gabinete de bioseguridad, diluir extemporáneamente el reactivo de transfección lipopolyplex en medio libre de suero a una concentración final de 1x. Vortex y dispensar inmediatamente esta mezcla de reactivos de transfección de acuerdo con la(s) placa(s) fuente(s) predefinida(s) diseñada(s) por la macro y utilizando la aplicación precalibrada de guía de pipeteo de 384 pocillos como se describe en el paso 3.4.
    NOTA: No centrifugar la placa de origen una vez que esté cargada con el reactivo, ya que no se observa ningún transfecto después de la centrifugación.
  2. Ejecute el programa de nanodispensadores para realizar una "encuesta" como se describe en la sección 5, con el fin de controlar los volúmenes de todos los pozos TR llenados manualmente de las placas de origen para evitar errores de dosificación debidos a volúmenes superiores a 12 ol.
  3. Haga clic en Restablecer para borrar la lista de muestras de la lista de selección de ADN en el software de lista de selección y compruebe que los parámetros del dispositivo todavía están configurados en búferes acuosos y en los tipos de placa de origen y destino utilizados, como en el paso 6.1.
  4. Haga clic en Importar y elija el archivo TR-Picklist.csv. Haga clic en Reproducir y guarde el protocolo si se le solicita, y (esto es opcionalpero, pero se recomienda encarecidamente) realizar una simulación de las dispensaciones programadas de la mezcla de reactivos de transfección para asegurar el diseño adecuado de las dispensaciones haciendo clic en el Botón Simular. Una vez completado, haga clic en Cerrar.
  5. Haga clic en  Reproduciry, a continuación, en el botón Ejecutar para iniciar el programa de dosificación: según lo solicitado, coloque la(s) placa(s) de origen (TR-mezcla rellenada) y la placa de destino (diluyente- y lleno de ADN) en el nanodispensador.
    NOTA: El tiempo de dosificación es inferior a 20 minutos para una placa completa de 384 pocillos al dispensar 500 nL de mezcla TR.
  6. Incubar 15-30 min a temperatura ambiente después de añadir el TR al ADN según lo indicado por el protocolo del fabricante.

8. Dispensación de células peristáltica basada en manipulador de líquidos

  1. Prepare el manipulador de líquidos peristálticos para la dosificación de células. Desinfecte un cabezal de casete de 10 ml rociándolo con Aniospray Surf 29 Desinfectante y absorbiendo el remanente en papel. Monte el cassette en el dispositivo de manipulador de líquidos peristálticos, cambie el ajuste del tipo de cassette a 10 l y asegúrese de que el formato de la placa esté ajustado a 384 pozos.
  2. Desinfecte el tubo de casete de 10 l como se describió anteriormente en el paso 4.2. Sumergir al organizador del tubo en un recipiente estéril y lavar el tubo con 5 ml de 70% de alcohol, luego con 5 ml de agua destilada, y finalmente, con 5 ml de medio libre de suero, rellenado sucesivamente en el mismo recipiente y hasta que cada tubo esté vacío.
  3. Prepare la suspensión celular para dispensar. A partir de un plato de cultivo B10 de células HeLa confluente, lave las células 1x con 1 solución salina con búfer de fosfato (PBS) y luego disocia las células con tripina/EDTA durante 5 min a 37 oC.
  4. Verificar la disociación celular bajo un microscopio y detener la acción de trippsina/EDTA añadiendo 10 ml de medio completo (DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina; ver la Tabla deMateriales) en el plato de cultivo. Cosecha células en un tubo de 50 ml y cuenta las células bajo el microscopio, usando una célula Malassez o un contador de células automático.
  5. Preparar al menos 25 ml de suspensión celular HeLa a una concentración de 37.500 células/ml en un medio completo (es decir, 1.500 células/40 l) para una placa completa de 384 pocillos, para asegurar el cebado del tubo y una dosificación de 40 l/pozo.
  6. Para dispensar las células, llene un nuevo recipiente estéril con la suspensión de la célula preparada y revuelva para evitar la sedimentación que conduce a la inexactitud en la densidad celular de la dispensación. Inserte el organizador del tubo en esta solución y pulse el botón Prime hasta que la suspensión de la celda comience a vaciarse del cabezal dispensador. Asegúrese de que ninguna de las puntas esté obstruida inspeccionando visualmente el flujo de líquido de todos ellos, y asegúrese de que cada tubo esté cargado con suspensión celular.
  7. Cargue la placa de destino de 384 pocillos llena de ADN y TR en el soporte de la placa controladora de líquido peristáltico y retire su tapa. Ejecute el programa precalibrado para dispensar 40 l de la suspensión celular en la placa completa de 384 pocillos (es decir, 1.500 celdas/pozo). El tiempo de dosificación es de aproximadamente 8 s. Reemplace la tapa de la placa de 384 pocillos.
    NOTA: Alternativamente, la suspensión celular de 40 l se puede dispensar manualmente utilizando un micropipeta multicanal.

9. Ensayo biológico personalizado (monitoreo de la eficiencia de la transfección celular)

NOTA: Siguiendo los ajustes experimentales y la intención del experimento, utilice los métodos necesarios para la luminiscencia, la fluorescencia, el cribado de alto contenido y la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR). En esta sección del protocolo, la eficiencia de la transfección celular se evalúa mediante microscopía de fluorescencia automatizada y análisis de imágenes.

  1. Incubar la placa a 37oC con 5% de CO2 en una atmósfera saturada de agua y hasta la expresión adecuada de proteínas.
    NOTA: Aquí, se utiliza un tiempo de incubación de 48 h para que las células DeLa supervisen la eficiencia de la transfección, utilizando plásmidos que expresan tdTomato y mVenus.
  2. Retire el medio de cultivo 48 h después de la transfección invirtiendo la placa, añada 30 ol/pozo de formalina del 10% utilizando el manipulador de líquido peristáltico (cassette de 10 ol) e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  3. Retire la formalina invirtiendo la placa; luego, incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente con 0,1 ng/mL Hoechst diluido en 1 solución PBS.
  4. Lavar las células 3 veces durante 15 minutos con 80 ml de 1pbS ajustado a pH a 8 para recuperar la señal de alta fluorescencia perdida por el pH de 6,9 del paso de incubación de la solución de formalina.
  5. Usando un microscopio fluorescente automatizado, adquiera imágenes de dos o tres canales fluorescentes (Hoechst, tdTomato y mVenus) secuencialmente con objetivos 10x y un conjunto de filtros de emisión adecuado (4o,6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI], dsRed y fluoresceína isotiocianato [FITC], respectivamente).
  6. Para evaluar la eficiencia de la transfección, utilice el software de análisis de imágenes para determinar las eficiencias de transfección mediante el análisis de scripts basado en la tinción de núcleos.

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Representative Results

fPara determinar si la tecnología ADE podría utilizarse para un protocolo automatizado de transfección inversa, monitoreamos la eficiencia de la transfección celular mediante microscopía de fluorescencia, utilizando un plásmido de expresión tdTomato fluorescente rojo. En primer lugar con el objetivo de determinar los mejores parámetros de transfección, diferentes volúmenes de diluyente y cantidades totales de ADN fueron probados en crucigé. El volumen diluyente se utilizó para permitir que las gotas de ADN, una vez dispensadas, se extendieran por todos los pozos para eludir la transfección inhomogénea observada en experimentos preliminares (es decir, sólo en el centro de los pozos). Como se muestra en la Figura 6A,la transfección de células de HeLa utilizando el reactivo lipopolyplex20 fue exitosa. Curiosamente, mediante el uso de un volumen diluyente de 1 L, las cantidades de ADN que van de 5 a 30 ng mostraron la misma eficiencia y hasta un 90% de transfección celular en comparación con cantidades más altas, como 50 y 100 ng, para las que se observó una disminución abrupta. Probamos varios volúmenes de diluyente que van desde 15 nL a 4 l e identificamos 1 l para ser la mejor condición, como se ejemplifica significativamente aquí usando 30 ng de ADN.

Figure 6
Figura 6 : Resultados representativos. (A) Impacto de la cantidad de ADN y el volumen diluyente en la eficiencia de la transfección. Las células de HeLa fueron transfectó inversamente usando el dispositivo de nanodispensador y lipopolyplex, utilizando una concentración de 1x según lo recomendado por el fabricante. Del diluyente recomendado (medio libre de suero), se utilizaron 15-4.000 nL con 10-100 ng cantidades de plásmido expreso de color rojo-fluorescente (tdTomato). Las eficiencias de transfección se determinaron 48 h después de la transfección utilizando un software de análisis basado en imágenes. Los resultados se expresan como un porcentaje de células transtrampeñistas para la cantidad creciente de ADN, y el volumen diluyente muestra las condiciones óptimas: 30 ng de ADN total con un volumen de diluyente creciente y 1 l de diluyente con cantidades de ADN crecientes. Las barras de error representan el SEM con n . 4. Para el análisis estadístico se utilizaron anovabidireccional y bonferroni después de la prueba. *p < 0.05 en comparación con otros puntos. (B) Estabilidad de las placas de ADN preparadas. El diluyente (1 l) se dispensaba utilizando el manipulador de líquidos peristálticos, y 30 ng de ADN se dispensany e inmediatamente se transfectó utilizando reactivo lipopolyplex dispensado por ADE (control) o almacenado a temperatura ambiente una vez seco o congelado a -20 oC. En los días 0, 2 o 7, el ADN seco se rehidrató con 1 l de diluyente dispensado utilizando el manipulador de líquidos peristálticos, y las placas congeladas se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron (a 1.500 x g durante 2 min). Las células fueron sembradas usando el controlador de líquido peristáltico de acuerdo con el protocolo descrito. Las barras de error representan el SEM con n . 3. Para el análisis estadístico se utilizaron anovabidireccional y bonferroni después de la prueba. ns - no significativamente diferente. (C) Eficiencia de cotransfección de ADN plásmido. Las células HeLa fueron transfectó con 30 ng de plásmido expreso de mVenus y tdTomato cargado en dos pozos de origen separados (usando una proporción de 1.7 de mVenus sobre tdTomato con el fin de nivelar su producción de fluorescencia relativa). Las eficiencias de transfección se compararon 48 h después de la transfección utilizando software de análisis basado en imágenes y se expresaron como un porcentaje de células transtrinfectadas y un porcentaje de células cotransinfectadas dentro de la población transinfectada. El porcentaje de células cotransinfectadas se determinó calculando el número de células que expresan la fluorescencia verde en las células de población fluorescente roja. Las barras de error representan el SEM con n . 3. Para el análisis estadístico se utilizaron anovabidireccional y bonferroni después de la prueba. ns - no significativamente diferente. (D) Campos representativos de microscopía de fluorescencia de la adquisición de imágenes mostrada en el panel C utilizando tres canales fluorescentes (Hoechst, tdTomato y mVenus) adquiridos secuencialmente por una plataforma de imágenes (Tablade materiales ), utilizando objetivos 10x y un conjunto adecuado de filtros de emisión (DAPI, dsRed y FITC, respectivamente). Esta cifra ha sido modificada de Colin et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Con el fin de mejorar aún más el rendimiento de este protocolo, examinamos a continuación si un almacenamiento de placas de origen precargado con ADN y soluciones de diluyente podría almacenarse y utilizarse en una etapa posterior. Se probaron dos formas de almacenar DE forma eficiente el ADN, a saber, el almacenamiento en seco de la placa dejándola secar en el banco o el almacenamiento congelado (a -20 oC). Ambos métodos de almacenamiento no dieron lugar a resultados significativamente diferentes a los de la solución de ADN recién dispensada almacenada durante un máximo de 7 días (Figura6B),y ambos métodos hicieron posible realizar la transfección a partir de placas precargadas de ADN almacenadas, como un banco de Plásmidos.

Por último, como la transfección de plásmido ocurre con al menos dos plásmidos diferentes, examinamos a continuación la capacidad de multiplexación del ADN del protocolo presentado aquí utilizando las mejores condiciones identificadas (1 l de diluyente y 30 ng de ADN). El plásmido tdTomato rojo-fluorescente-proteína-expresión fue modificado para expresar mVenus, una proteína fluorescente de color amarillo brillante, y ambos se utilizaron en intentos de cotransfección. El análisis de células roja o verde-fluorescente-positiva (Figura6C) mostró que la eficiencia de la transfección era de aproximadamente el 80%; sin embargo, en la población roja, casi el 100% de las células también fueron cotransinfectadas con el plásmido expreso de mVenus como se puede ver en el análisis representativo de imágenes basado en software de la Figura 6D.

Figura suplementaria 1: Diagrama que muestra una altura de dispensación adecuada para que la gota toque la parte inferior del pozo para evitar su retención en la punta de dosificación. A la izquierda, los ajustes adecuados permiten que la caída se extienda en la superficie del pozo evitando su retención en las puntas de dosificación. A la derecha, los ajustes incorrectos conducen a la retención de gotas que se puede observar durante el movimiento de la cabeza a la siguiente cruda. Haga clic aquí para descargar esta figura.

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Discussion

El establecimiento y la optimización de un método preciso de transfección de alto rendimiento para una línea celular determinada requieren que los científicos sigan algunos parámetros clave descritos en esta sección. Recomendamos encarecidamente comenzar con los valores recomendados en todo el protocolo, ya que estos ajustes optimizados para las células HeLa también demostraron ser eficientes para las células HEK. Sin embargo, como los mejores parámetros pueden depender de las líneas celulares y los reactivos de transfección, las condiciones óptimas se pueden definir variando el número de células, el volumen de diluyente, la cantidad total de ADN y la naturaleza del reactivo de transfección, la concentración o incluso el volumen utilizado durante la optimización de este protocolo para las células de HeLa1.

El protocolo general presentado aquí ha sido desarrollado y optimizado para permitir la transfección celular incluso por los principiantes en el campo. Para alcanzar este objetivo, se han desarrollado herramientas clave para hacer que el protocolo sea lo más simple posible y evitar errores humanos: una macro de hoja de cálculo fácil de usar para diseñar fácilmente el experimento y una aplicación de tableta para guiar al usuario a llenar correctamente la fuente placa(s).

Por lo tanto, para garantizar la fiabilidad del protocolo, sólo unos pocos pasos críticos tienen que ser controlados: i) un diseño experimental adecuado; ii) las dispensaciones peristálticas adecuadas del manipulador de líquidos peristálticos clásicos; iii) el ADN adecuado y las dispensaciones basadas en acústica del reactivo de transfección; iv) evitar la centrifugación de la placa fuente antes de la dispensación del reactivo de transfección, ya que eso parecía perjudicar la transfección. Seguir estas pocas recomendaciones garantizaría la transfección eficiente de las células.

Diseño experimental adecuado

La configuración experimental se ha hecho fácil de usar por el desarrollo de la hoja de cálculo de macro que sólo tiene que ser llenado con el nombre de plásmidos de ADN esperado, cantidad deseada, y algunos valores de parámetros clave. Una vez rellenada, la macro analiza primero los parámetros introducidos para detectar posibles errores, como los volúmenes mínimos y máximos adecuados introducidos para los pozos de origen y el volumen de dispensación del reactivo de transfección. Además, sobre la base de las concentraciones de ADN introducidas en cada una de las cuatro filas posibles y la cantidad de plásmido introducida en los campos subyacentes, la macro verifica si los volúmenes esperados a dispensar son múltiplos de 2,5 nL (volumen de las gotas dispensadas por el nanodispensador). Una vez que se ha realizado una comprobación de cualquier error, la macro calcula la cantidad total de cada muestra de ADN que tendrá que ser dispensada y, a continuación, diseña la plantilla de placa fuente (ordenando los nombres de ADN en orden alfabético). Los volúmenes indicados en las placas de origen tienen en cuenta los volúmenes de trabajo esperados en un pozo de origen (calculados a partir de los valores de volumen mínimo y máximo rellenados en la hoja de plantilla). Todas las dispensaciones de ADN esperadas en cada uno de los pozos se escriben en la hoja de lista de ADN. La lista de pozos transpirados por ADN se utiliza para escribir la hoja TR-picklist utilizando el volumen de reactivo de transfección indicado en la hoja de plantilla. Los volúmenes calculados en la hoja de placa de origen se transfieren a la hoja guía de pipeteo de 384 pocillos. Los datos de la lista de selección de ADN, la lista de selección TR y la guía de pipeteo de 384 podeos se utilizan para generar los archivos correspondientes en el formato *.csv.

Dispensación adecuada de ADN y TR en la placa de origen

Como la dispensación en una placa de origen de 384 pocillos y, más específicamente, localizar el pozo objetivo puede promover errores y, además, consume mucho tiempo, hemos desarrollado una aplicación dedicada basada en tabletas similar a iPipet21. A diferencia de iPipet, el que se describe aquí se puede utilizar con Android (sólo se admite la versión 4.4 y anterior de Android). Basado en el archivo 384-Wells-Pipetting-Guide.csv generado por la hoja de cálculo de macro, ayuda al usuario en el proceso de dosificación general. Mientras que su uso para algunas dispensaciones no vale la pena, puede ser interesante ahorrar tiempo y evitar errores si se espera un gran número de dispensaciones de ADN y TR. El archivo .csv debe contener información sobre pozos, placas, nombres, concentración y volúmenes. Esta aplicación podría ser utilizada para otras aplicaciones, tales como soluciones de dosificación (reactivos, tinte, compuesto, etc.) en el pozo de destino, de acuerdo con un archivo csv dedicado por el usuario. Además, permite al usuario iluminar una fila o línea completa introduciendo la información relevante en la columna de pozo de destino utilizando este formato esperado: Row_1 (a 24) o Line_A (a P).

Solución de problemas de eficiencia deficiente de transfección celular

Varios parámetros descritos a continuación pueden afectar a la transfección celular en el protocolo basado en ADE descrito y tendrían que ser revisados y eludidos individualmente en caso de problemas de eficiencia.

Uno de los primeros parámetros importantes para la transfección es la calidad de las células y la densidad utilizada durante la siembra. Aunque cada tipo de celda requerirá diferentes parámetros, algunos de ellos deben respetarse para garantizar una transfección correcta. En primer lugar, la suspensión celular debe prepararse extemporáneamente desde una placa de subconfluentes para evitar el estrés celular antes de la transfección, y no deben dejarse acostados en el banco durante demasiado tiempo (2 h máximo). En segundo lugar, la densidad de sembración de las células debe ser lo suficientemente baja por dos razones: para evitar contactos celulares y promover una superficie celular alta una vez disecida, pero también porque las células que dividen activamente mejor toman ácido nucleico extraño22,23. Desafortunadamente, la densidad celular óptima para la transfección varía dependiendo de los tipos de células y la tecnología de transfección y debe determinarse para cada línea celular. Estos son parámetros cruciales para garantizar una transfección eficaz.

Otro parámetro importante que puede modular la eficiencia de la transfección es el número de paso de celda24. De hecho, las células en el cultivo se someten continuamente a la evolución debido a la competencia y la selección natural. Es bien sabido que la expresión génica diferencial entre los números de paso celular bajo y alto se espera en la mayoría de las líneas celulares debido a la desdiferenciación a medida que aumenta el número de pasaje. Después de este fenómeno, la eficiencia de la transfección también puede verse afectada. Sin embargo, se ha demostrado que los efectos relacionados con el pasaje dependen en gran medida de la línea celular y de las condiciones de cultivo. Además de eso, lo que se considera un nivel de paso "alto" varía de una línea de celda a otra. Esto significa que el rango de números de paso bajo el cual se puede realizar un conjunto de experimentos de forma confiable debe determinarse para cada línea de celda dada.

Otro parámetro que mejora la dificultad para determinar las mejores condiciones para la transfección es que la composición media de cultivo también desempeña un papel crucial, ya que la presencia de suero y/o antibióticos modulan la eficiencia de la transfección. De hecho, la mayoría de los protocolos comerciales recomiendan el uso de un medio libre de suero durante la etapa de transfección para mejorar la eficiencia o eludir los problemas de mala eficiencia3,25,26,27. Sin embargo, este parámetro es de hecho más complejo de aprehender, ya que se ha demostrado que, para una línea celular determinada, los pasajes temprano sin retrasos pueden mejorar o disminuir la eficiencia dependiendo de la presencia o ausencia de suero en el medio de cultivo28. Otros investigadores preconizan el uso de un medio libre de antibióticos para el paso antes de la transfección al cultivar células, con el fin de obtener células de alta calidad para la transfección29. Para concluir, al optimizar las condiciones de transfección para un tipo de célula determinado, cada uno de estos parámetros debe ser probado: células de paso temprano o tardío y el uso de medio con o sin suero durante el último pasaje antes de cosechar las células y / o durante el paso de transfección en sí.

Durante la optimización del protocolo presentado aquí, se utilizaron dos tipos de reactivo: un reactivo liposomal que forma complejos liposomas y reactivo lipopolyplex, un compuesto polimérico no liposomal1. Mientras que tuvimos éxito durante años transfecficar manualmente las células de HeLa con la primera, se observó una eficiencia de transfección deficiente en el protocolo automatizado actual. Esto probablemente se debió a un paso de vórtice requerido al mezclar ADN con reactivo de transfección que no se puede realizar en el formato de placa de 384 pocillos. El lipopolyplex no necesita tal paso y, por lo tanto, condujo a mayores eficiencias de transfección en todos los ajustes probados. Aunque esto no se ha confirmado en el estudio actual, evitar los reactivos de transfección que requieren un paso de mezcla físico tal que tiene pipeteo o vórtice probablemente conducirá a mejores resultados.

También recomendamos el uso de un reactivo de transfección compatible con la transfección inversa, ya que el protocolo presentado se basa en una transfección inversa. Algunas células son conocidas por ser difíciles de transfectar y algunos compuestos químicos dedicados se desarrollan para promover una mayor eficiencia de transfección30,31. Si se trata de transfectar células difíciles de transfectar, recomendamos probar los reactivos de transfección dedicados al tipo de célula o a la línea celular dados, suponiendo que la transfección inversa sea factible con estos.

Varios parámetros detallados en los párrafos subyacentes pueden tener un impacto y perjudicar un poco el proceso de dosificación de ADE, posiblemente arruinando el experimento final.

El nanodispensador fue desarrollado para dispensar gotas de 2,5 nL de pozos de origen llenos de 3-12 l de tampón acuoso (es decir, 9 l de volumen de trabajo). El dispositivo de nanodispensador utilizado en este estudio integra una tecnología de análisis dinámico de fluidos para la determinación de la composición del fluido y la altura del líquido en la placa de origen con el fin de controlar la potencia necesaria para expulsar 2,5 nL gotas19. Mientras se llena la placa de origen manualmente o se utiliza un manipulador de líquido peristáltico clásico, los volúmenes a menudo no son tan precisos que los determinados por el análisis dinámico de fluidos. Este es un punto crucial a tener en cuenta, ya que el dispositivo no es capaz de prescindir de los pozos de origen cargados con más de 12 l. Por lo tanto, su presencia comprometería el experimento. Por supuesto, se puede generar una lista de las dispensaciones realizadas al final del programa, pero esto requiere que el usuario ajuste los volúmenes y ejecute un programa para recuperar las dispensaciones perdidas solamente. Para evitar estos desacuerdos, se recomienda realizar una "encuesta" una vez que se hayan cargado los plásmidos de ADN para verificar el volumen esperado en cada pozo en cuestión.

Un parámetro crucial para la eyección de gotas es la variación en la tensión de superficie líquida17,32. Las soluciones de ADN de agua son conocidas por su viscosidad; esto podría afectar el proceso de dispensación por parte de ADE. Mientras que los parámetros físicos no se determinaron en nuestro estudio anterior1, mayores concentraciones de solución de ADN en la placa fuente dieron lugar a una menor eficiencia de transfección, incluso para la misma cantidad total de ADN dispensado, probablemente debido a esto Fenómeno. Por lo tanto, se recomienda el uso de una dilución de plásmido de 100 ng / L para obtener mejores resultados, aunque otras concentraciones podrían ser probadas para la comodidad del usuario. Para garantizar un ADE adecuado con la concentración de ADN necesaria por el usuario, se puede añadir un tinte a la solución para controlar la eyección de gotas en los pozos o, mejor aún, en la tapa de la placa. Como el primer objetivo del protocolo presentado era obtener un alto rendimiento, se utilizaron kits de minipreparación de ADN de plásmido baratos basados en minicolumnas compatibles con protocolos de purificación de plásmido de alto rendimiento basados en placas. Mientras que funcionó correctamente durante la realización del experimento, en caso de baja eficiencia y mala viabilidad celular después de la transfección, se recomienda utilizar métodos de purificación de ADN de mayor grado como preparaciones midi- o maxi o incluso libres de endotoxinas kits disponibles comercialmente que garantizarían una mejor pureza del ADN y menor toxicidad para las células33.

Solución de problemas de transfección celular inhomogénea sobre la superficie del pozo

Los primeros intentos al configurar el protocolo llevaron a la transfección celular sólo en el centro de los pozos, donde las caídas fueron enviadas por ADE. De hecho, notamos que el ADN y la mezcla de transfección no se extendían por toda la superficie del pozo y se sesecaban antes de la adición celular debido a los bajos volúmenes dispensados (apenas 500 nL). Para evitar este problema, se añadió un paso de dosificación diluyente para permitir que la mezcla DE ADN/TR se extendiera por todos los pozos antes de la adición celular. Esto dio lugar a una transfección celular homogénea en el pozo. Por lo tanto, al reproducir el experimento y la mezcla DE ADN/TR no se extiende por todos los pozos, el volumen diluyente puede ajustarse de acuerdo con las necesidades del usuario.

Como el manipulador de líquidos acústicos puede distribuir volúmenes en el rango de nanolitros, el método descrito potencialmente no tiene ninguna limitación técnica. Sin embargo, notamos que los pozos rellenos de solución acuosa están sujetos a evaporación, lo que podría representar una limitación. Si los volúmenes exactos a dispensar se reducen por esta evaporación, la nanodispensación no se realizará hasta el final esperado. En este caso, el nanodispensador genera un informe de error. Para evitar este problema, utilice volúmenes más altos de lo esperado mientras se mantiene en el rango superior aceptable (de hecho, inferior a 12 l). Sin embargo, si la evaporación conduce al deterioro de algunas dispensaciones, el nanodispensador genera un informe de error. Este archivo se puede utilizar para rellenar la placa de origen con un nuevo reactivo que se dispensará en los pozos de destino en cuestión. Hacer esto en un corto intervalo de tiempo no parecía afectar la eficiencia de la transfección.

El protocolo descrito aquí es el primero en obtener dicho rendimiento para transfecciones de plásmido de ADN independientes. Las mejores tarifas alcanzadas antes eran para 288 condiciones diferentes que requerían habilidades altamente especializadas para ser realizadas simultáneamente15. Esto, aparte de su alto rendimiento, el protocolo actual tiene otras ventajas significativas ya que el proceso general ha sido optimizado para permitir su uso por los no especialistas y se han desarrollado herramientas para evitar errores, a saber, i) una macro de hoja de cálculo dedicada que permite el diseño fácil de la plantilla experimental, ii) la generación automática de la plantilla de placa(s) de reactivo de ADN y transfección correspondiente por esta macro, iii) la generación de dos archivos listos para usar para controlar las dispensaciones de ADN impulsadas por software y reactivo de transfección por el dispositivo de nanodispensador, y iv) la exportación de un archivo "guía de pipeteo de 384 pocillos" correspondiente a la placa o placas de origen diseñadas, que se utilizarán en una aplicación específica basada en tabletas también desarrollada con el fin de evitar errores humanos mientras dispensación en la(s) placa(s) de fuente de 384 pocillos.

Futuras mejoras del protocolo

Con el fin de mejorar el rendimiento y la reproducibilidad, la placa de origen llena de plásmidos podría almacenarse a 4 oC o congelarse como de costumbre para las soluciones de stock de ADN. Además, mostramos que la placa de destino precargada precargada con ADN también se puede almacenar seca o congelada durante al menos 7 días antes de añadir el reactivo de transfección y las células, lo que conduce a la mejora del rendimiento general y la facilidad del protocolo. La conservación del ADN desde hace más de 4 años se ha informado previamente utilizando medios optimizados34 y, por lo tanto, debe ser probado en el contexto de este protocolo, ya que lo impulsará un paso más, permitiendo el almacenamiento a largo plazo de placas precargadas con bancos de plásmidos y listos para usar en experimentos de transfección.

Anteriormente mostramos que las condiciones óptimas de transfección identificadas podían transferirse a experimentos de mayor escala, de 96 polos a 10 cm de platos de cultivo1, calculando la cantidad de ADN, el volumen de reactivos de transfección y la densidad celular que debería se utilice n.o del protocolo optimizado de placas de 384 pocillos. Como la dosificación de placas de 1536 pocillos también es manejable por el nanodispensador, el protocolo también se puede realizar a una escala inferior, mejorando así su rendimiento. Sin embargo, una limitación importante para alcanzar este formato es la capacidad de dispensar celdas y administrar la lectura final en un formato miniaturizado. La dosificación de celdas por ADE ya se ha realizado con éxito en el formato de placa de 1536 pocillos35 utilizando una solución de densidad neutra que impedía la sembración de células y garantizaba la densidad de celdas igual en el tiempo. Según el número de celda utilizado aquí y la relación de superficie de 384 (0,056 cm2) frente a 1536 pozos (0,025 cm2),500-650 celdas se dispensado en este último formato. Se ha demostrado que este rango de números de dispensación de células es altamente confiable si se utiliza una solución concentrada de densidad neutra del 14%-18%. Bajo estos ajustes, 100 nL de suspensión celular se distribuirían en 1536 pozos. Con una solución de trabajo de 5-8 l en estos pozos, la adición de 5-8 l de medio de cultivo utilizando manipuladores de líquidos peristálticos clásicos diluiría la solución de antiseeding a menos del 0,3%, permitiendo así una sembrado celular adecuado. Por lo tanto, la transfección de células a una escala tan baja parece técnicamente posible; sin embargo, el efecto de la concentración residual de la solución de densidad neutra en la eficiencia de la transfección sigue estando por determinar mediante trabajos ulteriores.

El uso de tipos de placas de origen con volúmenes de trabajo más altos para dispensar células, como placas de origen de polipropileno de 384 pocillos con un volumen de trabajo de 45 l, permitiría dispensaciones de solución celular de 100 nL de sólo cuatro pozos de origen para una placa de 1536 pocillos en general. Además, los nuevos nanodispensadores son capaces de dispensar gotas de 25 nL en lugar de los 2,5 nL que se utilizaron en este protocolo. Este tamaño de gota, entonces, divide 10 veces el tiempo de dosificación, pero implica utilizar múltiples volúmenes de 25 nL que, sin embargo, permanecen compatibles con los diferentes volúmenes dispensados en el protocolo presentado aquí.

Sobre la base de estos últimos trabajos y mejoras tecnológicas, un paso de dosificación de células ADE adicional para lograr una transfección de placas de 1536 pocillos podría añadirse fácilmente al protocolo actual. Sin embargo, alcanzar tales miniaturizaciones sólo vale la pena si el bioensayo es concomitantemente factible en un formato tan miniaturizado.

En conclusión, desarrollamos un método de transfección fácil, de alto rendimiento y preciso que tiene varias ventajas debido a la miniaturización: (1) reducir los costos del reactivo de transfección; 2) reducir los residuos de los preparados de ADN; (3) asegurando que incluso los principiantes pueden realizar con éxito la transfección celular. De hecho, sólo requiere unos pocos pasos manuales fáciles, a saber, diluir el ADN a 100 ng /L, dispensarlo en una placa de origen (un plásmido/bien) de acuerdo con la plantilla generada por la hoja de cálculo y utilizando la guía de pipeteo basada en tabletas, y preparar la suspensión celular antes de la sembración. El nanodispensador basado en ADE está a cargo de la entrega de dosis y multiplexación de los plásmidos, que consumen mucho tiempo y son propensas a errores, de acuerdo con la plantilla dada del experimento.

Además, mientras que este protocolo podría garantizar la mayoría de las intenciones biológicas básicas de los experimentos clásicos de transfección, también podría abrir nuevas formas para los experimentos basados en arreglos de discos. Por ejemplo, expresar o derribar cada gen de codificación de proteínas humanas de la colección humana ORFeome36 o enfoques basados en bibliotecas CRISPR-Cas937, respectivamente, requeriría menos de 24 horas en una plataforma automatizada dedicada (53 x 384- bien), en lugar de 2-3 días de trabajo humano, asumiendo el uso de un banco de placas precargado de ADN. Debido a su alta eficiencia y rendimiento de alto rendimiento, el protocolo presentado aquí podría incluso ser capaz de lograr nuevos enfoques no agrupados para los estudios basados en CRISPR-Cas9 con bibliotecas de ARNG/plásmidos de expresión de CRISPR-Cas9. De hecho, los cambios leves en el fenotipo celular, que actualmente no pueden permitir el paso de clasificación celular requerido, serían finalmente manejables, ya que uno bien representaría un gen golpeado.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores revelaron un recibo del siguiente apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo: Inserm, Lille University, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, y PRIM-HCV1 y 2 (Péle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), el Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) y la Comunidad Europea (ERC-STG INTRACELLTB no 260901). Los autores desean dar las gracias al Dr. S. Moureu, al Dr. B. Villemagne, al Dr. R. Ferru-Clément y al Dr. H. Groult por su revisión crítica y correcciones del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

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References

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Retracción Número 150 eyección de gotas acústicas alto rendimiento transfección plásmido de ADN células de mamíferos manipulación de líquidos proteína fluorescente
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